甘草提取物的有效部位誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株凋亡及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

王吉錫 鄧偉生 王鳳儒 史之茂 孟 丹 徐 強(qiáng) 張玉瑤

甘草提取物的有效部位誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株凋亡及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響

王吉錫 鄧偉生 王鳳儒 史之茂 孟 丹 徐 強(qiáng) 張玉瑤

目的研究甘草提取物的有效部位(GL)體外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡情況及對(duì)Caspase家族蛋白表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)一步闡明GL的抑癌機(jī)制。方法將25 μg/mL的GL作用于HeLa細(xì)胞24 h后，采取MTT比色法，吖啶橙/溴乙錠熒光雙染法，透射電子顯微鏡法，觀察GL誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡情況，并采用Western blot法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，GL可以有效抑制HeLa細(xì)胞的增殖，呈劑量-時(shí)間相關(guān)性。AO/EB雙染色及透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)GL作用HeLa細(xì)胞24 h后，可見(jiàn)大量早期凋亡細(xì)胞。Western blot測(cè)定結(jié)果顯示，藥物組Pro-caspase-9蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組。結(jié)論GL能夠促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9酶原活化，具有體外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用。

甘草；抗腫瘤作用；細(xì)胞凋亡；HeLa細(xì)胞；凋亡蛋白

惡性腫瘤是人類因疾病致死的第一因素[1]。而宮頸癌更是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居?jì)D科惡性腫瘤第二位，嚴(yán)重影響和侵害女性的身心健康[2]。目前從中草藥中提取有效成分治療腫瘤正成為研究熱點(diǎn)，研究天然植物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，目前已取得了一定的進(jìn)展[3]。并且根據(jù)腫瘤的發(fā)病機(jī)制，探尋新的藥物作用靶點(diǎn)[4]。本研究從天然植物藥甘草根中提取物的有效部位(GL)，作用到人宮頸癌HeLa細(xì)胞中，判定該活性成分的抗癌效果及相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。為甘草抗腫瘤活性成分的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為中草藥抗腫瘤作用的開發(fā)和研究提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western blot及IP細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Caspase-3、Caspase-9兔抗人抗體(武漢博士德生物公司)；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(杭州賢至生物科技公司)；蛋白Marker(美國(guó)GIBCO公司)。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液濃度比例為含5%胎牛血清，1%雙抗的MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為36.5℃，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；消化細(xì)胞過(guò)程加入0.25%胰蛋白酶，溫箱中消化2 min。每天鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，適時(shí)更換培養(yǎng)液及傳代細(xì)胞。

1.3 GL的提取

將甘草粉以1 g∶20 mL溶解于蒸餾水中，攪動(dòng)搖勻，浸泡過(guò)夜后，超聲波振1 h，低溫離心15 min(4℃，4 000 r/min)，去上清，收集沉淀物；干燥后，以1 g∶10 mL比例與丙酮溶液混合，攪動(dòng)搖勻，浸泡過(guò)夜，使之充分混合，低溫離心15 min(4℃，4 000 r/min)，收集上清液；經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，鼓風(fēng)干燥烘干，再經(jīng)甲醇溶解，低溫離心15 min(4℃，4 000 r/min)，得到GL，提取率為2.4%。

1.4 MTT比色法檢測(cè)GL對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用情況

將1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按照100 μL/孔加入96孔板，溫孵24 h。加入甘草提取物GL的量依次為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每孔100 μL。并設(shè)立順鉑藥物陽(yáng)性對(duì)照組、溶媒陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組。培養(yǎng)12 h、24 h和48 h。加入0.5 mg/mL的MTT，每孔200 μL，繼續(xù)孵育4 h。觀察到藍(lán)紫色沉淀形成后，棄掉MTT溶液，加入200 μL DMSO，振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.5 AO/EB雙染色法檢測(cè)GL誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡情況

將1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按照2 mL/孔的液體量，加入6孔板，溫孵24 h。加入提取物GL的濃度為25 μg/mL，每孔2 mL，同時(shí)設(shè)立溶媒對(duì)照組和順鉑藥物陽(yáng)性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1.0×106個(gè)/mL，取90 μL，加入AO/EB染液5 μL，濃度100 μg/mL，染色10 min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況。

1.6 透射電子顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞平行傳代分組。GL給藥濃度25 μg/mL，另設(shè)溶媒陰性對(duì)照組，培養(yǎng)24 h。1 500 r/min離心5 min，PBS清洗，收集細(xì)胞。再經(jīng)常規(guī)過(guò)程：固定、脫水、包埋、切片。透射電子顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)情況

冰上操作，提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。制膠：分離膠-15%；積層膠-5%。取100 μg的上樣蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水2 min，進(jìn)行蛋白質(zhì)變性。電泳緩沖液沖洗加樣孔，兔抗人GAPDH多克隆抗體作為內(nèi)參，各加樣孔依次加入蛋白Marker(3 μL)和處理過(guò)的樣品蛋白，設(shè)定70 V積層膠電泳電壓，120 V分離膠電泳電壓，恒壓電泳；溴酚藍(lán)達(dá)凝膠下緣0.5 cm時(shí)，停止電泳。依據(jù)蛋白Marker，獲取目標(biāo)蛋白凝膠片斷。處理PVDF膜，目標(biāo)蛋白Caspase-3用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜55 min；Caspase-9和GAPDH用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜65 min，4℃轉(zhuǎn)膜。阻斷非特異性結(jié)合蛋白，使用TBST液清洗膜3次，每次10 min；置于1%的BSA封閉液中，37℃，1.5 h。加入一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜；使用TBST液清洗膜3次，每次10 min。加入二抗，37℃，孵育1 h。一抗稀釋濃度(Caspase-3、Caspase-9抗體均為1∶200稀釋；GAPDH抗體用1∶1 000稀釋)，二抗稀釋濃度(山羊抗兔二抗用1∶1 000稀釋)。使用TBST液和TBS液各清洗膜3次，每次10 min；加入顯色液，顯現(xiàn)條帶后，去離子水沖洗終止顯色。應(yīng)用雙色紅外激光成像系統(tǒng)，掃描記錄目標(biāo)蛋白條帶的灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析；重復(fù)測(cè)量資料數(shù)據(jù)做重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測(cè)GL對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果

在同一作用時(shí)間內(nèi)，隨GL的作用濃度增加，其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)；當(dāng)在同一作用濃度下，抑制作用的效果隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)?？梢钥闯鯣L對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制作用具有劑量-時(shí)間依賴性，隨著作用濃度的增高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯，其抑制率與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度GL作用HeLa細(xì)胞12、24、48 h的增殖抑制率Figure 1 Cell proliferating curves of HeLa cell treated with GL for 12，24 and 48 hours

2.2 AO/EB雙染色法檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡結(jié)果

從AO/EB雙熒光染色照片來(lái)看，溶媒對(duì)照組(圖2C)HeLa細(xì)胞顯示正常細(xì)胞染色情況，表現(xiàn)為AO將細(xì)胞核染色質(zhì)染成綠色-黃色熒光，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。25 μg/mL的GL作用組(圖2B)HeLa細(xì)胞表現(xiàn)為早期細(xì)胞凋亡為主的特征，凋亡的HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)均勻增強(qiáng)的熒光綠色，也有核染色質(zhì)被EB染色呈橙黃色的結(jié)果，并可見(jiàn)核固縮的情況。DDP對(duì)照組(圖2A)可見(jiàn)核被EB染色呈橙黃或橙紅色，結(jié)構(gòu)不清，邊緣模糊；呈細(xì)胞凋亡晚期狀態(tài)，并可見(jiàn)壞死細(xì)胞。

圖2 經(jīng)AO/EB熒光雙染后，各組HeLa細(xì)胞凋亡染色表達(dá)情況(10×)Figure 2 Morphological changes of HeLa cells stained by AO/EB dyes(10×)Note：A.DDP group；B.GL group；C.Control group.

2.3 透射電鏡觀察HeLa細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化結(jié)果

從電鏡照片的結(jié)果看，溶媒對(duì)照組(圖3B)細(xì)胞呈HeLa細(xì)胞正常形態(tài)，圓形居多，呈不規(guī)則形狀；核膜完整，核仁清晰；細(xì)胞器正常完整，可見(jiàn)線粒體嵴及微絨毛。25 μg/mL的GL作用組(圖3A)的HeLa細(xì)胞超微形態(tài)與溶媒對(duì)照組有明顯不同，可見(jiàn)凋亡小體形成。其中，部分HeLa細(xì)胞的核仁消失，核染色質(zhì)邊緣聚集；胞漿內(nèi)見(jiàn)空泡，細(xì)胞膜破裂，胞漿溢出等改變。

2.4 Western blot測(cè)定HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)水平結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)藥物GL分為兩個(gè)作用濃度組，分別為25 μg/mL和50 μg/mL，同時(shí)設(shè)立溶媒對(duì)照組，給藥作用時(shí)間為24 h。檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)Caspase-9蛋白表達(dá)條帶結(jié)果，檢測(cè)到了Caspase-9裂解后的活性片段Cleaved-caspase-9條帶，表明了Capase-9酶原的裂解活化，Pro-caspase-9蛋白表達(dá)量降低，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)Caspase-3蛋白的檢測(cè)結(jié)果，可以看到三條條帶。表明Caspase-3已活化，Pro-caspase-3蛋白37 kD被剪切活化成19 kD和17 kD的兩個(gè)小蛋白發(fā)揮作用。Caspase-3的活化，表明細(xì)胞凋亡將不可避免的繼續(xù)。Cleaved-caspase-3的表達(dá)量增加(圖4，圖5)。

圖3 GL作用24 h后，透射電子顯微鏡下HeLa細(xì)胞的凋亡形態(tài)改變 Figure 3 Morphological changes of GL-treated and control cells by transmission electron microscopyNote：A.GL group；B.Control group.

圖4 不同濃度GL作用HeLa細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況Figure 4 The expression of Caspase-9 and Caspase-3 protein in HeLa cells treated with different concentration of GL

圖5 不同濃度GL作用HeLa細(xì)胞后，蛋白Caspase-9、Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量Figure 5 The statistical analysis of caspase-9 and caspase-3 protein expression in HeLa cells

3 討論

MTT比色法能夠精確、簡(jiǎn)便且自動(dòng)的檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，是檢測(cè)活細(xì)胞的一種方法[5]，目前主要應(yīng)用于篩選抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)中[6-7]。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，GL藥物具有作用濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制HeLa細(xì)胞的作用越明顯的特點(diǎn)，抑制作用具有劑量-時(shí)間依賴性。

經(jīng)AO/EB雙染色可以看到GL干預(yù)HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)出了凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化，證實(shí)了GL能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。透射電鏡可以直接觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)的變化[8]，細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)在細(xì)胞核的變化。透射電鏡的觀察結(jié)果可以確定了GL對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，解釋了GL可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)展。本研究可以為下一步的凋亡機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

大量研究已經(jīng)證實(shí)，抗腫瘤藥物的作用可以干擾細(xì)胞線粒體的功能及結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C的釋放等改變，誘發(fā)凋亡的發(fā)生發(fā)展[9]。因此，藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與信號(hào)通路內(nèi)源性激活途徑相關(guān)[10]。而本研究主要探討了GL誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase內(nèi)源性激活途徑的信號(hào)通路。根據(jù)Western blot結(jié)果，從Caspase家族蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況看，Pro-caspase-9蛋白表達(dá)量略低于正常對(duì)照組，而Cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)量增高，表示細(xì)胞凋亡的發(fā)生；同樣可以得出HeLa細(xì)胞隨著藥物的作用，Cleaved-caspase-3的表達(dá)增加，隨之細(xì)胞凋亡也增多。而同時(shí)剪切前的Casepase-3表達(dá)量是逐漸減少的。

當(dāng)Caspase-9蛋白活化后，可以激活Caspase-3蛋白，它們之間存在上、下游的關(guān)系[11-12]。GL可以通過(guò)加速Caspase-9和Caspase-3的裂解，從而激活Caspase的上、下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。考慮藥物GL作用到HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞在應(yīng)激、受到細(xì)胞毒或化療藥物作用時(shí)[13]，細(xì)胞受到凋亡刺激，導(dǎo)致線粒體去極化及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，其開放后使線粒體發(fā)生腫脹、外膜破壞、線粒體損傷，釋放出細(xì)胞色素C及其他促凋亡物質(zhì)，Caspase的內(nèi)源性激活途徑由此開始[14-15]。

本次研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有利于指導(dǎo)今后甘草抗腫瘤活性成分單體的實(shí)驗(yàn)研究，并為進(jìn)一步研究甘草提取物對(duì)宮頸癌的治療機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Parkin DM.The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002[J].Int J Cancer，2006，118(12)：3030-3044.

2 Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65(2)：87-108.

3 Chen W，Zheng R，Zhang S，et al.The incidences and mortalities of major cancers in China，2009[J].Chin J Cancer，2013，32(3)：106-112.

4 Yeh CF，Wang KC，Chiang LC，et al.Water extract of licorice had anti-viral activity against human respiratory syncytial virus in human respiratory tract cell lines[J].J Ethnopharmacol，2013，148(2)：466-473.

5 Sgonc R，Wick G.Methods for the detection of apoptosis[J].Int Arch Allergy Immunol，1994，105(4)：327-332.

6 Hengartner MO.Apoptosis：corralling the corpses[J].Cell，2001，104(3)：43-56.

7 李桂玲，夏晴，陳松華，等.掌葉半夏提取物的有效部位對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HPVE6和P53基因表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(1)：110-113.

8 Evan GI，Vousden KH.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer[J].Nature，2001，411(6835)：342-348.

9 Seon MR，Park SY，Kwon SJ，et al.Hexane/ethanol extract of Glycyrrhiza uralensis and its active compound isoangustone A induce G1 cycle arrest in DU145 human prostate and 4T1 murine mammary cancer cells[J].J Nutr Biochem，2012，23(1)：85-92.

10 Telford WG，King LE，F(xiàn)raker PJ.Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry[J].Cytometry，1992，13(2)：137-143.

11 Fadok VA，Voelker DR，Campbell PA，et al.Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages[J].J Immunol，1992，148(7)：2207-2216.

12 盛磊，武貴臻，胡爾西旦·尼牙孜，等.維吾爾族宮頸癌患者Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平及臨床意義[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2016，30(5)：91-95.

13 Williams GT，Smith CA.Molecular regulation of apoptosis：genetic controls on cell death[J].Cell，1993，74(5)：777-779.

14 Feng Yeh C，Wang KC，Chiang LC，et al.Water extract of licorice had anti-viral activity against human respiratory syncytial virus in human respiratory tract cell lines[J].J Ethnopharmacol，2013，148(2)：466-473.

15 楊毅，丁妍，于愛(ài)清，等.自噬對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2016，30(6)：81-86.

ActivepartofGlycyrrhizaextractinducesapoptosisinhumancervicalcancerHeLacellsanditsrelatedproteincaspase-3andcaspase-9expression

WANGJixi，DENGWeisheng，WANGFengru，SHIZhimao，MENGDan，XUQiang，ZHANGYuyao

Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

ObjectiveThe aim of this study was to determine whether active part of Glycyrrhiza extract(GL)induced apoptosis in Hela cells and its inhibitory mechanism.MethodsHeLa cells were treated with 25 g/mL of GL for 24hs.Cell viability and apoptosis in HeLa cells were determined by MTT，AO/EB fluorescent double staining，transmission electron microscope(TEM)，and Western blot.ResultsThe MTT results showed that GL significantly inhibited the proliferation of HeLa cells in a dose-response.After treatment for 24 hrs，large number of early apoptotitc cell were observed using AO/EB fluorescent double staining and TEM.The expression of Pro-caspase-9 and Cleaved-caspase-3 protein was higher in GL-treated cells them those of the control cells(P<0.05).ConclusionGL can activate Caspase-3 and Caspase-9 genes to induce apoptosis in HeLa cells.

Licorice；Anti-tumor effect；Apoptosis；HeLa cells；Apoptosis protein

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541764)

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(哈爾濱 150040)

王吉錫，男，(1979-)，博士，副教授，從事中草藥抗腫瘤作用的研究。

王鳳儒，E-mail：wangfengrurr@163.com

R737.33

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.002

(收稿：2017-02-09)