杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響

蘇立寧，魏會(huì)平，余秀娟，李繼紅，宋小青，朱登祥

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

來稿日期：2017-03-09

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項(xiàng)目(No：Z2015047)；張家口市科學(xué)技術(shù)與地震局研究指導(dǎo)項(xiàng)目(No：1521001A)

蘇立寧(1983-)，女，河北衡水人，碩士，講師，主要研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。

魏會(huì)平(1966-)，女，教授，主要研究方向：細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)。

杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響

蘇立寧，魏會(huì)平，余秀娟，李繼紅，宋小青，朱登祥

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

目的觀察杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的抑制作用。方法體外實(shí)驗(yàn)中，將不同質(zhì)量濃度的杠柳毒苷作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，MTT法檢測(cè)其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；DAPI熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化；流式細(xì)胞術(shù)分析給藥后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化情況；Western blot法檢測(cè)給藥后周期蛋白依賴激酶抑制劑P27的表達(dá)量。結(jié)果杠柳毒苷可以顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用也隨之加強(qiáng)。結(jié)論不同濃度的杠柳毒苷可顯著促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，在抑制細(xì)胞增殖的過程中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27的表達(dá)量顯著升高。

杠柳毒苷；神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；P27

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，復(fù)發(fā)率、致死率高，目前臨床多采用手術(shù)和放化療等手段治療，預(yù)后較差。杠柳毒苷是中藥香加皮的抗腫瘤活性成分之一。近年來，人們先后發(fā)現(xiàn)杠柳毒苷能有效抑制人乳腺癌BT-549和MDA-MB-468細(xì)胞株，人食管癌TE-13、Eca-109、TE-1和TE-10細(xì)胞株，人肝癌SMMC-7721、HA22T/VGH和HepG2細(xì)胞株，人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，人肺癌A549和QG56細(xì)胞株的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[1-9]。本研究觀察杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，以期為杠柳毒苷抗腫瘤特性的深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞及儀器

杠柳毒苷(成都指標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)，無血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成200 mg·L-1，過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；神?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞系購(gòu)于中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(Spectra Max，美國(guó)分子儀器有限公司);FACSAria流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);ECLIPSE TiU熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司);310系列CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(10%胎牛血清，0.03 mg·mL-1青霉素，0.05 mg·mL-1鏈霉素，pH 7.2～7.4)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)。

1.3 MTT細(xì)胞增殖毒性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基，設(shè)5個(gè)復(fù)孔；實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL杠柳毒苷終濃度為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、150.0 ng·mL-1的無血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥24、48、72 h后，吸棄各孔溶液，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 20 μL，孵育4 h后，棄去MTT液，各孔再加入150 μL的DMSO溶液，搖床振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)]×100%。

1.4 觀察杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔1×105細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入杠柳毒苷終濃度為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 ng·mL-1的無血清培養(yǎng)基10 μL，對(duì)照組加入10 μL無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后小心吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，1 mL多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，0.2%TrionX-100透化30 min，PBS沖洗3次。按照DAPI熒光試劑盒操作說明進(jìn)行活細(xì)胞染色，熒光顯微鏡下(400×)觀察各組細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種在6孔板中，過夜貼壁后，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為10.0、20.0、30.0、40.0 ng·mL-1的杠柳毒苷，培養(yǎng)24 h，按CCAA kit/PI檢測(cè)試劑盒規(guī)定的方法進(jìn)行操作，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種在6孔板中，過夜貼壁后，分別加入終濃度為10.0、20.0、30.0、40.0 ng·mL-1的杠柳毒苷，培養(yǎng)24 h，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒規(guī)定的方法進(jìn)行操作，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑P27的表達(dá)量

將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種培養(yǎng)瓶中，過夜貼壁后，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10.0、20.0、30.0、40.0 ng·mL-1的杠柳毒苷，培養(yǎng)24 h，按Western blot規(guī)定方法檢測(cè)各組中P27蛋白表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也得以提高。同一藥物濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，杠柳毒苷對(duì)細(xì)胞的抑制率也隨之增加(圖1)。

圖1 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響(n=5)

2.2 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核形態(tài)的影響

對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，可見到處于細(xì)胞分裂中期的細(xì)胞，低濃度藥物(10.0 ng·mL-1)處理后細(xì)胞核較為正常，核形態(tài)規(guī)則，核質(zhì)均勻，未見明顯的染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。當(dāng)藥物濃度達(dá)到20.0 ng·mL-1，細(xì)胞中染色質(zhì)高度凝聚，且呈邊緣化趨勢(shì)(圖中箭頭所示)。隨著藥物濃度的逐漸升高，細(xì)胞核逐漸變大，最后出現(xiàn)裂解現(xiàn)象。

注：A：對(duì)照；B：10.0 ng·mL-1；C：20.0 ng·mL-1；D：30.0 ng·mL-1；E：40.0 ng·mL-1；F：50.0 ng·mL-1。

2.2.2 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)結(jié)果顯示，杠柳毒苷可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度的增加凋亡率升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1，圖3)。

注：A：對(duì)照；B：10.0 ng·mL-1；C：20.0 ng·mL-1；D：30.0 ng·mL-1；E：40.0 ng·mL-1。圖3 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

杠柳毒苷濃度(ng·mL-1)細(xì)胞凋亡率(%)對(duì)照組-4.59+0.13實(shí)驗(yàn)組10.06.49+0.22*▲20.010.06+0.16*▲30.011.28+0.23*▲40.012.36+0.19*▲

注：與對(duì)照組比較*P<0.05；不同濃度藥物比較▲P<0.05。

2.2.3 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

杠柳毒苷(20.0 ng·mL-1)作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞比例從(19.59+1.35)%上升到(23.77+1.69)%，G2期細(xì)胞比例從(31.92+1.53)%下降到(18.57+1.90)%，細(xì)胞周期發(fā)生明顯的S期阻滯(圖4)。

2.2.4 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P27蛋白表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，杠柳毒苷作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中P27蛋白表達(dá)量增加(圖5)。

注：A：對(duì)照組S期和G2期細(xì)胞比例；B：20.0 ng·mL-1藥物作用后S期和G2期細(xì)胞比例圖4 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

注：A：P27蛋白的Western結(jié)果；B：P27蛋白的Western定量結(jié)果。圖5 杠柳毒苷對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P27蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的杠柳毒苷可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越明顯，杠柳毒苷濃度在10.0～50.0 ng·mL-1時(shí)，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用與藥物濃度基本呈現(xiàn)正相關(guān)，所以后續(xù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，藥物作用濃度選定在10.0～50.0 ng·mL-1之間。

通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡率隨著杠柳毒苷濃度的升高而增加。不同濃度的杠柳毒苷作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，處于S期細(xì)胞的比例升高，細(xì)胞被阻滯在S期。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)杠柳毒苷作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中P27蛋白的表達(dá)量升高。P27蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制劑，可與多種CDK相互作用，調(diào)控細(xì)胞周期。研究發(fā)現(xiàn)P27可以與CDK2結(jié)合，降低CDK2的濃度，抑制細(xì)胞周期。CDK2主要在細(xì)胞周期的S期及G1晚期調(diào)控細(xì)胞的增殖[10]，S期主要通過啟動(dòng)DNA復(fù)制對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，因此當(dāng)P27蛋白與CKD2結(jié)合后導(dǎo)致其濃度下降，S期DNA的復(fù)制被阻滯，致使大量的細(xì)胞被阻滯在S期。

綜上，不同濃度的杠柳毒苷可顯著促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，并將細(xì)胞阻滯在S期，且在抑制細(xì)胞增殖的過程中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27表達(dá)量顯著升高。

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EffectofPeriplocinonProliferationandApoptosisofGliomaCells

SULi-ning,WEIHui-ping,YUXiu-juan,LIJi-hong,SONGXiao-qing,ZHUDeng-xiang

(Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

ObjectiveTo observe the effect of periplocin on proliferation and apoptosis of glioma cells.MethodsGlioma cells were treated by periplocin at different concentrations in vitro experiments.The inhibitory effects on the growth and proliferation of glioma cells were detected by MTT method.The morphological changes of cell nucleus were assayed by DAPI fluorescent staining.The apoptosis rate and the cell cycle of glioma cells induced by periplocin were examined by flow cytometry.The protein expression of cyclin-dependent kinase inhibitor P27 of glioma cells was detected by Western blot.ResultsThe experiment results suggested that periplocin had significant inhibitory effect on the growth and proliferation of glioma cells,and the inhibitory rate increased with the increasing concentration and prolonging reaction time.ConclusionPeriplocin at different concentrations can significantly promote the apoptosis of glioma cells and the protein expression of cyclin-dependent kinase inhibitor P27 increases markedly during the inhibition of proliferation.

periplocin;glioma cells;apoptosis;cell cycle;P27

R 285

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.10.001

[責(zé)任編輯：李薊龍英文編輯：劉彥哲]