和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍對糖尿病大鼠骨骼肌胰島素抵抗的影響

許光遠(yuǎn)，孫文，宋紫臨，郭璇，吳麗麗，秦靈靈，侯丹，張茁，田碩，李響，劉銅華

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和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍對糖尿病大鼠骨骼肌胰島素抵抗的影響

許光遠(yuǎn)1，2，孫文2，宋紫臨2，郭璇2，吳麗麗2，秦靈靈2，侯丹3，張茁3，田碩3，李響4，劉銅華2

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院，北京 100045；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046；4.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北邯鄲 056000

觀察和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍對糖尿病大鼠骨骼肌胰島素抵抗的影響，探討其作用機(jī)制。6～7周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、和于泰輔助降糖片組（降糖片組）、和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍組（聯(lián)合組），另選ZDF（fa/+）大鼠為正常組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)6周。檢測體質(zhì)量、空腹血糖（FBG）、三酰甘油、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、血清胰島素水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），并進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）；HE染色觀察骨骼肌病理變化；RT-PCR和Western blot分別檢測骨骼肌相應(yīng)基因和蛋白表達(dá)。與二甲雙胍組、降糖片組比較，聯(lián)合組大鼠TC、FFA、FBG水平及HOMA-IR顯著降低（＜0.05，＜0.01）；OGTT各時(shí)間點(diǎn)血糖水平及曲線下面積顯著降低（＜0.05，＜0.01）；HE染色肌纖維排列整齊，細(xì)胞核無增多及內(nèi)移，未見明顯炎細(xì)胞浸潤；骨骼肌胰島素受體（InsR）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；骨骼肌磷酸化InsR、磷酸化Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）。和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍能夠改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。

和于泰輔助降糖片；二甲雙胍；聯(lián)合應(yīng)用；PI3K/Akt信號(hào)通路；大鼠

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）作為2型糖尿病的主要發(fā)病基礎(chǔ)越來越受到研究者重視。骨骼肌是胰島素作用的主要外周靶組織，調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和利用，在IR發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的一線用藥，一方面可以提高胰島素敏感性而促進(jìn)骨骼肌、脂肪組織對外周葡萄糖的攝取、利用，達(dá)到降糖、改善IR作用，另一方面能夠抑制肝、腎過度的糖異生，促進(jìn)葡萄糖無氧代謝。但二甲雙胍單獨(dú)應(yīng)用往往療效不理想，并且會(huì)出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)、增加乳酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)[1]。和于泰輔助降糖片（苦瓜、桑葉、玉竹、三七、肉桂等提取物）是在臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代研究成果創(chuàng)制的，具有激活胰島β細(xì)胞、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、改善肝腎功能等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要成分苦瓜總皂苷[2-4]、桑葉總黃酮[5-6]、桂皮醛[7-8]、三七總皂苷[9]等有確切降糖、改善IR的作用。本研究采用自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型ZDF大鼠，觀察和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用改善ZDF大鼠骨骼肌IR的療效，并與單獨(dú)應(yīng)用相比較，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性自發(fā)性2型糖尿病模型ZDF（fa/fa）大鼠24只，6～7周齡，體質(zhì)量180～200 g；同周齡雄性ZDF（fa/+）大鼠6只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008飼料（蛋白質(zhì)26.85%、脂肪16.71%、碳水化合物56.44%）誘導(dǎo)喂養(yǎng)，ZDF（fa/+）大鼠喂養(yǎng)普通全價(jià)營養(yǎng)顆粒鼠飼料。

1.2 藥物

和于泰輔助降糖片，0.6 g/片，中生肽靈生物科技有限公司，批號(hào)140501；鹽酸二甲雙胍片，0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)20150109。

1.3 主要試劑和儀器

蘇木素、伊紅染液，北京索萊寶科技有限公司；Trizol Reagent，Life technologies公司；GoScript?Reverse Transcription System、GoTaq?qPCR Master Mix，Promega公司；RIPA裂解緩沖液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；磷酸化胰島素受體（p-InsR）、胰島素受體（InsR）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）、β-actin抗體，CST公司；羊抗鼠Ⅱ抗，Abcam公司；羊抗兔Ⅱ抗，CST公司；Block one/Block one-P，日本京都Nacalai Tesque公司；ECL發(fā)光液，美國BIO-RAD公司。7160型全自動(dòng)生化儀，日本日立公司；r-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；E9032型酶標(biāo)儀，美國Promega公司；Prism7500型PCR擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；BX53型光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽，美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008飼料誘導(dǎo)喂養(yǎng)4周后，尾靜脈采血檢測血糖，隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)，按體質(zhì)量和血糖隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、和于泰輔助降糖片組（降糖片組）、和于泰輔助降糖片聯(lián)合二甲雙胍組（聯(lián)合組），每組6只；6只健康雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常組。二甲雙胍組每日給予0.134 g/kg二甲雙胍藥液灌胃，降糖片組每日給予和于泰輔助降糖片0.64 g/kg藥液灌胃，聯(lián)合組每日給予二甲雙胍0.134 g/kg＋和于泰輔助降糖片0.64 g/kg藥液灌胃。所有藥物均用生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質(zhì)量，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)6周。

2.2 標(biāo)本采集

藥物干預(yù)6周后取材，禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3500 r/min離心15 min，抽取血清，用于生化指標(biāo)檢測；迅速剖取小腿骨骼肌，一部分放入10%中性福爾馬林溶液固定，用于普通光學(xué)顯微鏡檢測，另一部分置于不同凍存管，放入液氮凍存，用于Western blot、RT-PCR的檢測。

2.3 一般觀察

觀察各組大鼠一般狀態(tài)（精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛色等），記錄體質(zhì)量，1次/周。

2.4 生化指標(biāo)檢測

取大鼠血清，全自動(dòng)生化儀檢測空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA），全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀檢測血清胰島素水平（FINS），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR，F(xiàn)BG×FINS÷22.5）。

2.5 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第6周，大鼠禁食不禁水12 h，2 g/kg體質(zhì)量葡萄糖溶液灌胃，尾靜脈取血，葡萄糖氧化酶法測定0、30、60、120 min血糖，計(jì)算曲線下面積（AUC）。AUC＝0.5×（Bg0 min＋Bg30 min）÷2＋0.5×（Bg30 min＋Bg60 min）÷2＋1×（Bg60 min＋Bg120 min）÷2，Bg為各時(shí)間點(diǎn)血糖。

2.6 HE染色

10%中性福爾馬林溶液骨骼肌固定＞48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，蘇木精染液5 s，自來水返藍(lán)10 min，1%HCl-Alc分色30 s，自來水返藍(lán)10 min，雙蒸水洗1 min，伊紅染液5 s，乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片。光鏡下觀察骨骼肌病理變化。

2.7 RT-PCR檢測

取液氮凍存骨骼肌，Trizol法提取總RNA。GoScript?Reverse Transcription System試劑盒反轉(zhuǎn)錄，退火25 ℃、5 min，延伸42 ℃、1 h，滅活70 ℃、15 min，得cDNA。引物序列：InsR上游5'-GGCCC GATGCTGAGAACA-3'，下游5'-CGTCATTCCAAAG TCTCCGA-3'，產(chǎn)物長度214 bp；Akt上游5'-ATGTAG ACTCTCCAGATGAG-3'，下游5'-TGAGATAATCGA AGTCATTCA-3'，產(chǎn)物長度228 bp；Glut4上游5'-CG CGGCCTCCTATGAGATAC-3'，下游5'-CCTGAGTA GGCGCCAATGA-3'，產(chǎn)物長度270 bp；GAPDH上游5'-GGAAGCTCCGGGAACAAGT-3'，下游5'-TGCCA GCCCATGGATTCTC-3'，產(chǎn)物長度146 bp。GoTaq?qPCR Master Mix 20 μL體系，置于Applied Biosystems 7500 RT-PCR System進(jìn)行反應(yīng)，條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、15 s溶解。擴(kuò)增后得出基因Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

2.8 Western blot檢測

取液氮凍存骨骼肌，以RIPA裂解液提取總蛋白，加上樣緩沖液100 ℃、5 min蛋白變性；凝膠電泳100 V、1.5 h，預(yù)處理PVDF膜及濾紙，半干法轉(zhuǎn)膜15 V、1 h，TBS溶液洗膜10 min；Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，一抗（1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h。洗膜，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，蛋白條帶用Image J 7.0進(jìn)行圖像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

正常組大鼠精神良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作靈活，皮毛光澤；模型組大鼠較正常組體質(zhì)量顯著增加（＜0.01），并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、皮毛無光澤；各給藥組表現(xiàn)較模型組明顯改善。各組體質(zhì)量結(jié)果見表1。

4.2 生化指標(biāo)檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR顯著降低（＜0.05，＜0.01）；聯(lián)合組較二甲雙胍組、降糖片組大鼠血清TC、FFA、FBG水平和HOMA-IR顯著降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表1。

4.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與聯(lián)合組比較，二甲雙胍組、降糖片組大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC顯著升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，#＜0.05，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01；與聯(lián)合組比較，△＜0.05，△△＜0.01（下同）

4.4 HE染色結(jié)果

正常組大鼠骨骼肌肌纖維排列整齊、胞漿均勻，細(xì)胞核排列正常、形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠骨骼肌纖維排列紊亂，胞漿不勻，細(xì)胞核紊亂、增多并出現(xiàn)核內(nèi)移，見少量炎細(xì)胞浸潤；各給藥組大鼠骨骼肌肌纖維較模型組排列整齊，細(xì)胞核增多及內(nèi)移不顯著，未見明顯炎細(xì)胞浸潤，其中二甲雙胍組、聯(lián)合組改善較明顯。結(jié)果見圖1。

表2 各組大鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)AUC比較（±s）

正常組模型組二甲雙胍組

降糖片組聯(lián)合組

圖1 各組大鼠骨骼肌形態(tài)觀察（HE染色，×20）

4.5 聯(lián)合用藥對模型大鼠骨骼肌胰島素受體、蛋白激酶B、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，各給藥組InsR、Akt、Glut4 mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與聯(lián)合組比較，二甲雙胍組、降糖片組InsR、Akt、Glut4 mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表達(dá)比較（±s）

4.6 聯(lián)合用藥對模型大鼠骨骼肌p-胰島素受體、p-蛋白激酶B、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；聯(lián)合組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4表達(dá)較二甲雙胍組、降糖片組顯著升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

表4 各組大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)比較（±s）

注：A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.降糖片組；E.聯(lián)合組

5 討論

IR是胰島素作用的靶器官對胰島素敏感性降低，導(dǎo)致組織中葡萄糖攝取和利用率下降的一種病理狀態(tài)，是2型糖尿病主要病理基礎(chǔ)之一。中藥在治療2型糖尿病、改善IR方面具有多靶點(diǎn)、多途徑、療效穩(wěn)定、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。為了更好地探索中西藥聯(lián)合應(yīng)用治療2型糖尿病IR的效果，本研究對和于泰輔助降糖片、二甲雙胍單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用的效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，各給藥組大鼠血清TG、TC、FBG、FINS水平及HOMA-IR較模型組降低；聯(lián)合組較二甲雙胍組、降糖片組大鼠血清TC、FBG水平及HOMA- IR降低，說明和于泰輔助降糖片、二甲雙胍在降低大鼠血糖、改善IR方面聯(lián)合應(yīng)用效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。

骨骼肌是機(jī)體葡萄糖氧化利用的主要場所，同時(shí)也是胰島素作用的主要靶組織之一，對糖尿病發(fā)生發(fā)展有重要影響。骨骼肌對葡萄糖的攝取利用主要通過細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用。InsR是細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的始動(dòng)因子，分布于細(xì)胞表面，與胰島素結(jié)合后發(fā)生磷酸化并激活下游分子。研究發(fā)現(xiàn)，InsR表達(dá)升高能夠明顯降低小鼠血糖和胰島素水平[10]，改善IR。Akt是InsR下游的信號(hào)分子，被活化的InsR激活后發(fā)生磷酸化，從而被激活[11]，活化后的Akt觸發(fā)富含Glut4的囊泡向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)位，增多細(xì)胞表面Glut4數(shù)量，增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取[12]，此外Glut4還可以抑制烯醇式丙酮酸羧激酶而減少糖異生[13]。因此，這些靶點(diǎn)分子在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中必不可少，任一個(gè)分子異常將會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)不利，影響細(xì)胞對葡萄糖的利用及胰島素敏感性，這是糖尿病、IR發(fā)生的基本機(jī)制之一。

本研究中以ZDF大鼠為模型，其為自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型，更接近人體發(fā)病機(jī)制，具有高血糖、高血脂、IR的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中各給藥組干預(yù)6周后，聯(lián)合組降糖、改善IR明顯優(yōu)于二甲雙胍組、降糖片組，并較二甲雙胍組、降糖片組顯著上調(diào)大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表達(dá)，增加p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)。因此，和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用在降糖、改善IR方面療效優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)胰島素信號(hào)通路中InsR、Akt、Glut4的mRNA表達(dá)，以及促進(jìn)InsR、Akt磷酸化和Glut4的蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝。

綜上所述，和于泰輔助降糖片與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用降糖、改善IR的療效優(yōu)于兩藥單獨(dú)應(yīng)用，與其調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)分子表達(dá)相關(guān)。由于中藥多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用，中西藥聯(lián)合應(yīng)用改善IR可能存在其他新機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究。

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Effects ofTablets Combined with Metformin on Insulin Resistance in Skeletal Muscle of Diabetic Rats

XU Guang-yuan1,2, SUN Wen2, SONG Zi-lin2, GUO Xuan2, WU Li-li2, QIN Ling-ling2, HOU Dan3, ZHANG Zhuo3, TIAN Shuo3, LI Xiang4, LIU Tong-hua2

To observe effects ofTablets combined with metformin in insulin resistance (IR); To discuss its mechanism of action.6–7 week old male ZDF (fa/fa) rats were randomly divided into model group, metformin group,Tablets group (Tabletsgroup), and metformin combined withTablets group. ZDF (fa/+) rats were chosen as normal group. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 6 weeks. Body weight, FBG, TG, TC, FFA, FINS, HOMA-IR, OGTT and HE staining were tested. HE staining was used to observe the pathological changes of skeletal muscle. RT-PCR and Western blot were used to detect skeletal muscle corresponding gene and protein expression.Compared withTablets group and metformin group, TC, FFA, FBG, and HOMA-IR in metformin combined withTablets group decreased significantly (<0.05,<0.01). Blood glucose level and AUC significantly decreased at each time point in OGTT. HE staining of skeletal muscle fibers arranged in order; nucleus increased and internal movement was not significant, without obvious infiltration of inflammatory cells. Expressions of skeletal muscle InsR, Akt, and Glut4 mRNA expression increased (<0.05,<0.01). Expressions of skeletal muscle p-InsR, p-Akt, and Glut4 protein expression increased (<0.05,<0.01).Tablets combined with metformin can improve IR in type 2 diabetic rats, and the effect is better than single-application.

Tablets; metformin; combination-application; PI3K/Akt signaling pathway; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.010

R285.5

A

1005-5304(2017)11-0039-05

（2017-01-25）

（2017-02-23；編輯：華強(qiáng)）

北京市教育委員會(huì)高校重大成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2014年）

劉銅華，E-mail：thliu@vip.163.com