滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的抗炎保護(hù)作用

熊偉+陳思如+修光輝+凌斌+孫潔+劉萍

摘要：目的 觀察不同劑量滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的影響，并探討其與全身炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。方法 構(gòu)建大鼠腸黏膜功能障礙模型（LPS 15mg/kg），給予不同劑量滇重樓（20、40、80mg/kg）連續(xù)灌胃，于24Hr統(tǒng)計(jì)動(dòng)物存活率及小腸推進(jìn)率，取動(dòng)脈全血，檢測動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原時(shí)間（PT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和尿素氮（BUN）的含量，于1、7days取小腸行病理組織學(xué)檢查，于1、3、7、14days取材動(dòng)脈全血及小腸，ELISA法檢測血漿中二胺氧化酶（DAO）及小腸中HMGB1的含量。結(jié)果 模型組大鼠與對照組比較全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，存活率及小腸推進(jìn)率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；不同濃度滇重樓治療組與模型組比較全血中CK、PT含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），PaCO2含量升高，存活率及小腸推進(jìn)率升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；但治療組與模型組比較AST及高劑量組BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。1、3、7d時(shí)模型組血漿中DAO和HMGB1含量高于對照組，而1、3、7d時(shí)滇重樓治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），14d時(shí)相差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論 滇重樓連續(xù)灌胃可能通過下調(diào)晚期炎癥因子HMGB1表達(dá)，抑制全身炎癥反應(yīng)，從而改善腸黏膜屏障功能，發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：滇重樓；腸黏膜功能障礙；脂多糖；高遷移率族蛋白B1

中圖分類號：R2855 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）10-0068-04

Anti-inflammatory and Protective Effects of Continuous Intestine Administration

of Paris Polyphylla var Yunnanensison on Intestinal Mucosal Dysfunction

XIONG Wei， CHEN Si-ru， XIU Guang-hui， LING Bin， SUN Jie， LIU Ping

（Department of Severe Cases， the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of different doses of Paris polyphylla var yunnanensison on intestinal mucosal dysfunction and to explore its correlation with systemic inflammatory response Methods： The rat model of intestinal mucosal dysfunction （LPS 15mg/kg） was established and the rats were continuously administrated with different doses （20， 40， 80mg/kg） of Paris polyphylla The survival rate and the small intestine propulsion rate were measured at 24 hours The rats were sacrificed to take their arterial whole blood to determine the contents of PaCO2， creatine kinase （CK）， prothrombin time （PT）， aspartate aminotransferase （AST） and urea nitrogen （BUN） The small intestine was examined by histopathology at the 1st and 7th day The arterial whole blood and small intestine were taken to determine diamines oxidase （DAO） and HMGB1 in the small intestine by ELISA at the 1st， 3rd， 7th and 14th day Results： Compared with that of the control group， the level of CK， PT， AST and BUN in the whole blood of the model group increased， but the content of PaCO2 decreased The survival rate and the small intestine propulsion rate significantly decreased （P<005） and the difference was statistical significance （P<005） Compared with that of the model group， the content of CK and PT in the whole blood of the different doses groups decreased and the difference was statistical significance （P<005）， but PaCO2 increased and the survival rate and the small intestine propulsion rate increased and the difference was statistical significance （P<005） But there was no significant difference between the treatment group and the model group in AST and high dose group （P>005） The levels of DAO and HMGB1 in the plasma of the model group were higher than those of the control group at the 1st， 3rd and 7th day of modeling and the difference was statistically significant （P<005）， but in the 14th day of modeling， the difference was not statistically significant （P>005） Conclusion： Continuous intestine administration of Paris Polyphylla var Yunnanensison may inhibit systemic inflammatory response by down-regulating the expression of late inflammatory cytokines HMGB1， thereby improve intestinal mucosal barrier function and exert anti-inflammatory and protective effectendprint

【Key words】Paris polyphylla var；Yunnanensison；intestinal mucosal dysfunction；lipopolysaccharide；HMGB1

腸黏膜功能障礙是膿毒癥患者常見并發(fā)癥之一，也是膿毒癥發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，其機(jī)制包括腸黏膜細(xì)胞凋亡、腸通透性增加、胃腸動(dòng)力失調(diào)、菌群移位、炎癥因子級聯(lián)釋放等，可使腸黏膜屏障（機(jī)械、免疫、生物、化學(xué)屏障）嚴(yán)重受損，從而加速全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）向多器官功能障礙綜合征（MODS）發(fā)展[1-3]。腸黏膜功能障礙常表現(xiàn)為不同程度的食欲不振、便秘、腹瀉、腹脹、腹痛等，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)便血、腸梗阻、腹膜炎等。研究表明，膿毒癥患者的疾病嚴(yán)重程度與晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）呈相關(guān)性[4]，因其廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，病理狀態(tài)下可誘導(dǎo)其他炎癥因子釋放或靶細(xì)胞損傷，在膿毒性腸黏膜功能障礙的進(jìn)展中具有樞紐作用。

黃彥峰等[5]報(bào)道重樓水提液可調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)從而治療腸道功能紊亂，其機(jī)理可能與M膽堿能受體、腎上腺素能系統(tǒng)有關(guān)。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 可誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，促進(jìn)小鼠粒/巨噬細(xì)胞克隆形成細(xì)胞（GM-CFC）活化，增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力，直接參與抗炎反應(yīng)[6]；此外，重樓還可刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）分泌糖皮質(zhì)激素間接參與抗炎反應(yīng)[7]。在此基礎(chǔ)上，擬通過脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的腸黏膜功能障礙模型，觀察不同劑量滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的影響，并探討其與全身炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。

1 材料與方法

11 材料 滇重樓由昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科提供。清潔級健康成年SD大鼠雌性150只，體重（220±10）g，由解放軍昆明總醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SYXK（滇）2015-2016）。活性炭末購于天津登科公司，羥甲基纖維素鈉購于上海申光公司。脂多糖購于美國Sigma公司；血漿二胺氧化酶（DAO）和晚期炎癥因子HMGB1 ELISA試劑盒購于武漢華美公司。

12 方法

121 動(dòng)物分組及處理 清潔級健康雌性SD大鼠150只，自由飲食，隨機(jī)編號為5組，30只/組，分對照組、模型組、低劑量組、中等劑量組、高劑量組。各組大鼠禁食6h后，低、中、高劑量治療組分別予以20、40、80mg/kg滇重樓連續(xù)灌胃，對照組及模型組給予相同劑量生理鹽水灌胃；除對照組外，其余組經(jīng)腹腔注射LPS 15mg/kg，對照組給予相同劑量生理鹽水腹腔注射；觀察大鼠外觀、習(xí)性及各項(xiàng)生理反應(yīng)變化，正常飲食，精心護(hù)理。

122 動(dòng)物存活率及小腸推進(jìn)率的影響 于造模后24hr后，統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物存活情況。禁食6h后，滇重樓治療組分別予以20、40、80mg/kg滇重樓連續(xù)灌胃，對照組及模型組給予相同劑量生理鹽水，給藥后30min，各組動(dòng)物予以5%炭末懸液（活性炭末+05%羥甲基纖維素鈉）25ml/100g灌胃，20min后處死大鼠，結(jié)扎胃幽門部及回盲部，取小腸直線平鋪下測量，以幽門至回盲部為小腸總長度，以幽門至炭末推進(jìn)前段為炭末推進(jìn)距離，炭末推進(jìn)率（%）=炭末推進(jìn)距離/小腸總長度×100%。

123 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 于造模治療24hr后，4%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取動(dòng)脈血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，分別檢測各組動(dòng)物血二氧化碳分壓（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原時(shí)間（PT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和尿素氮（BUN）觀察模型成立及臟器功能變化情況。

124 小腸病理組織學(xué)檢測 于1、7days，分別取小腸組織用10%多聚甲醛溶液固定3～24h，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、常規(guī)切片和蘇木素-伊紅染色后，封片鏡檢觀察小腸組織損害程度。

125 ELISA法檢測DAO和HMGB1水平 于1、3、7、14days，分別取血漿制成檢測標(biāo)本，按每孔100ul分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，37℃溫育，依次加生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液、底物溶液、終止溶液，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀測量各孔OD值，對照標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。全部數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<005有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P>005無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組的組間及組內(nèi)均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。率的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料χ2檢驗(yàn)，P<005提示兩個(gè)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>005提示兩個(gè)率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

21 動(dòng)物存活率及小腸推進(jìn)率的影響 模型組大鼠與對照組比較動(dòng)物存活率及小腸推進(jìn)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較動(dòng)物存活率及小腸推進(jìn)率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），見表1。

22 生化指標(biāo)檢測結(jié)果 模型組大鼠與對照組比較全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較全血中CK、PT含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），PaCO2含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；但治療組與模型組比較AST及高劑量組BUN，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005），見表2。

22 小腸病理組織學(xué)檢測 對照組可見黏膜組織結(jié)構(gòu)正常，腺體完整，無水腫、出血、白細(xì)胞浸潤。模型組1d時(shí)可見黏膜明顯水腫，腺體部分不完整，黏膜下及肌層內(nèi)白細(xì)胞浸潤增多，7d時(shí)水腫及白細(xì)胞浸潤較前明顯減輕。不同濃度滇重樓治療組，1d時(shí)各組呈現(xiàn)出不同程度的黏膜水腫及白細(xì)胞浸潤，與模型組1d時(shí)組織結(jié)構(gòu)接近，但中等劑量組和高劑量組較輕；7d時(shí)各組與對照組組織結(jié)構(gòu)接近，僅輕度水腫，少量白細(xì)胞浸潤。見圖1。endprint

23 滇重樓對大鼠腸黏膜功能保護(hù)作用 1d、3d、7d時(shí)模型組與對照組比較血漿中DAO含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；1d、3d、7d時(shí)滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較血漿中DAO含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。14d時(shí)各組之間DAO無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。見表3，圖2。

24 滇重樓對大鼠小腸HMGB1的表達(dá)影響 1d、3d、7d時(shí)模型組與對照組比較小腸中HMGB1蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；1d、3d、7d時(shí)滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較小腸中HMGB1蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。14d時(shí)各組之間HMGB1無明顯差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。見表4，圖3。

3 討論

《滇南本草》記載重樓“為外科之至藥，主治一切無名腫毒，攻各種瘡毒癰疽，發(fā)背痘疔等癥最良”。姚勤等[8]采用耳腫法及毛細(xì)管通透性法觀察不同劑量重樓醇提物的抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大、中劑量的重樓醇提物對二甲苯所致的耳廓腫脹及醋酸所致的毛細(xì)血管滲漏有明顯的抑制作用。滇重樓的抗炎特性在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均得到證實(shí)，因云南獨(dú)有的氣候孕育了功效奇特的地道藥材，具有廣泛的市場開發(fā)和臨床推廣價(jià)值，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究，滇重樓預(yù)處理可明顯改善膿毒癥大鼠轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。但是，在腸黏膜功能障礙中滇重樓是否可通過抑制晚期炎癥因子HMGB1發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組相比大鼠血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2和小腸推進(jìn)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），表明膿毒癥進(jìn)展過程中包括心、肝、腎、腸、凝血等系統(tǒng)都受到不同程度的影響，表現(xiàn)出多器官功能障礙，且模型組大鼠死亡率60%，符合膿毒癥模型成功建立指標(biāo)。經(jīng)滇重樓連續(xù)灌胃后，1d時(shí)治療組小腸推進(jìn)率高于模型組，但低于對照組；1、3、7d時(shí)模型組血漿中DAO和HMGB1含量高于對照組，而1、3、7d時(shí)滇重樓治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），14d時(shí)相差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。表明滇重樓能夠促進(jìn)小腸推進(jìn)，降低黏膜通透性，抑制炎癥因子釋放，從而穩(wěn)定腸道屏障功能，調(diào)整腸道蠕動(dòng)，減少細(xì)菌移位及內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移，減緩膿毒癥進(jìn)程，從而發(fā)揮腸道保護(hù)作用，在治療晚期炎癥反應(yīng)得以控制，腸黏膜功能逐漸恢復(fù)，趨于正常。但治療組AST和BUN（高劑量組）與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005），可能與滇重樓的肝腎毒性有關(guān)，在臨床運(yùn)用中應(yīng)注意劑量及療程的把握。據(jù)報(bào)道[9-12]，滇重樓等中藥可能刺激分泌營養(yǎng)因子、抗炎因子、神經(jīng)介質(zhì)等神經(jīng)-體液途徑發(fā)揮抗炎保護(hù)作用，減輕腸黏膜功能障礙患者腹脹、腹瀉、腹痛等癥狀，從而改善轉(zhuǎn)歸及預(yù)后，降低住院費(fèi)用、縮短住院周期、提升住院質(zhì)量。

病理?xiàng)l件下，晚期炎癥因子HMGBl與各種炎癥因子一起參與炎癥反應(yīng)，如細(xì)胞損傷、壞死可激活免疫細(xì)胞分泌HMGB1，使免疫細(xì)胞向損傷部位募集，同時(shí)通過其特異性受體（如RAGE、TLR2、TLR4、NF-κB）誘導(dǎo)其他炎癥因子釋放或靶細(xì)胞損傷，形成瀑布樣級聯(lián)損害[13-15]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小腸中HMGB1蛋白表達(dá)水平高于對照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<005），說明滇重樓可能對晚期炎癥因子HMGB1有下調(diào)作用。綜上所述，滇重樓預(yù)處理可能通過下調(diào)晚期炎癥因子HMGB1表達(dá)，而改善小腸黏膜屏障通透性，發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。

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