花椒揮發(fā)性化合物的固相微萃取GC-MS分析

方一丁 ，劉綏鵬，樊澤楠

(1.西北農(nóng)林科技大學附屬中學，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100；3.蒲城縣林木病蟲防治檢疫站，陜西 蒲城 715500)

2017-02-18

方一丁,在校學生。

花椒揮發(fā)性化合物的固相微萃取GC-MS分析

方一丁1，劉綏鵬2，樊澤楠3

(1.西北農(nóng)林科技大學附屬中學，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100；3.蒲城縣林木病蟲防治檢疫站，陜西 蒲城 715500)

采用固相微萃取提取揮發(fā)物質(zhì)，并通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀對花椒葉片、嫩枝和韌皮部的揮發(fā)性成分進行分析和鑒定?；ń啡~片中分離鑒定出 56 種揮發(fā)性成分，主要為反式-β-羅勒烯(16.82%)、α-羅勒烯(16.42%)、石竹烯(13.27%)和1R-α-蒎烯(6.28%)；嫩枝中分離鑒定出 57 種揮發(fā)性成分，主要為石竹烯(26.10%)、蓽澄茄油烯(17.27%)、乙酸香葉酯(15.89%)和1R-α-蒎烯(6.17%)；韌皮部中分離鑒定出 38 種揮發(fā)性成分，主要為石竹烯(48.17%)、1R-α-蒎烯(25.91%)、律草烯(9.32%)和月桂烯(6.68%)。三者均以萜烯類含量最多，為進一步研究花椒害蟲的寄主選擇性提供一定的理論基礎(chǔ)。

花椒；揮發(fā)性成分；固相微萃??；氣相色譜/質(zhì)譜

花椒(Zanthoxylumbungeanum)為蕓香科多年生落葉灌木或小喬木，在我國已有兩千多年的栽培歷史，是主要的經(jīng)濟栽培樹種，主要產(chǎn)地在陜西、四川、山東、山西、河南、河北、貴州等[1]。近年來隨著花椒產(chǎn)業(yè)的不斷擴大和發(fā)展，花椒害蟲的發(fā)生與為害日趨嚴重，嚴重地影響了花椒的正常生長，成為了重要制約花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展和無公害花椒生產(chǎn)的重要因素之一。我國的花椒害蟲種類繁多，根據(jù)各地的調(diào)查報道結(jié)果統(tǒng)計，國內(nèi)已報道的花椒害蟲達16 目 82 科 190 余種，主要是天牛類、吉丁蟲類、葉甲類、介殼蟲類、蚜蟲類及象甲類等[2]。

植物通過體內(nèi)次生代謝途徑合成的揮發(fā)性有機物(Volatile organic compounds，VOCs)是植物間進行信息交流的信號物質(zhì)，也是引導植食性昆蟲進行寄主識別和定位的重要信息物質(zhì)[3]。目前，國內(nèi)外一些學者對植物揮發(fā)性物質(zhì)的組分、昆蟲對揮發(fā)性物質(zhì)的接收反應機制和揮發(fā)性物質(zhì)對昆蟲行為作用進行了大量研究[4-6]。本研究采用固相微萃取技術(shù)并結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜法(簡稱SPME-GC/MS)，對其葉片、嫩枝及韌皮部的揮發(fā)性物質(zhì)進行提取、分離、鑒定，為花椒資源的充分利用及花椒害蟲的信息素防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年6月，在西北農(nóng)林科技大學鳳縣花椒試驗示范站采集健康的鳳縣大紅袍花椒的新鮮葉片、嫩枝(一年生)和韌皮部作為試驗材料。

1.2 儀器設(shè)備

ISQ 氣相色譜/質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、DB-5MS 彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、SPME手動進樣手柄(美國Supelco公司)、DVB/CAR/PDMS萃取頭(纖維頭)(美國Supelco公司)、固相微萃取攪拌加熱平臺、10 mL樣品瓶、植物組織研磨儀、數(shù)顯型加熱板Talboys 等。

1.3 方法

分別將花椒葉片、嫩枝和韌皮部剪碎，放入植物組織研磨儀進行研磨后，移入10 ml樣品瓶中，約占瓶身的45%，加蓋密封樣品瓶放于50 ℃恒溫臺上，首先平衡 10 min，以保證樣品瓶上部揮發(fā)物質(zhì)可以充分飽和；然后將萃取頭插入樣品瓶中，吸附30 min后，于250 ℃解析3 min。

1.4 GC-MS分析條件

1.4.1 GC條件 進樣口溫度為250 ℃；柱溫箱升溫程序：60 ℃保持2.5 min，6 ℃/min升至190 ℃，然后以10 ℃/min升溫至230 ℃，維持5 min；載氣為高純He(99.999%)，流速為1.0 ml·min-1；分流比為10∶1。

1.4.2 MS條件 電離方式EI，電離電壓為70 eV，離子源溫度250 ℃。掃描質(zhì)量范圍為35～400 amu；譜庫：NIST2011，按面積歸一化法計算含量。

1.5 提取物鑒定

應用氣相色譜/質(zhì)譜-計算機聯(lián)機系統(tǒng)對固相微萃取法提取的各組分進行定性分析，并與NIST2011譜庫對照，結(jié)合有關(guān)文獻人工檢索確定其化學組成。

2 結(jié)果分析

2.1 花椒葉片中揮發(fā)性化合物

由圖1～3及表1看出，從花椒葉片中共檢測出 56 種物質(zhì)，其中醇類揮發(fā)物 10 種，含量為10.31% ；醛類揮發(fā)物1種，含量為0.18% ；酯類揮發(fā)物8種，含量為9.41% ；烴類揮發(fā)物4種，含量為1.17% ；單萜烯類揮發(fā)物12 種，含量為54.3% ；倍半萜烯類揮發(fā)物21種，含量為24.2% ；其中反式-β-羅勒烯、α-羅勒烯、石竹烯相對含量最多，分別為16.82%、16.42%和13.27%，1R-α-蒎烯為6.28%，檜烯為5.35%。

圖1 花椒葉片揮發(fā)物總離子圖

圖2 花椒嫩枝揮發(fā)物總離子圖

圖3 花椒韌皮部揮發(fā)物總離子圖

表1 花椒葉片、嫩枝和韌皮部揮發(fā)性物質(zhì)組分

36乙酸松油酯3?Cyclohexene?1?methanol，à，à，4?trimeth?yl?，acetateC12H20O20．81--37乙酸冰片酯BornylacetateC12H20O2--0．1638順式?3?己烯醇苯甲酸酯3?Hexen?1?ol，benzoate，(Z)-C13H16O20．1--39(-)?α?蓽澄茄油烯(?)?α?CubebeneC15H240．520．480．1440(-)?g?欖香烯Cyclohexane，1?ethenyl?1?methyl?2?(1?methylethenyl)?4?(1?methylethylidene)-C15H240．242．620．5641c?欖香烯c?ElemeneC15H240．480．61-42β?欖香烯Cyclohexane，1?ethenyl?1?methyl?2，4?bis(1?methylethenyl)?，[1S-(1à，2á，4á)]-C15H240．26--43衣蘭烯YlangeneC15H240．090．420．0444α?衣蘭烯α?ylangeneC15H240．260．030．0245蓽澄茄油烯1H?Cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]ben?zene，octahydro?7?methyl?3?methylene?4?(1?methyleth?yl)?，[3aS?(3aà，3bá，4á，7à，7aS?)]-C15H241．9917．273．1946α?可巴烯α?CopaeneC15H240．260．390．0647β?波旁烯β?bourboneneC15H240．040．04-48石竹烯CaryophylleneC15H2413．2726．148．174910，10?2?甲基?2，6?2?亞甲基?雙環(huán)[7．2．0]?十一烷Bicy?clo[7．2．0]undecane，10，10?dimethyl?2，6?bis(methyl?ene)?，[1S?(1R?，9S?)]-C15H24--0．16502，4a，5，6，7，8，9，9a?八氫?3，5，5?三甲基?9?亞甲基?1H?苯并環(huán)康烯1H?Benzocycloheptene，2，4a，5，6，7，8，9，9a?octahydro?3，5，5?trimetyl?9?methylene?，(4aS?cis)?C15H24--0．0251別香橙烯1H?Cycloprop[e]azulene，decahydro?1，1，7?trimethyl?4?methylene?C15H240．210．33-521?表二環(huán)倍半水芹烯(+)?epi?Bicyclosesquiphelland?reneC15H240．31-0．06531R，3Z，9s?4，11，11?三甲基?8?亞甲基?雙環(huán)[7．2．0]?3?十一烯1R，3Z，9s?4，11，11?Trimethyl?8?methylenebicy?clo[7．2．0]undec?3?eneC15H24--0．1254律草烯HumuleneC15H241．935．849．3255c?依蘭油烯c?MuuroleneC15H240．731．030．2856α?依蘭油烯α?MuuroleneC15H240．750．370．0957(+)?喇叭烯1H?Cycloprop[e]azulene，1a，2，3，5，6，7，7a，7b?octahydro?1，1，4，7?tetramethyl?，[1aR?(1aà，7à，7aá，7bà)]-C15H240．12-0．06581，2，3，4，4a，5，6，8a?八氫?4a，8?二甲基?2?(1?甲基乙烯基)?萘Naphthalene，1，2，3，4，4a，5，6，8a?octahydro?4a，8?dimethyl?2?(1?methylethenyl)?，[2R-(2à，4aà，8aá)]-C15H24-0．030．0259b?畢澄茄烯Naphthalene，1，2，4a，5，8，8a?hexahydro?4，7?dimethyl?1?(1?methylethyl)?，[1S?(1à，4aá，8aà)]-C15H241．161．120．4360γ?杜松烯Naphthalene，1，2，3，4，4a，5，6，8a?octahydro?7?methyl?4?methylene?1?(1?methylethyl)?，(1à，4aá，8aà)?C15H240．840．810．2961α?法呢烯α?FarneseneC15H240．56-0．0562α?愈創(chuàng)木烯α?GuaieneC15H240．13--63α?二去氫菖蒲烯α?CalacoreneC15H200．030．03-

64巴倫西亞橘烯Naphthalene，1，2，3，5，6，7，8，8a?octa?hydro?1，8a?dimethyl?7?(1?methylethenyl)?，[1R?(1à，7á，8aà)]?C15H240．050．06-65雙環(huán)[4．4．0]?1烯Bicyclo[4．4．0]dec?1?ene，2?isopropyl?5?methyl?9?methylene?C15H24-0．06-661，2，3，4，4a，7?六氫?1，6?二甲基?4?(1?甲基乙基)?萘Naphthalene，1，2，3，4，4a，7?hexahydro?1，6?dimethyl?4?(1?methylethyl)-C15H24-0．25-67去氫白菖烯Naphthalene，1，2，3，4?tetrahydro?1，6?dim?ethyl?4?(1?methylethyl)?，(1S?cis)?C15H22--0．0468反式長松香芹醇Longipinocarveol，trans?C15H24O-0．50．0169反式?橙花叔醇1，6，10?Dodecatrien?3?ol，3，7，11?trime?thyl?，(E)?C15H26O0．170．27-70順?倍半香檜烯水合物cis?sesquisabinenehydrateC?15H26O0．46--711?羥基?1，7?二甲基?4?異丙基?2，7?環(huán)癸二烯1?Hydroxy?1，7?dimethyl?4?isopropyl?2，7?cyclodecadieneC15H26O-0．03-72杜松醇à?CadinolC15H26O-0．06-73石竹素CaryophylleneoxideC15H24O0．040．160．1374乙酸法呢醇Farnesol，acetateC17H28O2-0．07-752?氨基苯甲酸?3，7?二甲基?1，6?辛二烯?3?醇酯1，6?Oc?tadien?3?ol，3，7?dimethyl?，2?aminobenzoateC17H23NO20．540．06-

注：-為未檢測到。

2.2 花椒嫩枝中揮發(fā)性化合物

從花椒嫩枝中共檢測出57種物質(zhì)，其中醇類揮發(fā)物10 種，含量為3.57% ；醛類揮發(fā)物1種，含量為0.23% ；酯類揮發(fā)物6種，含量為16.12%；酮類揮發(fā)物3種，含量為2.02% ；醚類揮發(fā)物3種，含量為0.07% ；烴類揮發(fā)物3種，含量為0.37% ；單萜烯類揮發(fā)物12種，含量為19.54% ；倍半萜烯類揮發(fā)物19種，含量為57.86% ；其中乙酸香葉酯、蓽澄茄油烯、石竹烯相對含量最多，分別為15.89%、17.27%和26.1%，1R-α-蒎烯為6.17%，律草烯為5.84%。

2.3 花椒韌皮部中揮發(fā)性化合物

從花椒韌皮部中共檢測出38種物質(zhì)，其中醇類揮發(fā)物3種，含量為0.24% ；酯類揮發(fā)物2種，含量為0.84% ；烴類揮發(fā)物1種，含量為0.03%；單萜烯類揮發(fā)物12種，含量為 35.54% ；倍半萜烯類揮發(fā)物20種，含量為 63.12% ；其中1R-α-蒎烯、石竹烯相對含量最多，分別為25.91%和48.17%，律草烯為9.32%，月桂烯為6.68%。

花椒葉片、嫩枝和韌皮部三者共有揮發(fā)性化合物 28 種，但各組分的含量存在差異，相同揮發(fā)性化合物主要是萜烯類。葉片特有的揮發(fā)性化合物有 10 種，嫩枝特有的為 12 種，韌皮部特有的為 5 種。

3 結(jié)論與討論

對花椒葉片、嫩枝和韌皮部的揮發(fā)性化合物進行了提取、分離和鑒定，共鑒定出 75 種化學成分。其中葉片中分離鑒定出 56 種揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的 99.78%；枝條中分離鑒定出 57 種揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的 99.89%；韌皮部中分離鑒定出 38 種揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的 99.77%，三者均以萜烯類物質(zhì)含量最多。

目前，普遍認為，揮發(fā)性物質(zhì)在植物-植食性昆蟲-天敵三級營養(yǎng)系統(tǒng)的信息傳遞中起到重要作用。植物的揮發(fā)性物質(zhì)可以為植食性昆蟲搜尋寄主植物提供可靠信號，寄主植物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)是植食性昆蟲天敵對其搜尋的重要信息[7]。研究發(fā)現(xiàn)，寄主揮發(fā)物中的倍半萜烯和烴類是天牛信息交流物質(zhì)和引誘劑的主要組分[8]，石竹烯[9]對銅綠麗金龜有較強的觸角電位和嗅覺行為反應，小蠹蟲主要根據(jù)寄主樹木釋放出的化學氣味物質(zhì)來確定其寄主[10]，吉丁蟲科作為鞘翅目重要的一個類群，同樣可能對寄主揮發(fā)物表現(xiàn)出趨向作用。整體上來看，花椒的主要揮發(fā)物為1R-α-蒎烯、反式-β-羅勒烯、α-羅勒烯、乙酸香葉酯、石竹烯等，其中是否存在對花椒窄吉丁有引誘作用的活性成分及其確定需進行室內(nèi)外生物測定。

植物揮發(fā)物與植物的代謝活動密切相關(guān)[11]，揮發(fā)物組成和含量不同環(huán)境、不同地域、不同品種、不同生長階段都會有差異。固相微萃取(solid-phase micro-extraction，SPME)是常用的無溶劑的樣品前處理技術(shù)，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，可以與氣象色譜、氣質(zhì)聯(lián)用儀等儀器聯(lián)用，在生化、環(huán)境、醫(yī)藥及食品領(lǐng)域得到了廣泛應用[12]。為了更好的分析花椒揮發(fā)物質(zhì)組成，可以利用其它提取方法如動態(tài)頂空吸附[13]、水蒸氣蒸餾法[14]等，比較揮發(fā)物的異同，得到更加全面的結(jié)果，因此花椒揮發(fā)性物質(zhì)仍需不斷的繼續(xù)深入研究。

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AnalysisofVolatileComponentsofZanthoxylumbungeanumbySPME/GC-MS

FANG Yi-ding1, LIU Sui-peng2, FAN Ze-nan3

(1.HighSchoolAttachedToNorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100；2.ForestryCollegeofForetsry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100; 3.ForestPestControlandQuarantineStation,Pucheng,Shaanxi715500)

To study the specific composition and relative content of the volatile components in the leaf, twigs and phloem ofZanthoxylumbungeanum, the volatile components were extracted by solid phase micro-extraction and were analyzed by GC-MS. Fifty-six were found in the leaf, including trans-β-ocimene (16.82%, m/m, the same below), α-ocimene (16.42%), carypohyllene (13.27%) and (1R)-α-pinene (6.28%). Fifty-seven were found in the twigs, including carypohyllene (26.10%), cubebene (17.27%), geranyl acetate (15.89%) and (1R)-α-pinene (6.17%). Thirty-eight were found in the phloem, including carypohyllene (48.17%), (1R)-α-pinene (25.91%), humulene (9.32%) and α-myrcene (6.68%). The content terpenes were the main components in the volatile.

Zanthoxylumbungeanum; volatile composition; solid phase micro-extraction; GC-MS

S793.9

A

1001-2117(2017)03-0009-06