利用反相高效液相法測(cè)定馬乳中的乳清蛋白

李敏婧，楊潔，楊迎春，王紅娟，呂岳文，申彤，劉軍，阿里木江·阿布都拉

(新疆大學(xué) 生命科與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830049)

利用反相高效液相法測(cè)定馬乳中的乳清蛋白

李敏婧，楊潔*，楊迎春，王紅娟，呂岳文，申彤，劉軍，阿里木江·阿布都拉

(新疆大學(xué) 生命科與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830049)

乳清蛋白是馬乳中主要的蛋白質(zhì)，不同物種間蛋白質(zhì)組成存在差異。該研究利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)馬乳清中的蛋白進(jìn)行分離和定量分析，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)主要分離組分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，馬乳乳清蛋白中主要組分為L(zhǎng)YS，α-lg和β-lg。利用建立的色譜分析方法對(duì)乳清蛋白定量測(cè)定結(jié)果顯示，LYS，α-lg和β-lg在(0.1～1.0)(R2=0.999 3)、(0.2～0.8)(R2=0.996 9)和(0.2～1.0) g/L(R2=0.990 3)線性關(guān)系良好。該方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，加標(biāo)回收率分別為：88.05%～96.26%，86.03%～95.70%和91.79%～100.97%，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。測(cè)得馬乳乳清中的LYS，α-lg和β-lg，含量為別為(3.38±0.32)、(2.64±0.37)及(0.52±0.06) g/L。

反相高效液相色譜法；馬乳；溶菌酶；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白

新疆是多民族聚居地區(qū)，養(yǎng)馬業(yè)發(fā)達(dá)，當(dāng)?shù)啬撩裼酗嬘民R奶及酸馬奶的傳統(tǒng)。馬乳含1%脂肪、2%蛋白質(zhì)、7%的乳糖[1]，馬乳相對(duì)于其他乳制品，有一些結(jié)構(gòu)和功能上的特性使得它更符合人們的營(yíng)養(yǎng)需要，乳糖含量高于其他乳品，更利于腸道微生物的生長(zhǎng)，改善腸道問題等[2]。由于不同哺乳動(dòng)物幼崽所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，因此不同物種乳中蛋白質(zhì)組成不同，馬乳中α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-la)，β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-lg)，免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，具有抑菌作用的溶菌酶(lysozyme ,LYS)，乳鐵蛋白(lactoferrin , Lf)，乳凝集素(lactadherin)含量較高，除了乳清酸蛋白以上這些蛋白質(zhì)的比例在物種之間差異較大：α-la占牛乳乳清蛋白50%，而馬乳中α-la所占比例較少，駝乳、馬乳中β-lg含量要高于牛乳，且馬乳β-lg較牛β-lg易消化[3]，馬乳、駝乳和牛乳α-la均含123個(gè)氨基酸，對(duì)馬乳，駝乳和牛乳主要蛋白質(zhì)氨基酸序列利用NCBI進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列有明顯差異，差異性為17.34%[4]。從結(jié)構(gòu)上來看，駝乳α-la比牛乳α-la多5個(gè)折疊，馬乳中β-lg中2個(gè)異構(gòu)體包含162及163個(gè)氨基酸，每個(gè)異構(gòu)體中含有2個(gè)二硫鍵，但在牛乳中并未發(fā)現(xiàn)二硫鍵。

由于其獨(dú)特的品質(zhì)和功能，馬乳在輔助疾病治療方面以及在食品行業(yè)中的應(yīng)用有巨大的潛力，新疆馬乳的生產(chǎn)大部分來自小規(guī)模飼養(yǎng)的牧民，難以控制生乳及其制品的質(zhì)量[5]。目前，對(duì)乳蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的主要方法有高效液相色譜法(HPLC)，雙向凝膠電泳(2-DE)，層析分離(chromatography),非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption-lonization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)等。國(guó)外學(xué)者多用蛋白質(zhì)組學(xué)方法——電泳、多維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，依據(jù)不同乳中的特征蛋白鑒別不同來源的乳制品，MIRANDA等[6]使用RP-HPLC，2-DE和MALDI-TOF-MS依據(jù)不同蛋白分子質(zhì)量以及N端序列不同成功鑒別牛乳、馬乳、人乳以及山羊乳中LYS，α-lg和β-lg。BESMA S等[4]利用HPLC，MALDI-TOF-MS等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)識(shí)別駝科乳中酪蛋白及乳清蛋白等，并且依據(jù)不同物種乳中的乳清蛋白的分子質(zhì)量及氨基酸序列鑒定駝科乳。YANG等[7]使用2-DE和MALDI-TOF-MS依據(jù)α-la，β-lg等不同蛋白質(zhì)在2-DE膠圖中所表現(xiàn)的不同斑點(diǎn)，以其作為分子標(biāo)志檢測(cè)牛乳摻偽的駝乳、山羊乳等。

本研究采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)馬乳與牛、駝、酸馬乳乳清中差異蛋白乳清蛋白進(jìn)行檢測(cè)，為監(jiān)測(cè)新疆特色乳品質(zhì)量以及優(yōu)化產(chǎn)品加工方式提供技術(shù)理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

馬乳：選擇新疆烏魯木齊水西溝天然放牧的馬匹，現(xiàn)場(chǎng)采集10匹泌乳母馬的乳汁，混勻后使用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后立即離心，得到馬乳乳清于-50 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：溶菌酶(LYS)、牛源α-乳白蛋白(α-la)、牛源β-乳球蛋白(β-lg)，純度均≥90%，均購(gòu)自sigma；乙腈(HPLC級(jí))，三氟乙酸(TFA)和其余試劑均為分析純，α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)，純度99%，購(gòu)自sigma；Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Analyzer(ABI)。

1.3儀器

高效液相色譜儀(LC-10ATvp),日本島津；低溫離心機(jī)(3K30) ,德國(guó)Sigma；超聲波清洗儀(B3200S),美國(guó)BRANSON；超純水儀(NW Ultra-pure Water System),香港heal force；改良砜復(fù)合膜(Biomax系列),美國(guó)Millipore；電子天平(AL104型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋(DKB-501A型),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；質(zhì)譜儀4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer ，ABI(Foster City)。

1.4實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 5u 100? C4(150×4.6) mm；流動(dòng)相：A液0.1% TFA水， B液0.09% TFA乙腈; 流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；外標(biāo)法定量。采用梯度洗脫方式分離檢測(cè)馬乳乳清中的蛋白組分，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

注：A:A液0.1﹪TFA 水; B:B液0.09﹪TFA 乙腈。

1.4.2 質(zhì)譜條件

樣品靶：384 Opti-TOF 123 mm×81 mmss ，ABI；檢測(cè)方式：正離子反射檢測(cè)；基質(zhì)：CHCA。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)液制備

溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用1 mL超純水溶解。

用同樣的方法制得質(zhì)量濃度為1.0 g/L的α-la和β-lg標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.4.4 樣品處理

取馬、牛、駝、酸馬乳，4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，去除上層乳脂和下層酪蛋白等沉淀，將得到的乳清二次離心，去除殘余的少量乳脂和酪蛋白沉淀，取二次離心后的乳清1 mL，用超純水稀釋至2 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.4.5 樣品測(cè)定

將經(jīng)過1.4.3樣品處理的馬乳乳清樣品，按照1.4.1的色譜條件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1方法學(xué)考察

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選用215 nm和280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)同一樣品進(jìn)行分析[8-9]，目標(biāo)蛋白(1:LYS ; 2:α-la; 3:β-lg) 在215 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下有較高的響應(yīng)(圖1)，確定215 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

A-215 nm; B-280 nm; 1-LYS; 2-α-la; 3-β-lg圖1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下RP-HPLC測(cè)馬乳乳清蛋白的色譜圖Fig.1 Chromatography proles for mare whey protein by RP-HPLC, detected at 215 nm(A)and 280 nm(B)

2.1.2 梯度洗脫程序的選擇

起始梯度洗脫程序?yàn)?5%的A液，5%的B液，乳清蛋白幾乎完全與固定鍵合相發(fā)生疏水作用。隨著B液濃度不斷提高(圖2)，逐步破壞蛋白與固定相之間的疏水作用，最終蛋白被一一洗脫下來。當(dāng)濃度達(dá)到30%時(shí)開始有較大的峰(β-lg)，直到濃度達(dá)到45%時(shí)不再有峰?？梢源_定25%～50%的B液可以將乳清蛋白中的組分完全洗脫。

圖2 不同B液濃度下馬乳的洗脫色譜圖Fig.2 RP-HPLC profile of clarified mare’s milk on a Kromasil C4 column

2.1.3 流速的選擇

柱溫為40 ℃，分別選用0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min五個(gè)流速進(jìn)行洗脫(圖3)[10]，隨著流動(dòng)相流速的增大，色譜峰的峰形變的尖銳對(duì)稱，并且保留時(shí)間被大大縮短，峰的分離度增大，分離效果明顯提高。由于流速對(duì)面積百分比的影響較小，因此流速不會(huì)影響最終各組分的定量結(jié)果。綜合考慮，最終選擇1.0 mL/min作為洗脫流速。

1-0.4 mL/min; 2-0.5 mL/min; 3-0.6 mL/min; 4-0.8 mL/min; 5-1.0 mL/min圖3 不同流速對(duì)馬乳清蛋白分離影響的色譜圖Fig.3 Chromatography proles with different flow velocity

2.1.4 色譜柱柱溫的選擇

固定其他條件不變，選擇不同溫度進(jìn)行恒定柱溫洗脫(圖4)[10]，柱溫升高，使色譜峰變得尖銳對(duì)稱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中溫度對(duì)3個(gè)大的組分峰的保留時(shí)間影響不明顯，但隨著柱溫升高，LYS峰面積有減少的趨勢(shì)，β-lg峰面積有增加的趨勢(shì)，而α-la峰面積隨著柱溫的升高幾乎不變。綜合考慮LYS，α-lg和β-lg三種蛋白的最佳峰面積，選擇40 ℃作為最終檢測(cè)柱溫。

1-30 ℃; 2-35 ℃; 3-40 ℃; 4-45 ℃; 5-50 ℃圖4 不同溫度對(duì)馬乳清蛋白分離影響的色譜圖Fig.4 Chromatography proles with differentcolumn temperature

2.2分析方法的性能指標(biāo)

2.2.1 線性范圍

取LYS，α-la和β-lg標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L及0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按1.4.1色譜條件分析(圖3)。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法LYS，α-la和β-lg分別在(0.2～1.0)、(0.2～0.8)和(0.2～1.0) g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.59、7.3和8.7 mg/L，滿足檢測(cè)要求(表2)。

A-LYS標(biāo)品; B-α-la標(biāo)品; C-β-lg標(biāo)品圖5 LYS(A),α-la(B) 和β-lg (C)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.5 Chromatography proles of LYS(A),α-la(B) and β-lg (C) standards

名稱線性回歸方程相關(guān)系數(shù)(R2)線性范圍/(g·L-1)檢出限/(g·L-1)LYSy=17735884.7x-105401.10.99930.2～1.00.00059α-lay=7500107.8x-156482.00.99690.2～0.80.0073β-lgy=6852159.5x-321581.80.99030.2～1.00.0087

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)1.4.3樣品處理后的待測(cè)樣品，按1.4.1的色譜條件，在同1天連續(xù)進(jìn)樣3次，分別求得LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示精密度(表3)。本法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.26%、0.97%和1.73%<5.00%，可知此實(shí)驗(yàn)方法的精密度良好。

表3 方法精密度

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一待測(cè)樣品，在檢測(cè)過程中的24 h內(nèi)分別在0、8、16 h進(jìn)樣1次，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以其RSD值表示天內(nèi)穩(wěn)定性(表4)。用上述待測(cè)樣品在第2天、第3天重復(fù)進(jìn)樣，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值，以其RSD值表示天間穩(wěn)定性(表4)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值均小于5%，可知該方法穩(wěn)定性良好。

表4 方法穩(wěn)定性

2.2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

同一個(gè)待測(cè)樣品分3等份，按照1.4.3的樣品處理方法處理，1.4.1的色譜條件，分別進(jìn)樣，得到LYS、α-la和β-lg各組分的色譜峰面積的平均值(表5)。并計(jì)算3個(gè)組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.74%、2.17%和2.37%<5.00%，可知該方法重現(xiàn)性良好。

表5 方法重現(xiàn)性

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一個(gè)待測(cè)樣品共六份，其中3份測(cè)本底值，其余3份添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)品。由于LYS、α-la和β-lg標(biāo)準(zhǔn)品分別來自蛋清、人乳及牛乳，與馬乳中相應(yīng)組分存在差異，組分保留時(shí)間有偏差，因此認(rèn)為加標(biāo)測(cè)回收率的的樣品本底值為0。此方法測(cè)得的回收率均在86%以上(表6)。

表6 RP-HPLC法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3樣品中LYS、α-la和β-lg含量的測(cè)定

SILVIA VINCENZETTI等[11]曾指出，馬科乳乳清中的高豐度蛋白組分為L(zhǎng)YS、α-la和β-lg，且利用反相C4柱對(duì)驢乳乳清分析所得的3個(gè)大量組分峰分別為L(zhǎng)YS、α-la和β-lg。因此結(jié)合上述文獻(xiàn)記載及標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、出峰前后順序，最終確定圖1-A中馬乳乳清在反相C4柱中所表現(xiàn)出的1、2、33個(gè)大量組分峰分別為L(zhǎng)YS、α-la及β-lg。

選擇4個(gè)不同待測(cè)馬乳樣品，分別測(cè)定LYS、α-la和β-lg的含量，結(jié)果見表7。由表7可知，馬乳乳清中LYS、α-la和β-lg的平均含量分別為(0.52±0.06)、(3.38±0.32)及(2.64±0.37) g/L。

表7 樣品乳中LYS、α-la和β-lg的含量

2.4不同家畜乳品乳清蛋白的比較

對(duì)馬乳與酸馬乳、驢乳、駝乳、牛乳中乳清蛋白樣品在相同處理?xiàng)l件和色譜條件下進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同家畜乳清蛋白在反相C4柱上色譜行為差異顯著，表現(xiàn)出蛋白質(zhì)多態(tài)性(見圖6)這與乳清蛋白組分的細(xì)微結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。馬乳與酸馬乳(圖6中的1、圖6中的2)均存在保留時(shí)間為10、17、38及42 min的蛋白峰，驢與馬親緣關(guān)系相近，驢乳(圖6中的4)含有在馬乳中也出現(xiàn)的保留時(shí)間為17、38及42 min的蛋白峰，與馬乳相比缺少保留時(shí)間為10 min的特征峰；駝乳只有一個(gè)保留時(shí)間為25 min的特征峰(圖6中的5)，在此保留時(shí)間馬、驢、牛乳清均無峰出現(xiàn)；牛乳(圖6中的3)的2個(gè)特征峰保留時(shí)間為39與45 min，在45 min處馬、驢、駝乳清均無峰出現(xiàn)。這種差異對(duì)乳的鑒別具有重要意義。

1-馬乳；2-酸馬乳；3-牛乳；4-驢乳；5-駝乳圖6 不同來源乳品乳清蛋白的色譜圖Fig.6 Chromatography proles of whey protein from different sources

2.5馬乳及駝乳乳清蛋白中差異蛋白的質(zhì)譜鑒定

由于缺乏馬乳及駝乳乳清蛋白組分標(biāo)準(zhǔn)品，所以實(shí)驗(yàn)中圖5為來源于牛乳的LYS、α-la和β-lg標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，蛋白質(zhì)的來源不同因此它們?cè)贑4色譜柱上所表現(xiàn)出的保留時(shí)間有所差異。為更進(jìn)一步確認(rèn)馬乳乳清蛋白在C4色譜柱分離的3個(gè)特征組分分別為L(zhǎng)YS、α-la和β-lg，以及探究駝乳乳清蛋白在C4色譜柱分離的蛋白是何組分，對(duì)馬乳和駝乳乳清蛋白組分進(jìn)行回收濃縮，并進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。分析結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和人工比對(duì)(表8)，馬乳乳清蛋白(圖6中的1)的3個(gè)特異蛋白(17、38、42 min)為前文中推測(cè)的LYS、α-la和β-lg，但這3個(gè)蛋白組分與來源于蛋清的LYS和牛乳的α-la和β-lg保留時(shí)間有所偏差，其中主要原因就是來源于不同物種所致。駝乳乳清蛋白25 min的蛋白被鑒定為α-la，與馬乳、牛乳乳清蛋白具有很大的差異，原因可能是駝乳來源的α-la的蛋白結(jié)構(gòu)與來源于馬乳、牛乳的差別較大，所以在C4色譜柱上表現(xiàn)出保留時(shí)間的差異明顯。

表8 質(zhì)譜鑒定駝乳、馬乳WP中蛋白信息

3 結(jié)論

通過對(duì)RP-HPLC方法的考察，表明應(yīng)用RP-HPLC法檢測(cè)馬乳乳清中LYS，α-lg和β-lg的方法是可行的。該方法前處理過程簡(jiǎn)單，3種蛋白在(0.2～1.0) g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、精密度高、準(zhǔn)確性好，適合進(jìn)行較大樣本量的樣品分析檢測(cè)。在馬乳、酸馬乳、驢乳、駝乳、牛乳中乳清蛋白的分析中發(fā)現(xiàn)，不同物種來源乳品在反相C4柱上表現(xiàn)蛋白質(zhì)多態(tài)性，可作為乳品摻偽檢測(cè)的依據(jù)。對(duì)馬乳和駝乳乳清蛋白特征蛋白組分進(jìn)行回收濃縮，并進(jìn)行Maldi-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定，分析結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和人工比對(duì)，結(jié)果表明馬乳乳清蛋白的3個(gè)蛋白(17、38、42 min)為前文中推測(cè)的LYS、α-la和β-lg，這3個(gè)蛋白組分與來源于蛋清的LYS和牛乳的α-la和β-lg的保留時(shí)間有所偏差。駝乳乳清蛋白25 min的蛋白被鑒定為α-la，這與馬乳、牛乳乳清蛋白具有很大的差異，原因可能是駝乳來源的α-la的蛋白結(jié)構(gòu)與來源于馬乳、牛乳的差別較大，所以在C4色譜柱上表現(xiàn)出保留時(shí)間的差異明顯。

[2] STUPARU A A, STRUGARIU C E, OROIAN T.Pharmaceuticals and dietary supplements extracted from mare's milk[J].Bulletin of the University of Agricultural Sciences & Veterinary ,2016,73(1):2-10.

[4] SAADAOUI B, BIANCHI L, HENRY C, et al.Combining proteomic tools to characterize the protein fraction of llama (Lamaglama) milk[J].Electrophoresis, 2014,35(10):1 406-1 418.

[5] 魏曉敏.乳與乳制品摻偽鑒別和檢驗(yàn)技術(shù)[J].黑龍江科技信息, 2016(6): 124.

[6] MIRANDA G, MAHE M F, LEROUX, et al.Proteomic tools to characterize the protein fraction of Equidae milk[J].Proteomics,2004(4):2 496-2 509.

[7] YANG Y, ZHENG N, YANG J, et al.Animal species milk identification by comparison of two-dimensional gel map profile and mass spectrometry approach[J].International Dairy Journal,2014,35(1):15-20.

[8] WANG J,ZHANG Q H,WANG Z H,et al.Determination of major bovine milk proteins by reversed phase high performance liquid chromatography[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2009,37(11):1 667-1 670.

[9] VINCENZETTI S, POLIDORI P,MARIANI P,et al.Donkey’s milk protein fractions characterization[J].Food Chemistry,2008,106(2):640-649.

[10] 師治賢,王俊德.生物大分子的液相色譜分離和制備[M].北京:科學(xué)出版社,1992:113-116.

[11] THERESE UNIACKE-LOWE, THOM HUPPERTZ, PATRICK F FOX.Equine milk proteins: Chemistry, structure and nutritional signicance[J].International Dairy Journal, 2010, 20:609-629.

[12] FERREIRA IMPLVO, CA?OTE H.Detection and quantification of bovine, ovine and caprine milk percentages in protected denomination of origin cheeses by reversed-phase high-performance liquid chromatography of beta-lactoglobulins[J].Journal of Chromatography A, 2003,1015(1/2):111-118.

[13] CZERWENKA C, MüLLER L, LINDNER W.Detection of the adulteration of water buffalo milk and mozzarella with cow’s milk by liquid chromatography-mass spectrometry analysis of β-lactoglobulin variants[J].Food Chemistry, 2010,122(3):901-908.

[14] ENNE G, ELEZ D, FONDRINI F, et al.High-performance liquid chromatography of governing liquid to detect illegal bovine milk's addition in water buffalo Mozzarella: Comparison with results from raw milk and cheese matrix[J].Journal of Chromatography A ,2005,1 094(1/2):169-174.

[15] FELFOUL I, JARDIN J, GAUCHERON F, et al.Proteomic profiling of camel and cow milk proteins under heat treatment[J].Food Chemistry,2016, 216:161-169.

[16] FARAH Z.Effect of heat treatment on whey proteins of camel milk[J].Milchwissenschaft-milk Science International, 1986, 41(12): 763-765.

[17] HURLEY I P, COLEMAN R C, IRELAND H E, et al.Measurement of bovine IgG by indirect competitive ELISA as a means of detecting milk adulteration[J].Journal of Dairy Science, 2004,87(3):543-549.

[18] ELAGAMY E I.Effect of heat treatment on camel milk proteins with respect to antimicrobial factors: a comparison with cows’ and buffalo milk proteins[J].Food Chemistry, 2000,68(2): 227-232.

Determinationofwheyproteinsinmaremilkbyreversed-phase

high-performanceliquidchromatography

LI Min-jing, YANG Jie*, YANG Ying-chun, WANG Hong-juan, LYU Yue-wen, SHEN Tong, LIU Jun, Alimujiang·ABUDULA

(College of Life Sciences, Xinjiang University,Urumqi 830049,China)

Whey protein are the main protein in mare milk，but are different in protein composition among different species. In this paper, reserved-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used to isolate and quantify proteins in mare whey, the main components were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The result showed that LYS, α-Ig and β-Ig are the primary components in mare whey proteins. The linear relation of LYS , α-Ig and β-Ig are in the range of 0.1-1.0 (R2=0.999 3) 0.2-0.8 (R2=0.996 9) and 0.2-1.0 μg/L(R2=0.990 3), respectively. The relative standard deviations (RSDs) value of precision and reproducibility tests were all less than 5%, and the spike recovery was in the range of 88.05%-96.26%, 86.03%-95.70% and 91.79%-100.97%, respectively. The concentration of LYS, α-lg and β-lg in mare milk were (0.52±0.06)、(3.38±0.32) and (2.64±0.37) μg/L, respectively.

reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC); mare milk; lysozyme; α-lactalbumin;β-lactoglobulin

碩士研究生(楊潔教授為通訊作者，E-mail：xindayangjie@sina.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471645)

2016-11-21，改回日期：2017-03-10

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013452