聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮工藝研究

撒玉良，袁長(zhǎng)勝，陳文，趙文彬

（石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000）

聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮工藝研究

撒玉良，袁長(zhǎng)勝，陳文，趙文彬*

（石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000）

優(yōu)化聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的工藝。采用紫外分光光度法，以蘆丁含量為指標(biāo)，測(cè)定玫瑰花提取物中總黃酮的含量。用單因素考察和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選出聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)，對(duì)玫瑰花總黃酮進(jìn)行富集純化。聚酰胺樹脂富集玫瑰花總黃酮的最優(yōu)工藝條件為：采用質(zhì)量濃度為4 mg/mL、pH5的上樣液，徑高比為1∶7，在室溫下上樣，吸附3 h以上，達(dá)到吸附飽和；解吸時(shí)先用15%乙醇洗去雜質(zhì)，再用pH值為5～6的80%乙醇8 BV洗脫。由80%乙醇洗脫液得到的粉末中總黃酮含量達(dá)到23.4%，是純化前的5.7倍左右。

聚酰胺；玫瑰花；總黃酮；純化；吸附

玫瑰花為傳統(tǒng)維吾爾醫(yī)用藥，《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》收錄了玫瑰花口服液和玫瑰花糖膏兩種單方制劑，玫瑰花口服液源于維吾爾醫(yī)典名著《卡熱巴丁卡德爾》成藥總庫(kù)，其以補(bǔ)益心腦、鎮(zhèn)靜安神、消腫止痛，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用治療心血管疾病方面取得了可喜的療效[1-2]。玫瑰花含有多種化學(xué)成分，大約有三百多種，主要包括揮發(fā)油、黃酮、酚酸類、色素類、多糖、氨基酸、微量元素等[3]。玫瑰花提取物中成分復(fù)雜，無(wú)法應(yīng)用于后續(xù)的藥理實(shí)驗(yàn)研究。聚酰胺樹脂是一類結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)單位酰胺鍵（-CONH-）的高分子聚合物，酰胺基團(tuán)上的O、N原子在酸性介質(zhì)中結(jié)合質(zhì)子而帶正電荷，以靜電引力形成吸附溶液中的陰離子，故可與酚類、酸類、醌類、黃酮類等富含酚羥基的化合物形成氫鍵而吸附，而與不能形成氫鍵的化合物分離[4]。聚酰胺樹脂是一種比較理想的吸附劑，但聚酰胺樹脂純化玫瑰花黃酮的研究未見報(bào)道。因此，本文采用聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮，在不同條件下研究聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花黃酮的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附與解吸特性，用正交試驗(yàn)優(yōu)化聚酰胺樹脂純化玫瑰黃酮工藝條件，找到聚酰胺樹脂純化玫瑰黃酮最佳工藝條件，提高玫瑰黃酮粗提物中總黃酮含量，為玫瑰黃酮的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花藥材：安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司；聚酰胺樹脂（30目～60目）：浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；蘆丁對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司；硝酸鋁、石油醚（30℃～60℃）、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇均為分析純；95%乙醇、蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TP 300超聲波提取器：天鵬電子新技術(shù)（北京）有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的含量測(cè)定

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，加入25 mL的容量瓶中，用70%乙醇定容成濃度為0.1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取樣品適量，加入70%乙醇使成25 mL，作為供試品溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL量瓶中，加入10%硝酸鋁溶液5 mL和0.2 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，70%乙醇定溶，用70%乙醇作對(duì)照，采用紫外吸收分光光度法，在404 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=29.914x+0.008 8，R2=0.998 3，蘆丁對(duì)照品溶液濃度在0.003 9 mg/mL～0.023 5 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.1.4 樣品測(cè)定

取供試品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入10%硝酸鋁溶液5 mL和0.2 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，用70%乙醇定容，以0.5 mL樣品溶液加入70%乙醇定容至25 mL作為空白對(duì)照，測(cè)定樣品溶液的吸光度值，平行測(cè)定3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.2 聚酰胺樹脂的預(yù)處理

取聚酰胺樹脂適量，過(guò)60目篩，篩去小顆粒聚酰胺樹脂，把篩得的聚酰胺樹脂用95%的乙醇浸泡24 h，后裝入層析柱中，用蒸餾水反復(fù)沖洗至無(wú)醇味，再加入2%NaOH溶液反復(fù)沖洗，每隔一定時(shí)間用pH試紙測(cè)定pH值，至pH12左右時(shí)停止加入NaOH溶液，浸泡24 h，后用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，再加入10%醋酸溶液反復(fù)沖洗，每隔一定時(shí)間用pH試紙測(cè)定pH值，至pH2左右時(shí)停止加入10%醋酸溶液，浸泡24 h，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，備用[5]。

1.3.3 上樣液的制備

稱取一定質(zhì)量的玫瑰花藥材，加入70%乙醇，回流提取1 h，反復(fù)3次，合并3次的提取液[6]，旋蒸濃縮，后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，過(guò)濾，收集濾液，旋蒸至干，刮出提取物，研磨至粉末，備用[7]。精密稱取提取物粉末，配制一定濃度的樣品溶液（加入適量蒸餾水，溶解，定容），備用。

1.3.4 聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附與解吸工藝研究

以聚酰胺樹脂對(duì)總黃酮的吸附率為考察指標(biāo)，以單因素輪替法分別研究溫度，上樣液pH值對(duì)靜態(tài)吸附的影響，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線；以及乙醇濃度，洗脫液pH值對(duì)樹脂靜態(tài)解吸的影響，并繪制靜態(tài)解吸附動(dòng)力曲線。

1.3.5 聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸工藝研究

以流出液中總黃酮質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)，以單因素輪替法分別研究上樣液質(zhì)量，上樣體積對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響，以及洗脫液中乙醇濃度、洗脫液pH值和洗脫劑體積對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸附的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以上樣液質(zhì)量濃度（mg/mL）、徑高比（d/h）、乙醇濃度（%）、洗脫劑pH值4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。選L9（34）正交表，確定聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的最佳工藝條件，聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的參數(shù)設(shè)計(jì)見表1。

表1 聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮工藝正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Orthogonal design factors and levels of purification process of total flavonoids by polyamide resin

2 結(jié)果和分析

2.1 聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附與解吸

2.1.1 聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附

2.1.1.1 溫度對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附的影響[8-9]

精密稱定12份預(yù)處理好的聚酰胺樹脂各（5.000 0±0.001 0）g，分別置于 12個(gè) 250 mL 具塞三角瓶中。加入玫瑰花總黃酮粗提物溶液（總黃酮濃度0.166 mg/mL）各 30 mL，后分別在 20、25、30、35 ℃下水浴恒溫振蕩（180 r/min，每組平行3份）6 h后取上清液5 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量和吸附率，并對(duì)同組求出平均值，結(jié)果見表2。

表2 溫度對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附的影響Table 2 Effect of temperature on static adsorption of polyamide resin

由表2可以看出，溫度對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附玫瑰花總黃酮影響不顯著，在室溫下（25℃），聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花總黃酮的吸附效果最好。

2.1.1.2 上樣液pH值對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附的影響[10]精密稱定8份預(yù)處理好的聚酰胺樹脂各（5.000 0±0.001 0）g，置于8個(gè)250 mL具塞三角瓶中，加入不同pH值的玫瑰花總黃酮粗提物溶液（總黃酮濃度0.166 mg/mL）各 30 mL，pH 值梯度為 3、4、5、6、7、8、9、10。放入水浴恒溫振蕩器（25℃，180 r/min）振蕩6 h，取上清液2 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量和吸附率，結(jié)果見表3。

表3 上樣液pH值對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附的影響Table 3 Effect of pH of sample solution on static adsorption of polyamide resin

表3表明，上樣液pH值對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附玫瑰黃酮有很大影響，酸性環(huán)境有利于羥基的形成，使玫瑰黃酮容易與聚酰胺樹脂形成氫鍵而被吸附，而堿性環(huán)境會(huì)破壞化合物中的羥基，不利于黃酮與聚酰胺樹脂形成氫鍵，影響聚酰胺樹脂吸附玫瑰黃酮。因此，選擇pH5的上樣液上樣。

2.1.1.3 聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線[11]

精密稱定3份預(yù)處理好的聚酰胺樹脂各（5.000 0±0.001 0）g，置3個(gè)250 mL具塞錐形瓶中，加入上樣溶液（總黃酮濃度0.166 mg/mL）各30 mL，置恒溫水浴振蕩器中（25℃，180 r/min）振蕩5 h，每隔1 h吸取上清液2 mL（同時(shí)加入2 mL蒸餾水），按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算平均值，用平均值計(jì)算每克干聚酰胺吸附量（mg/g）和吸附率（%），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，得聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，見圖1。

圖1 聚酰胺樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線Fig.1 Static adsorption dynamic curve of polyamide resin

由圖1可以看出，聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花總黃酮在3 h內(nèi)吸附平衡。因此，在用聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的時(shí)候要保證聚酰胺樹脂與上樣液充分接觸3 h以上，使玫瑰花總黃酮盡可能多的吸附在聚酰胺樹脂上，從而提高柱效，減少損失。

2.1.2 聚酰胺樹脂靜態(tài)解析[12]

2.1.2.1 乙醇濃度對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸的影響

取經(jīng)吸附平衡后的聚酰胺樹脂，濾過(guò)，于濾紙上吸干樣液，精密稱取 5份各（3.000 0±0.001 0）g，分別置于5個(gè)250 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密移取加入20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液各 30 mL，在水浴恒溫振蕩器中恒溫振蕩解吸3 h后，觀察洗脫液顏色變化和澄清度，把具塞錐形瓶取出，用移液管精密移取洗脫液2 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫量及解吸率，結(jié)果見表4。

表4 乙醇濃度對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸的影響Table 4 Effect of eluent on static desorption of polyamide resin

由表4可知，乙醇濃度越高，越容易把玫瑰黃酮洗脫下來(lái)。80%乙醇的洗脫效果最好，洗脫量比較大，而且洗脫液比較澄清，因此選擇80%乙醇作為洗脫液。

2.1.2.2 洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸的影響

取經(jīng)吸附平衡后的聚酰胺樹脂5份，濾過(guò)，于濾紙上吸干樣液，精密稱定 5份各（3.000 0±0.001 0）g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入不同pH值（1～2，3～4、5～6、7～8、9～10）的 80%乙醇溶液 30 mL，恒溫振蕩解吸3 h后，觀察洗脫液顏色和澄清度，取洗脫液2 mL按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫量及解吸率，結(jié)果見表5。

表5 洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸影響Table 5 Effect of eluent pH on static desorption of polyamide resin

由表5可知，洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂的解吸過(guò)程有很大的影響，洗脫劑pH值偏中性有利于玫瑰黃酮的解吸，pH值在4以下時(shí)，解吸率低，很多黃酮洗脫不下來(lái)，pH值大于9時(shí)，解吸率太大，表明玫瑰黃酮已經(jīng)被水解，性質(zhì)改變。因此，選擇洗脫劑的pH值為5～6。

2.1.2.3 聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線

取經(jīng)吸附平衡后的聚酰胺，濾過(guò)，于濾紙上吸干樣液，精密稱定（5.000 0±0.001 0）g，置于 250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，置于恒溫水浴振蕩器中，解吸5 h，每隔1 h吸取上清液2 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度。計(jì)算出每克干聚酰胺樹脂的解吸量（mg/g）及解吸率（%），結(jié)果見圖2。

圖2 聚酰胺樹脂靜態(tài)解吸動(dòng)力曲線Fig.2 Static desorption dynamic curve of polyamide resin

由圖2表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，解吸液中玫瑰花總黃酮的量是增加的，吸附平衡后的聚酰胺樹脂在80%乙醇溶液中浸泡4 h左右，基本已經(jīng)達(dá)到解吸平衡。保證聚酰胺樹脂在洗脫液中浸泡4 h以上，解吸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，解吸率很難再有提高，工作效率下降。

2.2 聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸

2.2.1 聚酰胺動(dòng)態(tài)吸附

2.2.1.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響[10]

稱取適量已活化好的聚酰胺樹脂5份，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm、高為50 cm的層析柱中，使柱高為15 cm。按1.3.3項(xiàng)下方法配制5種不同質(zhì)量濃度的上樣液各250 mL，上樣液質(zhì)量濃度梯度為 2、3、4、5、6 mg/mL。然后把5種上樣液按相同方法（相同流速、相同溫度）上樣，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定流出液中總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），結(jié)果見表 6。

表6 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響Table 6 Effect of the mass concentration of the sample solution on the dynamic adsorption of polyamide resin

由表6表明，上樣液質(zhì)量濃度是2、3 mg/mL時(shí)，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度很低，幾乎檢測(cè)不到，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度由3 mg/mL升到4 mg/mL時(shí)，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度增大很快，為了保證聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花黃酮吸附完全，故選擇上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL，如果考慮到盡可能少損失玫瑰花黃酮，建議選擇3 mg/mL的上樣液質(zhì)量濃度上樣；如果考慮到吸附完全，讓盡可能多的玫瑰花黃酮吸附到聚酰胺樹脂上，建議選擇4 mg/mL的上樣液質(zhì)量濃度上樣。

2.2.1.2 上樣體積對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響[11]

稱取適量已活化好的聚酰胺樹脂，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm、高為50 cm的層析柱中，使柱高為15 cm。按1.3.3項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，同時(shí)，用10 mL離心管接流出液，每10 mL一份。之后，按照1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定每份流出液中總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰黃酮的吸附泄漏曲線Fig.3 Polyamide resin on the adsorption of flavonoids leaking curve

表7 除雜洗脫劑對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響Table 7 Influence of eluant on dynamic desorption of polyamide resin

由表7可以看出，乙醇濃度越高，洗下來(lái)的玫瑰花黃酮越多，20%乙醇洗下來(lái)的玫瑰黃酮太多，因此不能用于洗脫雜質(zhì)。蒸餾水、5%、10%乙醇洗脫下來(lái)的玫瑰黃酮很少，但是雜質(zhì)也很難洗脫下來(lái)，所以，最后選擇15%的乙醇溶液作為除雜洗脫劑。

2.2.2.2 乙醇濃度對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響[15]

稱取適量聚酰胺樹脂5份，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm層析柱中，使柱高為15 cm。按1.3.3項(xiàng)下方法配制5份質(zhì)量濃度為4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，先用15%的乙醇沖洗至流出液無(wú)色，分別用等體積（8 BV）的50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫，把洗脫液旋干，用無(wú)水乙醇溶出，揮干，得到粉末。精密稱定一定質(zhì)量的粉末，配成25 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算出粉末中總黃酮含量（%），結(jié)果見表8。

由圖3可以看出，當(dāng)上樣體積為110 mL的時(shí)候，玫瑰黃酮開始有泄漏，當(dāng)上樣體積達(dá)到170 mL左右時(shí)，聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花黃酮吸附達(dá)到平衡。因此，上樣體積要在170 mL以上，才能使聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花黃酮充分吸附，從而提高柱效。

2.2.2 聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸

2.2.2.1 除雜溶液濃度對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響

稱取適量聚酰胺樹脂5份，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm的層析柱中，使柱高為15 cm。按2.3項(xiàng)下方法配制5份質(zhì)量濃度為4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，分別用8 BV的蒸餾水、5%乙醇、10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇洗雜質(zhì)，觀察顏色變化，并按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定流出液中總黃酮質(zhì)量濃度，結(jié)果見表7。

表8 洗脫劑濃度對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響Table 8 Effect of eluent concentration on dynamic desorption of polyamide resin

表8表明，在一定范圍內(nèi)，乙醇濃度越高，洗脫下來(lái)的玫瑰黃酮越多，純化后粉末中玫瑰黃酮含量越高，可乙醇濃度過(guò)高，純化后粉末中玫瑰總黃酮的含量反而有所下降，原因是乙醇濃度過(guò)高，把聚酰胺吸附的其他雜質(zhì)也洗脫下來(lái)了。

2.2.2.3 洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響

稱取適量聚酰胺樹脂5份，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm的層析柱中，使柱高為15 cm。按1.3.3項(xiàng)下方法配制5份質(zhì)量濃度為4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，先用15%的乙醇洗雜質(zhì)，再分別用不同pH值（1～2、3～4、5～6、7～8、9～10）的 80%乙醇作洗脫劑，收集洗脫液，把洗脫液旋干，用無(wú)水乙醇溶出，揮干，得到粉末。精密稱定一定質(zhì)量的純化后的提取物粉末，配成25 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算出粉末中總黃酮含量（%），結(jié)果見表9。

表9 洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響Table 9 Effect of eluent pH on dynamic desorption of polyamide resin

由表9可以看出，洗脫劑pH值對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸有很大影響，洗脫劑過(guò)酸、過(guò)堿都會(huì)降低純化后粉末中總黃酮含量，可能的原因是玫瑰黃酮在過(guò)酸、過(guò)堿環(huán)境中都會(huì)水解，而導(dǎo)致純化后粉末中黃酮含量偏低。洗脫劑為中性偏酸時(shí)，純化后提取物粉末中黃酮含量較高，黃酮是多羥基化合物，偏酸性環(huán)境可以保護(hù)羥基。因此，純化時(shí)選擇洗脫劑pH值為5～6。

2.2.2.4 洗脫劑體積對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響[11]

稱取適量聚酰胺樹脂5份，以濕法裝入內(nèi)徑為2 cm的層析柱中，使柱高為15 cm。按1.3.3項(xiàng)下方法配制5份質(zhì)量濃度為4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，先用15%的乙醇洗雜質(zhì)，再分別用6、8、10、12、14 BV的80%乙醇（pH5～6）洗脫玫瑰黃酮，把洗脫液旋干，用無(wú)水乙醇溶出，揮干，得到粉末，精密稱定一定質(zhì)量純化后的提取物粉末，配成25 mL，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算出粉末中總黃酮含量，結(jié)果見表10。

表10 洗脫劑體積對(duì)聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響Table 10 Effect of eluent volume on dynamic desorption of polyamide resin

表10表明，洗脫劑體積小，聚酰胺樹脂吸附的玫瑰黃酮不能完全洗脫，洗脫劑體積過(guò)大，聚酰胺樹脂吸附的一些雜質(zhì)也被洗脫下來(lái)，導(dǎo)致純化后粉末中總黃酮含量降低。因此，選擇洗脫劑體積為8 BV進(jìn)行洗脫。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1因素水平表，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。取9根相同型號(hào)的層析柱（內(nèi)徑為2 cm，高50 cm），按L9（34）正交表將已活化好的聚酰胺樹脂濕法裝柱。按L9（34）正交表和1.3.3項(xiàng)下方法配制上樣液，上樣，先用15%乙醇溶液沖洗至流出液無(wú)色，再根據(jù)L9（34）正交表，用已調(diào)好pH值的不同濃度的洗脫液8 BV洗脫。收集洗脫液，旋蒸至干，加入適量無(wú)水乙醇溶出，倒入培養(yǎng)皿中，揮干，得到粉末。精密稱取適量粉末，配成一定濃度樣品溶液，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算出純化后的提取物粉末中玫瑰花總黃酮含量（%）。結(jié)果見表11和表12。

表11 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 11 Orthogonal test results

表12 正交試驗(yàn)方差分析Table 12 Orthogonal test variance analysis

由方差分析表看出，以綜合評(píng)分為指標(biāo)，因素D在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的水平變化對(duì)玫瑰花提取物用聚酰胺樹脂純化后的粉末中總黃酮含量的影響有顯著性差異（p＜0.05）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，各因素對(duì)玫瑰花提取物用聚酰胺樹脂純化后的粉末中總黃酮含量的影響因素大小順序?yàn)椋篋（洗脫劑pH值）＞C（洗脫液濃度）＞A（上樣液濃度）＞B（徑高比）；每個(gè)因素3個(gè)水平之間的趨勢(shì)為 A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C1＞C3，D1＞D2＞D3，直觀分析得，聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的最佳工藝為A2B2C2D1，即上樣液濃度為4 mg/mL，徑高比為1∶7，洗脫液濃度為80%乙醇，洗脫劑pH值為5～6。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)[15]

以正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出的最佳純化工藝（上樣液濃度為4 mg/mL，徑高比為1∶7，洗脫液濃度為80%乙醇，洗脫劑pH為5～6）平行3組，進(jìn)行試驗(yàn)。取3根相同型號(hào)的層析柱（內(nèi)徑為2 cm，高50 cm），以濕法裝柱，使柱高為14 cm，按1.3.3項(xiàng)下方法配制4 mg/mL的上樣液250 mL，上樣，先用15%的乙醇溶液沖洗至流出液無(wú)色，再用已配制好的80%乙醇溶液（pH值為5～6）洗脫黃酮，收集流出液旋蒸至干，加入適量無(wú)水乙醇溶出，倒入培養(yǎng)皿中，揮干，得到粉末。精密稱取適量粉末，配成一定濃度的樣品溶液，按1.3.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算出純化后的提取物粉末中玫瑰花總黃酮含量（%），結(jié)果見表13。

表13 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 13 Verification of test results

由表13可以看出，正交試驗(yàn)結(jié)果可靠，純化后的提取物粉末中的玫瑰花總黃酮含量較高，平均值可以達(dá)到23.2%。因此可以確定聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮最佳工藝條件：上樣液濃度為4 mg/mL，徑高比為1∶7，洗脫液濃度為80%乙醇，洗脫劑pH值為5～6。

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

本試驗(yàn)研究了聚酰胺樹脂對(duì)玫瑰花總黃酮提取物的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的吸附與解吸特性，并用正交試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，得出了用聚酰胺樹脂純化玫瑰花總黃酮的最佳工藝條件為：采用質(zhì)量濃度為4 mg/mL、pH5的上樣液，徑高比為1∶7，在室溫下上樣，吸附3 h以上，達(dá)到吸附飽和；解吸時(shí)先用15%乙醇洗去雜質(zhì)，再用pH為5～6的80%乙醇8 BV洗脫。應(yīng)用優(yōu)化后的純化工藝條件，可以使純化后的玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量達(dá)到23.5%，純化前玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量為4.15%，純度提高了5.7倍。

3.2 討論

黃酮類物質(zhì)含有較多的酚羥基，其通過(guò)氫鍵容易與帶有酰胺鍵的聚酰胺樹脂很好結(jié)合，不同的黃酮類化合物在聚酰胺上的層析行為有一定的規(guī)律性，而影響聚酰胺吸附能力的因素很多，主要有：1）與黃酮類化合物分子形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目有關(guān)，能形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多則吸附力越強(qiáng)；2）與形成氫鍵基團(tuán)的位置有關(guān)，如所處位置易于形成分子內(nèi)氫鍵，則吸附能力減?。?）分子內(nèi)芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強(qiáng)；4）不同類型黃酮類化合物被吸附強(qiáng)弱順序不同，黃酮醇＞黃酮＞二氫黃酮醇＞異黃酮；5）與溶劑介質(zhì)有關(guān)，在水中形成氫鍵的能力強(qiáng)，吸附強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較弱，在酸性溶劑中強(qiáng)，堿性溶劑中最弱，各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱至強(qiáng)的順序?yàn)椋核技状蓟蛞掖迹舛扔傻偷礁撸急枷溲趸c水溶液或氨水＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。

[1]熱比亞·阿布力米提,沙吉旦·斯拉木.維吾爾藥玫瑰花口服液結(jié)合西藥治療44例心血管疾病的療效觀察[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志,2006(1):14

[2]伊德力斯·巴克.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):維吾爾藥分冊(cè)[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1998:152

[3]魯紅,李明,鄭淑芬,等.玫瑰花藥材中氨基酸及微量元素含量分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(16):133-134

[4]方小燕.聚酰胺樹脂在分離純化黃酮中的應(yīng)用研究[J].海峽藥學(xué),2013,25(5):41-42

[5]王克勤,嚴(yán)志慧,羅軍武,等.聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J].食品與機(jī)械,2009,25(3):46-50

[6]周達(dá).玫瑰花黃酮類化合物的提取、分離及生物活性研究[D].天津:天津商業(yè)大學(xué),2010

[7]李淑芳,桑小軍.玫瑰花中總黃酮提取方法比較研究[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012,6(8):12-13

[8]楊必成,劉海,楊義芳,等.聚酰胺樹脂純化油菜花粉黃酮部位工藝研究[J].中草藥,2011,42(11):2240-2243

[9]陳帥,王慧竹,王冠,等.聚酰胺樹脂分離純化羅布麻葉總黃酮的工藝研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016(2):109-116

[10]張偉,葛志強(qiáng),蔣建蘭.聚酰胺樹脂分離純化復(fù)方山楂提取物中總黃酮的研究[J].中草藥,2009,40(1):63-66

[11]黃松,丁婕,陶艷,等.聚酰胺樹脂精制甜茶總黃酮的工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2010,21(3):311-315

[12]楊武英,上官新晨,徐明生,等.聚酰胺樹脂精制青錢柳黃酮的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(2):320-324

[13]柯仲成,桂雙英,周亞球.聚酰胺樹脂吸附純化貫葉金絲桃中金絲桃苷的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2008,14(11):9-11

[14]張麗,劉懷金,閻建輝,等.聚酰胺樹脂精制姜黃中姜黃素類化合物的研究[J].精細(xì)化工中間體,2009,39(4):25-27,38

[15]陳佳亮.大孔吸附樹脂在中藥分離純化應(yīng)用中影響因素研究[D].北京:北京工業(yè)大學(xué),2012

Purification of Flavonoids from Rose with Polyamide Resin

SA Yu-liang，YUAN Chang-sheng，CHEN Wen，ZHAO Wen-bin*
（College of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

To optimize the process of purifying total flavonoids in rose with polyamide resin.The content of total flavonoids in roses extract was determined by UV spectrophotometry with rutin content as an index.The total flavonoids in rose were enriched and purified by the optimal process parameters that screened by single factor and orthogonal test.The optimum conditions were as follows：the concentration and pH of sample solution were 4 mg/mL and 5；the ratio of diameter to height was 1 ∶7；the temperature of loading sample was room temperature；reaching adsorption saturation within over 3 h；scouring off impurity with 15%ethanol；washing with 80%ethanol（pH 5-6，8BV）.The content of total flavonoids in the dried powder was rised to 23.4%，which was about 5.7 times as much as before purification.

polyamide；rose；flavonoids；purification；adsorption

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.011

新疆兵團(tuán)英才計(jì)劃項(xiàng)目

撒玉良（1993—），男（回），碩士，研究方向：藥劑學(xué)。

*通信作者：趙文彬（1967—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然產(chǎn)物的研究。

2017-03-10