創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的制備及其特性分析

古小莉，李永賢，李惠青，陳潔文,李劉冬

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510300)

創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的制備及其特性分析

古小莉，李永賢，李惠青，陳潔文,李劉冬*

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州510300)

[目的]制備創(chuàng)傷弧菌特異性抗體，為建立免疫學(xué)快速檢測創(chuàng)傷弧菌提供參考依據(jù)。[方法]以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原，將抗原分多次免疫新西蘭大白兔獲得特異性多克隆抗體，采用蛋白G親和層析法純化多克隆抗體，通過間接ELISA和WesternBlot測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的效價(jià)、敏感性和特異性。[結(jié)果]實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體，效價(jià)為1∶64000；抗體對創(chuàng)傷弧菌具有高的特異性，它與多株致病菌均無明顯交叉反應(yīng)，其對創(chuàng)傷弧菌檢測靈敏度為103CFU/mL；WesternBlot分析表明，制備的多克隆抗體能識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具較強(qiáng)的抗原性。[結(jié)論]創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體具有較高特異性和靈敏性，可應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學(xué)檢測。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(5):45-50]

創(chuàng)傷弧菌；外膜蛋白；多克隆抗體；WesternBlot；ELISA

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，其廣泛存在于河口、海洋環(huán)境和海產(chǎn)品中，是危害許多海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌之一，同時(shí)也能夠使人類致病，引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥[1-2]。鑒于創(chuàng)傷弧菌致病的危害性，建立特異、靈敏的檢測方法尤為迫切。目前，創(chuàng)傷弧菌快速檢測方法主要有免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法[3-4]，其中免疫學(xué)方法以具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)受到眾多研究者的青睞[5-6]。研制創(chuàng)傷弧菌高特異性的抗體，是建立免疫學(xué)快速檢測創(chuàng)傷弧菌的重要基礎(chǔ)。

革蘭氏陰性細(xì)菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)與細(xì)菌的致病性及免疫保護(hù)性密切相關(guān)，外膜蛋白在細(xì)菌表面存在裸露的抗原表位，具有較強(qiáng)免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體及某些細(xì)胞因子[7-9]。目前，國內(nèi)外關(guān)于創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的研究主要集中在抗原性和免疫刺激復(fù)合物分析[10-12]，但以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作抗原制備特異抗體的研究較少。李素一等[13]在創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU的免疫原性研究中，制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU多克隆抗體驗(yàn)證可以識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU，但未對抗體的特性作進(jìn)一步的研究。為深入了解創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白抗體的特性，本研究以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原制備多克隆抗體，探討抗創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的特異性，以期為建立創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學(xué)檢測方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株均購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，菌株列表見表1。

表1 菌株列表Tab.1 Strains list

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純系新西蘭大白兔購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑

弗氏(完全/不完全)佐劑、Tris-HCl、甘氨酸、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自廣州杰偉特生物科技有限公司；堿性蛋白胨水購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司；蛋白G親和層析柱(HiTrap Protein G HP)購自美國GE Healthcare公司；TBST及PMSF購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多克隆抗體的制備

1.2.1.1 抗原(外膜蛋白)的制備

參照改進(jìn)的PMSF法[11]，將創(chuàng)傷弧菌接種于3% NaCl堿性蛋白胨水，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌液于100 ℃水浴滅活5 min，取200 mL于離心管中，4 ℃ 7 043 g離心20 min，棄上清液，收集沉淀。將收集的菌體沉淀加PMSF反復(fù)凍融并進(jìn)行超聲破碎6 min(功率200 W，工作30 s，間隔5 s)，將裂解后的菌液4 ℃ 13 805 g離心20 min，收集上清液，并將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳[14]，用Bio-Rad公司Quantity One 4.62軟件計(jì)算分子量。

1.2.1.2 多克隆抗體的制備

將制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白200 μL(蛋白濃度約2.5 mg/mL)與弗氏佐劑1∶1(V/V)混合，振蕩混勻，采用多點(diǎn)(頸部、腳掌和腹股溝)皮下注射免疫新西蘭大白兔，進(jìn)行三次免疫，首次免疫20 d，二次免疫10 d，三次免疫10 d(首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑)。免疫結(jié)束，取免疫新西蘭大白兔血清，將血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3多克隆抗體的純化

參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》親和層析法[15]，用蛋白G親和層析柱HiTrap Protein G HP純化抗血清，以pH 3.0的0.1 mol/L 甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，收集的洗脫液為純化的多克隆抗體，將純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.2 多克隆抗體特性分析

1.2.2.1 多克隆抗體的效價(jià)測定

采用間接ELISA法[16]測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體(免疫血清)效價(jià)，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為492 nm。

1.2.2.2 敏感性試驗(yàn)

將108CFU/mL創(chuàng)傷弧菌菌懸液，進(jìn)行10倍梯度遞減稀釋至102CFU/mL，將待測血清及陰性血清按1∶4 000稀釋，羊抗兔IgG以1∶1 000稀釋，通過間接ELISA法確定最小抗原檢測濃度。以所產(chǎn)生的P/N值大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)P/N值≥2.1判定為陽性[17]。P/N值=(陽性對照OD492值-空白對照OD492值)/(陰性對照OD492值-空白對照OD492值)。

1.2.2.3 交叉試驗(yàn)

將濃度為107CFU/mL的創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃水浴包被酶標(biāo)板，陰性血清和陽性血清均采用1∶4 000的稀釋度進(jìn)行間接ELISA檢測，確定交叉反應(yīng)情況。

1.2.2.4 免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)

參照文獻(xiàn)[18]，將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，取出凝膠，漂洗數(shù)秒，將PVDF膜和濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液(0.025 mol/L Tris； 0.192 5 mol/L Gly； 20%甲醇)中濕潤5～ 10 min。按照陰極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-陽極的順序安放好三明治的轉(zhuǎn)運(yùn)槽。冰浴轉(zhuǎn)膜250 mA，1 h。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂牛奶37 °C封閉緩慢振蕩2 h；加入1∶1 500稀釋的純化后的多克隆抗體后在37 °C搖床上孵育1 h，TBST漂洗(4次，每次10 min)，以正常兔血清作為陰性對照；加入用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶8 000倍稀釋)，37 °C緩慢振蕩1 h，室溫TBST漂洗(4次，每次10 min)，最后用HRP-ECL發(fā)光法觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 多克隆抗體的制備及純化

創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果(圖1)可見，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要集中在15～130 kD分子量范圍內(nèi)，共可發(fā)現(xiàn)大約有20條蛋白條帶，其中主要條帶有11條，分子量分別約為112、 84、 77、 72、 60、 56、 50、 46、 42、 36和20 kD，其中56、 36和20 kD條帶最清晰，蛋白濃度高。

經(jīng)Protein G親和層析純化后的抗體SDS-PAGE顯示(圖2)，抗體經(jīng)純化后得到兩個(gè)蛋白條帶，一條55 kD左右的重鏈，一條28 kD左右的輕鏈，無多余條帶，表明純化后的抗體純度較高。

圖1 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

圖2 純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體SDS-PAGE圖譜1：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2：純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。Fig.2 SDS-PAGE image of purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus1：Marker; 2：Purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus.

2.2 多克隆抗體的效價(jià)

用間接ELISA法檢測創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示多克隆抗體效價(jià)為1∶64 000(圖3)，制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體獲得了較高的效價(jià)。

圖3 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價(jià)曲線Fig.3 Titer curve of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

2.3 敏感性

用不同濃度的創(chuàng)傷弧菌液(108、 107、 106、 105、 104、 103和102CFU/mL)為抗原，進(jìn)行間接ELISA測定，結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)菌液濃度為103CFU/mL時(shí)，P/N值為2.15，即為陽性反應(yīng)，該抗體可檢測最低菌液濃度為103CFU/mL。

2.4 交叉反應(yīng)

通過間接ELISA測定，抗體與創(chuàng)傷弧菌反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌有微弱的交叉反應(yīng)，與鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等水產(chǎn)動(dòng)物中常見的病原菌均無交叉反應(yīng)(表3)。

2.5 免疫印跡

用制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白及幾種試驗(yàn)菌株的Western Blot見圖4。Western Blot結(jié)果可見，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌出現(xiàn)了不同程度的免疫反應(yīng)帶；創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白共有7條明顯的免疫反應(yīng)帶，分子量分別約為72、 60、 50、 36、 35、 34和20 kD；溶藻弧菌和副溶血性弧菌的免疫反應(yīng)帶均較弱，溶藻弧菌有2條反應(yīng)帶，副溶血性弧菌有1條反應(yīng)帶；在分子量約為36 kD處，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌均有一條免疫反應(yīng)帶；鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌均無反應(yīng)帶出現(xiàn)。

表2 多克隆抗體敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The result of sensitivity assay of polyclonal antibody

注：“-”為陰性(P/N<2.1)，“+”為陽性(P/N≥2.1)。

表3 多克隆抗體交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The result of cross reaction assay of polyclonal antibody

注：“-”～“++++”表示反應(yīng)強(qiáng)度依次增加的5種程度，其中P/N<2.1為“-”，2.1≤P/N<6.1為“+”，6.1≤P/N<10.1為“++”，10.1≤P/N<14.1為 “+++”，P/N>14.1為“++++”。

圖4 Western Blot分析創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體特性1：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2：創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白；3：溶藻弧菌；4：副溶血性弧菌；5:鼠傷寒沙門氏菌；6：大腸埃希氏菌O157； 7：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；8：金黃色葡萄球菌；9：陰性對照。Fig.4 Western Blot analysis on the character of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus 1：Marker；2：Outer membrane proteins of Vibrio vulnificus；3：Vibrio alginolyticus；4：Vibrio parahaemolyticus；5：Salmonella typhimurium；6：E.coli O157；7：Listeria monocytogenes；8：Staphylococcus aureus；9：Negative serum.

3 討論

創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白與細(xì)菌致病性及免疫保護(hù)性密切相關(guān)，在決定宿主免疫反應(yīng)的特異上起著重要作用[11，19-21]。有研究報(bào)道創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白有較強(qiáng)的抗原性[11，20]，本研究將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。

SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白條帶比較密集，其主要蛋白條帶清晰，分布在15～130 kD之間，與田丁等[11]報(bào)道的創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白帶在14～92 kD之間的結(jié)果不完全一致，只有84、 60和36 kD的蛋白為共同條帶。有研究[22-24]認(rèn)為同種細(xì)菌外膜蛋白的差別可能與細(xì)菌的培養(yǎng)條件、外膜蛋白的制備方法、菌株的致病性和血清型不同有關(guān)。值得注意的是，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要條帶中的36 kD蛋白，已有許多研究證實(shí)其為弧菌外膜蛋白先共有成分[23-26]。

抗體交叉反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌呈現(xiàn)強(qiáng)的陽性反應(yīng)，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌存在較弱的交叉反應(yīng)，與其他試驗(yàn)菌株無交叉反應(yīng)，可見試驗(yàn)制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌具有較高的特異性。使用該多抗檢測創(chuàng)傷弧菌時(shí)，為避免出現(xiàn)假陽性，可對樣品進(jìn)行增菌(增加樣品外膜蛋白豐度)再進(jìn)行檢測。

Western Blot分析顯示，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白中的7條蛋白發(fā)生不等程度的反應(yīng)，可見制備的多克隆抗體不僅能夠識(shí)別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白與其發(fā)生免疫反應(yīng)，同時(shí)說明創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具有較強(qiáng)的抗原性。Western Blot結(jié)果中36 kD位置處創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌都出現(xiàn)了較弱的反應(yīng)帶，交叉試驗(yàn)中同樣具有36 kD外膜蛋白的溶藻弧菌和副溶血性弧菌[23，26]亦與多克隆抗體發(fā)生較弱的交叉反應(yīng)，由此可推測出，雖然創(chuàng)傷弧菌36 kD外膜蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，但反應(yīng)較弱，不具有強(qiáng)抗原性。其他試驗(yàn)菌株均無免疫反應(yīng)帶，同時(shí)結(jié)合交叉反應(yīng)結(jié)果，表明了研究制備的多克隆抗體具有較高的特異性。此外，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與溶藻弧菌、副溶血性弧菌發(fā)生的弱交叉反應(yīng)，說明創(chuàng)傷弧菌與溶藻弧菌、副溶血性弧菌之間可能存在相同的抗原決定簇。如何將產(chǎn)生相同的抗原的外膜蛋白分離出以提高抗體特異性，有待進(jìn)一步的研究。

本研究制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體，抗體純度較高，效價(jià)達(dá)1∶64 000，其與水產(chǎn)品中常見的致病菌無明顯的交叉反應(yīng)，具有較高的特異性和靈敏性，制備相對容易，可為創(chuàng)傷弧菌快速檢測等應(yīng)用提供參考依據(jù)。

[1] 喬華林，章?。畡?chuàng)傷弧菌的致病性及其檢驗(yàn)和測定[J]．水產(chǎn)科學(xué)， 1999，18(4)：28-30.

[2] 吳曉燕，倪侃翔，畢平安，等．創(chuàng)傷弧菌所致敗血癥的報(bào)道[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2007，22(4)：424-428.

[3] 陳艷，付萍．創(chuàng)傷弧菌檢測方法的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊， 2008，35(2)：91-96.

[4] 何閃閃，薛長湖，李兆杰，等．水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的快速檢測與分離[J]．中國食品學(xué)報(bào)， 2005，5(3)：86-90.

[5] 張曉華，Robertson P，Austin B，等．檢測海洋弧菌的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)研究[J]．青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997，27(3):326-332.

[6] 王崇明，楊冰，宋曉玲，等．應(yīng)用雙抗夾心ELISA法檢測皺紋盤鮑致病病原-創(chuàng)傷弧菌的研究[J]．海洋水產(chǎn)研究， 1999，20(1)：30-34.

[7] 李忠明，張延齡，徐德啟,等．當(dāng)代新疫苗[M]．北京：高等教育出版社，2001.

[8] Mao Z J，Yu L，You Z Q，et al．Cloning expression and immunogenicity analysis of five outer membrane proteins ofVibrioparahaemolyticus[J]．Fish Shellf Immunol， 2007，23(3)：567-575.

[9] Koga T，Kawai K．Isolation and characterization of the outer membrane fromVibrioparahaemolyticus[J]．J Gen Microbiol， 1983，129：3185-3196.

[10] 倫鏡盛，張?jiān)O(shè)熙，董亞萍，等．弧菌外膜蛋白OmpU的免疫交叉反應(yīng)性和交叉保護(hù)性[J]．微生物學(xué)報(bào)， 2016，56(5):867-879.

[11] 田丁，林天龍，徐斌福，等．創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的分離及其抗原性分析[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008，23(4)：337-341.

[12] 田丁，徐斌福，林能峰，等．創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白免疫刺激復(fù)合物對歐洲鰻鱺的免疫保護(hù)性分析[J]．水生生物學(xué)報(bào)， 2010，34(2)：431-435.

[13] 李素一，吳唯維，李盼，等.創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆與表達(dá)[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013，28(6)：517-521.

[14] 陳福生，高志賢，王建華．食品安全檢測與現(xiàn)代生物技術(shù)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2004.

[15] 汪家政，范明．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M]．北京：科學(xué)出版社， 2002.

[16] 竇勇，寧喜斌．副溶血弧菌間接ELISA快速檢測法的建立[J]．食品工業(yè)科技， 2007，28(6)：205-209.

[17] 焦奎，張書圣．酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2004.

[18] 朱立平，陳學(xué)清．免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M]．北京：人民軍醫(yī)出版社， 2000.

[19] Suzuki S，Kuroe K，Yasue K，et al．Antigenicity and N-terminal amino acid sequence of a 35kDa prorin-like protein ofListonella(Vibrio)anguillarum：comparison among different serotypes and other bacterial species[J]．Lett Appl Microbiol， 1996，23(5)：303-309.

[20] 田丁，林天龍，徐斌福．創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比較研究[J]．水產(chǎn)科學(xué)， 2011,30(1)：27-30.

[21] 李杰，丁承超，翟續(xù)昭，等．弧菌外膜蛋白OmpK單克隆抗體的制備及其特性[J]．食品科學(xué)， 2017，38(6)：111-116.

[22] 蘇友祿，郭志勛，馮娟，等．赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒主衣殼重組蛋白多克隆抗體的制備[J]．南方水產(chǎn)，2010，6(6)：8-13.

[23] 唐小千，戰(zhàn)文斌，周麗，等．6種海洋致病性弧菌36 kDa外膜蛋白特性分析[J]．中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009，39(2)：197-201.

[24] 張偉妮，周麗，邢婧，等．水產(chǎn)動(dòng)物主要弧菌外膜蛋白結(jié)構(gòu)的比較分析[J]．海洋水產(chǎn)研究， 2008，29(2)：23-27.

[25] 張曉華，Robertson P，Austin B，等．弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株外膜蛋白的比較研究[J]．微生物學(xué)報(bào)，1997，37(6)：449-454.

[26] 周麗，劉洪明，戰(zhàn)文斌，等．鰻弧菌、溶藻膠弧菌外膜蛋白的分離及特性[J]．中國水產(chǎn)科學(xué)，2003，10(1)：31-35.

PreparationandcharacterizationofpolyclonalantibodyagainstoutermembraneproteinsofVibriovulnificus

GU Xiaoli， LI Yongxian， LI Huiqing， CHEN Jiewen， LI Liudong*

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment forAquatic Product on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture)

[Objective] This study aimed to prepare high specific antibody againstVibriovulnificus, and provide references for rapidly screeningVibriovulnificusby immunological method. [Methods] The polyclonal antibody was obtained by injecting the antigen, which was the outer membrane proteins ofVibriovulnificus, to New Zealand rabbits in several times with increasing dose, and purified by protein G affinity chromatography. Indirect ELISA and Western Blot assay were conducted to characterize the titer, sensitivity and specificity of polyclonal antibody. [Results]The polyclonal antibody prepared had high purity, which titer was 1∶64 000. Moreover, the antibody had high specificity forVibriovulnificus. It was no obvious cross reaction with other multiple pathogenic bacteria. The minimum threshold detection limit was 103CFU/mL in pure culture ofVibriovulnificus. Western Blot result showed that the polyclonal antibody could specially identify the outer membrane proteins ofVibriovulnificusand the outer membrane proteins should have good antigenicity. [Conclusion]The polyclonal antibody against outer membrane proteins ofVibriovulnificuswas high specificity and sensitivity, which could be used to rapidly screenVibriovulnificus.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(5):45-50]

Vibriovulnificus; outer membrane protein; polyclonal antibody; Western Blot; ELISA

LI Liudong，168lld@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.007

S91

A

2095-1833(2017)05-0045-06

2017-04-14;接收日期2017-07-10

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015TS18，2009TS02，2015TS15);廣東省水產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)項(xiàng)目(GDSCZA2015009);國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重大專項(xiàng)(GJFP201501003)

古小莉(1982-)，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全，lilet_ku@163.com

李劉冬，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全，168lld@163.com