異丙醇雙水相提取/GC-ECD測(cè)定魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留

鹿?jié)蓡?，陳澤宇，柳璇，劉永明，韓典峰

(1.煙臺(tái)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 山東 煙臺(tái) 264000； 2.西雙版納出入境檢驗(yàn)檢疫局， 云南 西雙版納 666100；3.煙臺(tái)大學(xué)化工學(xué)院， 山東 煙臺(tái) 264000； 4.山東省海洋資源與環(huán)境研究院， 山東 煙臺(tái) 264006)

異丙醇雙水相提取/GC-ECD測(cè)定魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留

鹿?jié)蓡?*，陳澤宇2，柳璇1，劉永明3，韓典峰4

(1.煙臺(tái)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 山東 煙臺(tái)264000；2.西雙版納出入境檢驗(yàn)檢疫局， 云南 西雙版納666100；3.煙臺(tái)大學(xué)化工學(xué)院， 山東 煙臺(tái)264000；4.山東省海洋資源與環(huán)境研究院， 山東 煙臺(tái)264006)

建立了魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留的異丙醇-K2HPO4-H2O雙水相提取-氣相色譜測(cè)定的分析方法。方法研究了異丙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)、凈化劑對(duì)魚(yú)肉中六六六和滴滴涕提取率的影響；確定了六六六的4種異構(gòu)體的線性范圍為0.50～100.00μg/L，滴滴涕的4種異構(gòu)體的線性范圍為1.00～100.00μg/L，魚(yú)肉中六六六、滴滴涕測(cè)定回收率為78.6%～104.2%，檢出限范圍為0.52～1.56μg/kg。該方法快速、高效，適用于魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留的檢測(cè)。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7(5):33-38]

異丙醇；雙水相提??；氣相色譜；魚(yú)肉；六六六；滴滴涕;殘留量

六六六、滴滴涕屬于氯代烴類(lèi)化合物，其性質(zhì)穩(wěn)定，能夠在環(huán)境中持久存在，且可長(zhǎng)距離遷移。該類(lèi)化合物具有致突變、致畸、致癌的效應(yīng)，能夠在生物體內(nèi)蓄積，最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體造成危害[1-2]。雖然六六六、滴滴涕已于1983年禁用，但在食品、藥材等中依然被檢出[3-6]，因此開(kāi)展水產(chǎn)品中有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，建立新型快速的檢測(cè)方法同樣非常重要。目前，魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留分析的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，常用的前處理方法有固相萃取法、液液萃取法、凝膠色譜法等[7-11]。傳統(tǒng)的樣品前處理過(guò)程溶劑和能源消耗量較大，易造成環(huán)境污染，操作步驟也過(guò)于繁瑣，不利于六六六、滴滴涕快速檢測(cè)分析。

雙水相提取技術(shù)作為近幾年發(fā)展起來(lái)的樣品前處理方法，具有試劑消耗量低、能耗小、易操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然藥物提取、農(nóng)藥殘留檢測(cè)、蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)的分離提純等領(lǐng)域[12-15]。雙水相提取技術(shù)多采用丙酮、異丙醇、聚乙二醇等水溶性小分子有機(jī)物與鹽溶液形成雙水相體系，使目標(biāo)物質(zhì)在兩相間選擇性分配，從而達(dá)到分離的目的[16-17]。本方法利用異丙醇-K2HPO4-H2O雙水相提取，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的提取和凈化條件，建立了一種適用于魚(yú)肉中六六六、滴滴涕殘留檢測(cè)的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-2010/ECD氣相色譜儀(日本島津公司)；離心機(jī)(日本日立公司)；JJ-2(2003-61)組織搗碎勻漿機(jī)(常州市國(guó)華電器有限公司)；Milli-Q Gradient超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

正己烷、異丙醇(色譜純?cè)噭?，均?gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水硫酸鎂(分析純，500 ℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)試劑公司)；磷酸氫二鉀(分析純，購(gòu)于上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，分子量為68 000，購(gòu)于上海洛神生物技術(shù)有限公司)；魚(yú)油(500 mL，國(guó)藥星鯊有限公司)；N-丙基乙二胺硅烷粉劑(PSA，粒徑40～50 μm，購(gòu)于安捷倫生物科技有限公司)；C18粉劑(粒徑40～50 μm，購(gòu)于安捷倫生物科技有限公司)；石墨化碳粉劑(GCB，200～400目，購(gòu)于安捷倫生物科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

六六六的4種異構(gòu)體(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC)、滴滴涕的4種異構(gòu)體(p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDT)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度100 μg/mL， 4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存)，均購(gòu)于國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，編號(hào)為SB05-068-2016。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確移取不同體積的上述混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，用正己烷配制成1 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，臨用前正己烷稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2 儀器條件

色譜柱為DB-1毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣(高純N2)流速為3.0 mL/min。色譜柱程序升溫：初始溫度100 ℃，以30 ℃/min升溫至210 ℃，保持4 min;以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7.5 min。檢測(cè)器溫度為280 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃。進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比20。

1.3 樣品前處理

稱取4.00 g魚(yú)肉樣品于50 mL離心管中，加入80%的異丙醇水溶液(V/V)20.0 mL，漩渦混勻1 min，浸泡30 min。再加入2.5 g K2HPO4，漩渦混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，形成雙水相后，轉(zhuǎn)移上層液5.0 mL于15 mL離心管中，加入1.0 g無(wú)水MgSO4和100 mg PSA，渦旋振蕩后5 000 r/min離心5 min。取上清液4.0 mL于新的15 mL離心管中，40 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?，正己?.0 mL定容，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果和討論

2.1 異丙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)六六六、滴滴涕提取率的影響

通過(guò)向6組陽(yáng)性樣品中分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%、 70%、 80%、 90%、 100%的異丙醇水溶液(V/V) 20.0 mL，其余步驟按“1.3樣品前處理”操作，測(cè)定各組六六六、滴滴涕平均提取率。如圖1所示， 80%的異丙醇水溶液(V/V)對(duì)六六六、滴滴涕的提取效率高于其他對(duì)照組，分析原因?yàn)楦唧w積分?jǐn)?shù)的異丙醇水溶液使魚(yú)肉蛋白質(zhì)快速變性，導(dǎo)致六六六、滴滴涕被蛋白質(zhì)包裹，不能有效提??；低體積分?jǐn)?shù)的異丙醇水溶液不能引起魚(yú)肉蛋白質(zhì)徹底變性，同樣導(dǎo)致六六六、滴滴涕的提取效率較低。因此，本方法采用體積分?jǐn)?shù)為80%的異丙醇水溶液作為異丙醇雙水相萃取魚(yú)肉中六六六、滴滴涕的萃取液。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)異丙醇水溶液對(duì)六六六、滴滴涕平均回收率的影響(n=5)Fig.1 The effects of isopropanol alcohol aqueous solution volume-volume percentage on average recoveries of HCHs and DDTs(n=5)

2.2 鹽成分對(duì)雙水相體系提取效果的影響

圖2 不同鹽添加量對(duì)o,p'-DDT平均提收率的影響(n=5)Fig.2 Effects of different content of salt on the average extraction ratio of o,p'-DDT(n=5)

2.3 不同凈化劑對(duì)六六六、滴滴涕提取率的影響

目前，雙水相提取方法常用的凈化試劑有PSA、C18、GCB、高分子多孔微球系列[20-22]，主要干燥試劑為無(wú)水硫酸鎂[22-24]。本方法對(duì)PSA、PSA+GCB (1∶1，m/m)、 PAS+C18(1∶1，m/m)、C18、C18+GCB (1∶1，m/m)5組凈化劑的凈化效果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，各組凈化劑均能有效地去除提取液中雜質(zhì)；C18、 PAS+C18(1∶1，m/m)、 C18+ GCB (1∶1，m/m)為凈化劑時(shí)對(duì)六六六、滴滴涕有一定的吸附作用，提取率偏低；PSA、 PAS+GCB (1∶1，m/m)為凈化劑時(shí)對(duì)六六六、滴滴涕的吸附作用可以忽略，提取率較高(圖3)。經(jīng)過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定100 mg PSA作為凈化劑能有效地去除提取液中雜質(zhì)。

圖3 不同凈化劑對(duì)六六六、滴滴涕回收率的影響(n=5)A為100 mg的PSA；B為100 mg的PSA+GCB(1∶1，m/m)；C為100 mg的PAS+C18(1∶1，m/m)；D為100 mg的C18；E為100 mg的C18+GCB(1∶1，m/m)。Fig.3 Effects of different decontaminants on the average recoveries of HCHs and DDTs(n=5)(A)PSA，100 mg；(B)PSA+GCB(1∶1，m/m)，100 mg；(C)PAS+C18(1∶1，m/m)，100 mg；(D)C18，100 mg；(E)C18+GCB(1∶1，m/m),100 mg.

2.4 方法的線性范圍、檢出限及加標(biāo)回收率

用正己烷分別配制不同質(zhì)量濃度的六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中4種六六六標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為0.50、 1.00、 5.00、 20.00、 100.00 μg/L，4種滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為1.00、 5.00、 10.00、 20.00、 100.00 μg/L，進(jìn)行GC-ECD上機(jī)測(cè)定，結(jié)果表明，六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R均大于0.990(表1)。依本研究確立的方法，對(duì)空白魚(yú)肉低濃度加標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以GC-ECD信噪比≥3為檢出限，得到本方法六六六、滴滴涕檢出限范圍為0.52～1.56 μg/kg。采用本方法在兩個(gè)濃度水平對(duì)空白魚(yú)肉樣品進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定(空白及加標(biāo)譜圖見(jiàn)圖4)，回收率為78.6%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～7.5%。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 魚(yú)肉樣品空白色譜圖(A)與加標(biāo)(5.00 μg·kg-1)色譜圖(B)Fig.4 Blank chromatogram (A) and spiked chromatogram (B, 5.00 μg·kg-1) on fish sample

表1 線性范圍及方程、相關(guān)系數(shù)、保留時(shí)間、檢出限、加標(biāo)水平、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 Linear range and equations, correlation coefficients, retention time, Limit of detection (LOD),spiked levels, average recovery rate and relative standard deviation(RSD)

n=5

3 結(jié)論

本研究建立了異丙醇-K2HPO4-H2O雙水相體系提取，氣相色譜儀測(cè)定魚(yú)肉中六六六、滴滴涕的檢測(cè)方法。方法確立了向樣品中加入20.0 mL 80%的異丙醇水溶液(V/V)和2.5 g K2HPO4形成雙水相體系對(duì)魚(yú)肉中六六六、滴滴涕有較高的提取率，在提取液中添加100 mg PSA顆粒凈化劑可實(shí)現(xiàn)較好的凈化效果。方法中，六六六的4種異構(gòu)體線性范圍為0.50～100.00 μg/L，滴滴涕的4種異構(gòu)體線性范圍為1.00～100.00 μg/L，六六六、滴滴涕的檢出限范圍為0.52～1.56 μg/kg，測(cè)定六六六、滴滴涕在兩個(gè)加標(biāo)水平上回收率為78.6%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～7.5%。該方法有機(jī)試劑使用量少，操作簡(jiǎn)單、高效，適用于魚(yú)肉中六六六、滴滴涕的檢測(cè)。

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DeterminationofHCHsandDDTsinfishbyisopropanolaqueoustwo-phaseextractionandGC-ECD

LU Zeqi1*, CHEN Zeyu2, LIU Xuan1, LIU Yongming3, HAN Dianfeng4

(1.Yantai Agricultural Science and Technology Institute, Yantai 264000, China; 2.Xishuangbanna Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau, Xishuangbanna 666100, China; 3. College of Chemical Engineering, Yantai University, Yantai 264000, China;4. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China;)

A method for the determination of HCHs and DDTs in fish by isopropanol-K2HPO4-H2O aqueous two-phase extraction and gas chromatography was established The method investigates the effects of isopropanol alcohol aqueous solution volume fraction and decontaminants on extraction ratio of HCHs and DDTs. The HCHs showed good linearity in range of 0.50～100 μg/L, and the DDTs showed good linearity in range of 1.00～100 μg/L. The average recovery rate of HCHs and DDTs ranges from 78.6%～104.2% and the limit is 0.52～1.56 μg/kg. In conclusion, the method is rapid, effective and applicative for the analysis of HCHs and DDTs residue in fish [Chinese Fishery Quality and Standards，2017，7(5)：35-38].

isopropanol; aqueous two-phase extraction; gas chromatography electron capture detection (GC-ECD); fish；Hexachloro-cyclohexane (HCHs); Dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDTs);resdiue amount

LU Zeqi, yantgongz@126.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.005

S91

A

2095-1833(2017)05-0033-06

2017-05-22;接收日期2017-07-05

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT-12-08，SDAIT-26-05)

鹿?jié)蓡?1979-)，男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留檢測(cè)，yantgongz@126.com