抗凍保護劑中蔗糖濃度決定卵母細胞脫除抗凍保護劑的方法

周艷華，范安然，黃文竹

（1．貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院；2.貴州醫(yī)科大學 組織工程與干細胞實驗中心，貴陽 貴州 550004）

抗凍保護劑中蔗糖濃度決定卵母細胞脫除抗凍保護劑的方法

周艷華1，范安然1，黃文竹2

（1．貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院；2.貴州醫(yī)科大學 組織工程與干細胞實驗中心，貴陽 貴州 550004）

本研究實驗一采用三種添加不同濃度蔗糖的預(yù)處理液（S1，S2，S3）分別處理小鼠卵母細胞20mim，以PBS溶液或0.5mol/L蔗糖溶液脫除抗凍保護劑，統(tǒng)計卵母細胞的存活率.S1液為含10%v/v的PBS溶液；S2液在S1液的基礎(chǔ)上蔗糖濃度添加至0.034mol/L；S3液在S1液的基礎(chǔ)上蔗糖濃度添加至0.38mol/L.結(jié)果顯示：以PBS液直接脫除抗凍保護劑，S1，S2，S3組卵母細胞的存活率分別為0，20%，54%.以0.5mol/L的蔗糖溶液脫除抗凍保護劑，S1，S2，S3組卵母細胞存活率分別為43%，50%，75%.實驗二所有卵母細胞以 S1液預(yù)處理 3min，然后分別以 ES1，ES2，ES3液處理 30s，采用 PBS，0.25mol/L或 0.5 mol/L蔗糖溶液脫除抗凍保護劑.ES1液為40%v/v的EG溶液中添加了0.3mol/L的蔗糖；ES2液的蔗糖濃度為0.5mol/L；ES3液的蔗糖濃度為0.8mol/L.結(jié)果顯示，隨著蔗糖濃度的提高，卵母細胞以PBS脫除抗凍保護劑的存活率顯著提高（ES3組57%vs ES1組3%）.該研究表明，預(yù)處理液或玻璃化液中添加蔗糖，均能影響卵母細胞脫除抗凍保護劑的方法.結(jié)論，在卵母細胞冷凍實驗中，應(yīng)根據(jù)冷凍液的成分設(shè)計相應(yīng)的抗凍保護劑脫除方法.

卵母細胞；抗凍保護劑；蔗糖濃度；抗凍保護劑脫除

從1985年Rall等發(fā)明玻璃化冷凍以來[1]，該技術(shù)已在小鼠，牛，人等卵母細胞和胚胎冷凍上廣泛應(yīng)用.隨著對玻璃化冷凍原理的研究，玻璃化液也有了較大的改進.其中的主要成分有滲透性抗凍保護劑和非滲透性抗凍保護劑.滲透性抗凍保護劑有二甲基亞砜，乙二醇，丙二醇，丙三醇等；非滲透性抗凍保護劑有聚蔗糖，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖等大分子物質(zhì).非滲透性抗凍保護劑中使用較多的是蔗糖，其不僅在冷凍液中有添加，在解凍液中也是非常必要的添加成分.解凍液中添加蔗糖的作用主要是利用蔗糖在細胞外產(chǎn)生較高的滲透壓，防止解凍時水分過度滲入細胞造成細胞崩解；冷凍液中添加蔗糖一是增加溶液的粘稠度，有利于溶液玻璃化的形成；二是使細胞保持收縮的狀態(tài)，防止抗凍保護劑過多的滲入細胞.在諸多的研究中，冷凍方法多種多樣，解凍方法也多種多樣.多數(shù)研究者分開來探討抗凍保護劑的添加和脫除方案對卵母細胞存活率的影響.作者認為，抗凍保護劑的添加程序決定了其脫除程序.當抗凍保護劑中含有不同濃度的蔗糖時，溶液的滲透壓不同，進而影響細胞的收縮程度，影響抗凍保護劑滲入胞內(nèi)的量.所以本研究設(shè)計了兩個實驗，分別在預(yù)處理液和玻璃化液中添加不同濃度的蔗糖，比較了蔗糖濃度對卵母細胞脫除抗凍保護劑后存活率的影響.由于抗凍保護劑具有一定的毒性，所以脫除抗凍保護劑又稱為脫毒.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠卵母細胞的獲?。哼x擇4—6周齡雌性昆明白小鼠，腹腔注射PMSG（寧波激素廠生產(chǎn)）10U/只，48h后腹腔注射hCG（寧波激素廠生產(chǎn)）10U/只，14h后頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔剪取輸卵管.用剝卵針剝開輸卵管壺腹部，收取卵丘卵母細胞復合體，采用0.03%透明質(zhì)酸酶37℃消化2min，將脫去卵丘顆粒細胞的卵母細胞收集到PBS（Gibco，2012050）溶液中待用.

1.2 預(yù)處理液和玻璃化液的配制

預(yù)處理液和玻璃化液均以PBS液為基礎(chǔ)液，在其中加入不同濃度的乙二醇（EG）和蔗糖（sucrose）.

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1.3 實驗方法

實驗一，選擇排出第一極體形狀規(guī)則的卵母細胞隨機分為6組，每組10枚，各組卵母細胞分別用S1，S2或S3液處理20min，然后分別用PBS或0.5mol/L的蔗糖溶液脫毒，統(tǒng)計各組脫除抗凍保護劑后卵母細胞存活率，實驗重復3次.

實驗二，卵母細胞隨機分為9組，每組卵母細胞經(jīng)S1液預(yù)處理 3min，分別以 ES1，ES2或 ES3液處理 30s，以PBS，0.25mol/L或0.50mol/L的蔗糖溶液脫毒，統(tǒng)計卵母細胞存活率，實驗重復3次.

使用spss統(tǒng)計軟件（spss18）對卵母細胞存活率進行ANOVA單因素方差分析和Duncan’s檢驗方法判斷不同處理組之間的差異顯著性，P＜0.05時即認為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 預(yù)處理液中添加不同濃度蔗糖對卵母細胞脫毒后存活率的影響

注：同一列上標不同字母表示差異顯著（P＜0.05）.

2.2 玻璃化液中添加不同濃度蔗糖對卵母細胞脫毒后存活率的影響

注：同一列上標不同字母表示差異顯著（P＜0.05）.

3 討論

本實驗所用到的S1液為含10%v/v EG的PBS溶液，是玻璃化冷凍中常用的預(yù)處理液，有研究表明，在該溶液中達到平衡時小鼠卵母細胞體積是初始體積的1.1倍[2].S2液是在S1液的基礎(chǔ)上添加了一定量的蔗糖，該濃度下達到平衡時卵母細胞體積等于初始體積；S3液在S1液的基礎(chǔ)上將蔗糖濃度提高至0.38mol/L，該濃度下達到平衡時卵母細胞體積約為初始體積的1/2.為了減少聚蔗糖（Ficoll）的干擾，ES1，ES2，ES3 液除未添加聚蔗糖（Ficoll）外，其組成與其他研究者常用的玻璃化液相同[3].Wang等采用EG作為抗凍保護劑，認為4步添加法結(jié)合2步脫除法可以降低牛卵母細胞經(jīng)受的滲透壓損傷，與1步添加和1步脫除方法相比獲得了較高的存活率和囊胚率[4].Kobayashi等玻璃化冷凍豬胚胎，對2步法脫毒和1步法脫毒進行比較，結(jié)果表明2步法脫毒后可以獲得85%的胚胎存活率，而1步脫毒組僅有40%的存活率[5].這些研究多數(shù)認為分步脫毒法可以降低細胞脫毒時的滲透壓損傷，從而獲得較高的存活率.事實上，抗凍保護劑的脫除程序與抗凍保護劑的添加程序是密切相關(guān)的，針對特定的抗凍保護劑添加過程應(yīng)該采取對應(yīng)的脫毒步驟[6].實際應(yīng)用中遵循“越簡單越實用”的原則.抗凍保護劑的脫除過程越簡單，越易于實際操作.脫毒時需要多高濃度的蔗糖取決于抗凍保護劑添加過程中有多少抗凍保護劑滲入到胞內(nèi).冷凍液中添加蔗糖可以增加玻璃化液的粘稠度，有利于玻璃化的形成；同時蔗糖可以使細胞收縮，減少抗凍保護劑過度滲入胞內(nèi).但是抗凍保護劑中添加過高濃度的蔗糖會占據(jù)溶液較大的體積，導致溶液中滲透性抗凍保護劑的相對濃度升高，增加溶液毒性.本實驗室前期實驗表明，玻璃化液中添加0.8mol/L的蔗糖相對于0.5mol/L蔗糖添加組，牛囊胚冷凍存活率顯著降低，19%vs83%（數(shù)據(jù)未發(fā)表）.本實驗中，在設(shè)計的蔗糖濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度的增加，以PBS或蔗糖溶液脫毒后卵母細胞存活率均有所升高.理想情況下，最簡單的脫毒方法是采用PBS直接脫毒.通過本實驗證明，抗凍保護劑中添加一定濃度的蔗糖可以降低卵母細胞脫毒時的滲透壓損傷，增加卵母細胞存活率，預(yù)示采用PBS直接脫毒的解凍方法具有可行性.

〔1〕Rall,W.F.and G.M.Fahy,Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196 C by vitrification.1985.

〔2〕Pedro P B,Yokoyama E,Zhu S E,et al.Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants[J].Journal of Reproduction&Development,2005,51(2):235.

〔3〕Jin B,Mochida K,Ogura A,et al.Equilibrium vitrification of mouse embryos at various developmental stages[J].Molecular Reproduction&Development,2012,79(11):785–794.

〔4〕Wang,X.,Al Naib,A.,Sun,DW.,et al.,Membrane permeability characteristics of bovine oocytes and development of a step-wise cryoprotectant adding and diluting protocol.Cryobiology,2010.61(1):58-65.

R714；S814.48

A

1673-260X（2017）10-0081-02

2017-07-12

貴州省科技計劃項目(2017-16)

黃文竹（1983-），女，博士，講師，貴州醫(yī)科大學，研究方向：生物信息學，E-mail：2008elite@163．com