高靈敏度大腸菌群測試片法與多管發(fā)酵法檢測海水中糞大腸菌群的比較研究

韓朝國，董煒峰，楊畢鋮，李蔚萍

(國家海洋局廈門海洋環(huán)境監(jiān)測中心站 廈門 361008)

高靈敏度大腸菌群測試片法與多管發(fā)酵法檢測海水中糞大腸菌群的比較研究

韓朝國，董煒峰，楊畢鋮，李蔚萍

(國家海洋局廈門海洋環(huán)境監(jiān)測中心站 廈門 361008)

糞大腸菌群是海水浴場水質狀況的重要檢測指標，傳統(tǒng)檢測方法以多管發(fā)酵法為主，其方法較為成熟，但耗時較長、操作繁瑣；高靈敏度大腸菌群測試片法獲國際官方認證，我國也已將其納入標準方法。文章以廈門海水浴場的水質檢測為例，開展2種方法的對比實驗，結果表明：2種方法對糞大腸菌群的檢測結果基本一致；高靈敏度大腸菌群測試片法具有簡便、快速和省力的優(yōu)點，更加適用于日常檢測工作。

高靈敏度大腸菌群測試片法；多管發(fā)酵法；糞大腸菌群；海水浴場；海水質量

糞大腸菌群主要來源于人類和其他動物排泄的糞便，隨著雨水和污水等的排放進入海水中，對沿海的海水浴場造成污染，進而對人體產生危害。糞大腸菌群是海水浴場水質檢測的指標之一，是評價海水浴場質量的重要依據。

目前在我國海水浴場中檢測糞大腸菌群含量的方法主要是依據《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.7—2007)[1]的多管發(fā)酵法。國內于20世紀80年代初即開始運用多管發(fā)酵法對海水中的糞大腸菌群進行初步研究和檢測，該方法具有較為成熟、原理簡單、利于推廣和費用低等優(yōu)點[2]，但也存在一些缺點：實驗操作步驟繁瑣，需進行初發(fā)酵和復發(fā)酵2個過程；培養(yǎng)周期長，1個培養(yǎng)過程需要48 h；前期的培養(yǎng)液配置和培養(yǎng)后的樣品處理等都需耗費大量人力。因此，很難適應現(xiàn)代化快速檢測海水浴場水質的需求。

PetrifilmTM高靈敏度大腸菌群測試片法經過長期的研究、改進和使用，目前已趨于成熟，是國際上獲得官方認證的方法[3-4]；其具有操作簡便、培養(yǎng)時間短和節(jié)省人力等優(yōu)點[5]，但也存在對環(huán)境要求較高和測試片價格較高等缺點。測試片法目前主要運用于食品、生活飲用水、疾病防控等領域的糞大腸菌群檢測，我國也出臺了相應的方法和標準[6]，很多學者都對其進行了相關研究，然而在海洋環(huán)境檢測中將測試片法運用于糞大腸菌群檢測的研究相對較少。在2013年發(fā)布的《海洋監(jiān)測技術規(guī)程》(HY/T 147.5-2013)[7]中首次將測試片法作為標準方法用于檢測海洋環(huán)境中的糞大腸菌群，同時測試片直接計數法也被作為仲裁法。本研究比較高靈敏度大腸菌群測試片法和多管發(fā)酵法的檢測結果，為今后快速檢測海洋環(huán)境中的糞大腸菌群提供參考依據。

1 實驗操作

1.1 藥品試劑和實驗儀器

本研究采用的藥品試劑主要包括：高靈敏度大腸菌群測試片(廈門泰京生物技術有限公司)、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限公司)、E-TEC瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限公司)和碳酸鈉溶液(稱取10.6 g碳酸鈉溶于蒸餾水，并定容到100 mL自制)。

采用的實驗儀器主要包括：高壓滅菌鍋(HIRAYAMA，型號HV-50)和電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海榮豐科學儀器有限公司，型號LRH-250)。

1.2 操作方法

分別按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.7—2007)[1]中的多管發(fā)酵法和《海洋監(jiān)測技術規(guī)程》(HY/T 147.5—2013)[7]中的測試片法，對3個站位、7個航次和21個樣品的糞大腸菌群進行測定。

1.2.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法的原理是大腸菌群在37℃或44℃條件下繁殖時能使乳糖發(fā)酵，并能使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液在變黃的同時產生氣泡[8]；海水檢驗采用44℃培養(yǎng)法。

(1)初發(fā)酵實驗。采用無菌操作的方法，等量吸取10 mL經充分搖勻的水樣，分別加入5支各盛有5 mL已滅菌的3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中；等量吸取1 mL經充分搖勻的水樣，分別加入5支各盛有10 mL已滅菌的單倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中；吸取1 mL水樣注入盛有9 mL已滅菌的清潔海水的試管中并搖勻。另換吸量管等量吸取此種稀釋水樣1 mL，分別加入5支各盛有10 mL已滅菌的單倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中；充分混勻后，將試管置于44℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。

(2)復發(fā)酵實驗。經培養(yǎng)24 h后，將產酸產氣和只產酸的發(fā)酵管用無菌環(huán)轉接入EC培養(yǎng)液中，搖勻后置于44℃±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h±2 h。

(3)結果判讀。在此期間所得產氣的陽性管即證實有糞大腸菌群存在；依據陽性管數，查最近似值(MPN)表可得每100 mL水樣中糞大腸菌群的最近似值，將此數值乘以10，即求得每升水樣中糞大腸菌群數。

1.2.2 測試片法

測試片法的原理是，大腸菌群測試片是預先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有標準的平板計數培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠和特異性指示劑[9]；其在44.5℃條件下可繁殖發(fā)酵乳糖而產生氣泡，同時產酸使指示劑變紅色，以檢驗糞大腸菌群。

(1)接種和培養(yǎng)。將測試片置于超凈工作臺上，揭開上層膜，用移液器吸取樣品5 mL垂直滴加在測試片中央處，每個樣品做2個平行，將上層膜緩慢蓋下以避免氣泡產生；將壓板放置在上層膜中央處輕輕壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)面上，靜置2～5 min使其凝固；置于44.5℃±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h±2 h。

(2)菌落計數和判讀。用目視和放大鏡來計數，將計數結果乘以200即求得每升水樣中糞大腸菌群數。在測試片上，紅色有氣泡的菌落可確認為糞大腸菌群，圓形培養(yǎng)面邊緣上和邊緣外的菌落不作計數；出現(xiàn)大量氣泡、大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色，表明濃度過高需要稀釋。

1.3 站位布設

采樣地點選取廈門環(huán)島東路黃厝海水浴場。該浴場由于沙灘長度較長、地勢較平坦，游泳愛好者和人員流動較多，適合作為采樣點。在黃厝海水浴場均勻布設3個采樣站位，從北到南分別為D29、D30和D31。

2 結果分析

按照上述實驗操作方法，采用多管發(fā)酵法和高靈敏度大腸菌群測試片法，分別對3個站位、7個航次和21個樣品進行檢測(表1)。

表1 樣品檢測結果

由表1可以看出，同一個樣品通過高靈敏度大腸菌群測試片法和多管發(fā)酵法檢測糞大腸菌群的結果數據存在差異，主要是2種方法的結果表示存在差異：高靈敏度大腸菌群測試片法的結果表示是CFU/L，即每升樣品中含有的細菌菌落總數，1個菌落可能由1個細菌形成，也可能由1簇細菌形成；多管發(fā)酵法的結果表示是個/L，即用概率論推算出樣品中菌數最近似的數值；因此高靈敏度大腸菌群測試片法測得的結果可能偏低，檢測結果也顯示如此。但2種方法的檢測結果基本在1個數量級上，且測試片法測得的結果都落在大腸菌群檢數表的95%可信限值內，因此采用2種方法檢測糞大腸菌群的結果基本一致。同時可以看出，2種方法在不同時段和不同站位的檢測結果相關性不高，無顯著差異。

3 結論

通過對2種方法的實驗對比，高靈敏度大腸菌群測試片法和多管發(fā)酵法的檢測結果基本一致。高靈敏度大腸菌群測試片法的優(yōu)點為：易于操作，只需簡單培訓就能掌握操作方法；培養(yǎng)時間短，較多管發(fā)酵法可從48 h縮短至24 h；節(jié)省人力，不需試劑配制和培養(yǎng)液處理等工作，可大幅度減少實驗人員的工作量。

海水浴場的水質直接影響游客的身心健康，以糞大腸菌群為指示物的微生物污染情況是國內外浴場水質評價的重要指標之一[10]。從長遠看，海水浴場的水質檢測工作需要更加快速、簡便、有效的檢測手段[11]，高靈敏度大腸菌群測試片法能滿足這一需求。

[1] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近岸污染生態(tài)調查和生物監(jiān)測：GB 17378.7—2007[S].北京：中國標準出版社,2007.

[2] 高銘澤.淺談糞大腸菌群的幾種檢測方法[J].科研，2015(27):274，286.

[3] 劉秀梅，盧行安，顧其芳，等.AOAC991.14 PetrifilmTM大腸菌群測試片法與 GB4789.3 大腸菌群計數法的比較研究[J].中國食品學報，2010,10(6):167-172.

[4] 盧行安，顧其芳，袁寶君，等.AOAC PetrifilmTM菌落總數測試片法與食品中菌落總數測定國標方法的比較研究[J].中國食品學報，2011,11(3):164-167.

[5] 高獻禮，李超，李英，等.3M測試片法和國標法檢測香料香精中大腸菌群結果的比較[J].食品研究與開發(fā)，2006,27(6):132-133.

[6] 俞漪.食品微生物測試片標準法和國標法的比較研究[J].農產品加工學刊，2012,10(10):138-140,148.

[7] 國家海洋局.海洋監(jiān)測技術規(guī)程第5部分：海洋生態(tài)：HY/T 147.5-2013[S].北京：中國標準出版社,2013.

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[9] 譚和平,葉德萍,沈興中，等.生活飲用水3M PetrifilmTM菌落總數測試片法的不確定度評定[J].中國測試，2012,38(1):52-55.

[10] 李銘巾，李哲民.大連市棒棰島海水浴場夏季水質狀況分析及建議[J].環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2014,39(6):181-183.

[11] 孫霞，蔣廉華，盧新.3種方法檢測食品中菌落總數的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014,24(9):1250-1251，1254.

AComparativeStudyontheDetectionofFecalColiforminSeawaterbyHighSensitivityColiformTestSliceMethodandMulti-tubeFermentationMethod

HAN Chaoguo，DONG Weifeng，YANG Bicheng，LI Weiping

(Central Marine Environmental Monitoring Station of Xiamen,SOA,Xiamen 361008,China)

Fecal coliform is an important detection index for the quality of seawater baths,the traditional method is mature and based on the multi-tube fermentation,but it takes a long time and the operation is tedious.High sensitivity coliform test method has been accepted by the international authorities,and this method has been incorporated into the standard method in China.This paper took the water quality test of Xiamen seawater bathing as an example,to carry out the comparison experiment of two methods.The study showed that the two methods of fecal coliform test results are consistent well.High sensitivity coliform test method has the advantages of easy operation,high efficiency and labor-saving,and more suitable for daily testing as well.

High-sensitivity coliform test piece,Multi-tube fermentation,Fecal coliform,Seawater bath,Seawater quality

X834

A

1005-9857(2017)10-0068-04

2017-03-01；

2017-08-12

韓朝國，助理工程師，研究方向為海洋環(huán)境監(jiān)測和分析