阿魏酸鈉對MCAO小鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用

●李廣意 趙娟

阿魏酸鈉對MCAO小鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用

●李廣意 趙娟

目的：觀察阿魏酸鈉對MCAO小鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用Caspase-3表達(dá)的影響。方法：采用線栓法阻塞小鼠大腦中動脈（middlcerebralartery,MCAO）建立局灶性腦缺血實驗?zāi)Ｐ停^察阿魏酸鈉（sodium ferulate,SF）灌胃及腦缺血再灌注損傷后小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分及腦梗死體積的影響；分別采用TTC染色、FJB染色細(xì)胞凋亡的數(shù)量改變。結(jié)果：TTC染色顯示空白組未見腦梗死灶,模型對照組、阿魏酸鈉組腦梗死體積百分比分別有改善。FJB結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡減少。結(jié)論：阿魏酸可降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并可通過抗氧化和抗凋亡作用協(xié)同起到保護(hù)作用。

缺血再灌注；阿魏酸；腦梗死率

由于老齡化人口的增加，腦血管病的發(fā)病率急劇增高，腦血管疾病也是危害人類健康的主要疾病之一[1],在腦血管性疾病當(dāng)中又以缺血性血管疾病最為常見,深入了解缺血性腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)過程及其臨床表現(xiàn)是正確預(yù)防和治療腦血管性疾病的前提[2]，根據(jù)腦缺血發(fā)生的原因不同可以分為腦血栓形成,腦栓塞及血液動力學(xué)障礙引起的腦缺血.根據(jù)腦缺血的嚴(yán)重程度可分為完全性腦缺血和不完全性腦缺血(腦供血不足).充分認(rèn)識腦血管病的嚴(yán)重性，提高腦血管病的治療與預(yù)防水平、降低腦中風(fēng)的發(fā)病率、致殘率和死亡率是當(dāng)務(wù)之急[3]。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

健康昆明小鼠（湖南期萊克景達(dá)實驗動物公司）提供，TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）購自南京建成科技有限公司，阿魏酸(sodiumferulate SF)購自aladdin industrial corporation。用生理鹽水配制成阿魏酸鈉。

1.2 實驗動物分組及給藥方法

分組與模型制備：健康昆明小鼠60只，體重為（28±5）g，雄性，隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、模型對照組、阿魏酸鈉組(5ml/kg)、每組20只，模型進(jìn)行后神經(jīng)行為學(xué)評分分；腦梗死體積的測定；小鼠造模2h后灌胃，灌胃量均為5ml/kg，2次/d，連續(xù)7d，而模型對照組給予等體積生理鹽水。

1.3 動物模型制備過程

動物模型制備：取長2cm魚線,在距一端0.7cm處做一標(biāo)記。采用線栓造模方法并進(jìn)行部分改良[1]，具體操作步驟如下：用三溴乙醇和阿托品對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，再在頸部正中切口。用鑷子剝離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）。假手術(shù)正常組即到此為止。分別用彈性橡皮阻斷CCA和 ECA主干的近心端，阻斷血流，同時在CCA處留一根手術(shù)線以備用。在ECA近CCA分叉口處用銀針扎一小口，將預(yù)先處理過的魚線插入,用鑷子輕輕將魚線沿ECA、ICA，送入大腦中動脈（MCA）起始部，直至感覺有輕微阻力時停止，此時大腦中動脈主干血流已經(jīng)中斷。用手術(shù)線扎緊以固定魚線。此時魚線插入深度約為0.7cm。用100w的燈泡照射小鼠以保持體溫。缺血1h后，將魚線拔出，恢復(fù)血流，實現(xiàn)缺血再灌注。術(shù)畢縫合頸部皮膚。

1.4 造模成功指標(biāo)

待小鼠麻醉清醒后，用按照Longada等的五分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評分；無明顯神經(jīng)損傷癥狀為0分，不能完全伸展對側(cè)前爪為1分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，向?qū)?cè)傾倒為3分，不能自發(fā)行走、意識喪失為4分。1-3分者則為造模成功，留用。0分或4分者則為造模不成功。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

各組小鼠均出現(xiàn)右側(cè)Horner征；左側(cè)前肢不能前伸，爬行時向左側(cè)傾倒或向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；排除0分、4分的小鼠，將神經(jīng)功能缺損評分為1-3分的小鼠保留，納入統(tǒng)計分析。

2.2 對小鼠腦梗死體積的影響

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積的比較(n=10,x±s )

2.3 TTC染色觀察梗死體積

圖1 生理鹽水組

圖2 阿魏酸鈉組

2.4 FJB染色

圖1 生理鹽水組

圖2 阿魏酸鈉組

3 結(jié)論

在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，動物的體重應(yīng)選擇在25g以上健康的小鼠。縮短手術(shù)時間和準(zhǔn)確掌握魚線進(jìn)位深度和角度是模型成功的關(guān)鍵，該法操作相對簡便，節(jié)省了時間。并在Zea Longa法介紹[4]的線栓造模方法進(jìn)行改良，采用彈性橡皮阻斷CCA 血流，減少對血管的損傷。同時采用銀針扎口，使血管開口口徑小而明顯，便于魚線插入。手術(shù)會導(dǎo)致動物活動次數(shù)減少、飲食困難，進(jìn)而使小鼠死亡率上升。在術(shù)后給小鼠灌以葡萄糖水，以及時補(bǔ)充能量，提高術(shù)后小鼠的存活率。海馬是認(rèn)知、學(xué)習(xí)功能的重要腦區(qū)，又是腦缺血時損傷最敏感部位[5]。如果能提高SF的濃度，增加其在海馬中的含量，將大大有助于SF發(fā)揮中樞神經(jīng)的保護(hù)作用。本實驗通過神經(jīng)學(xué)評分SF對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，阿魏酸鈉組灌胃7d后具有明顯的促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，并能明顯減小腦梗死體積，對小鼠神經(jīng)損傷均能起保護(hù)作用，其改善缺血再灌注后腦組織梗死神經(jīng)功能損傷的機(jī)制可能與清除氧自由基有關(guān)。

（作者單位：長沙醫(yī)學(xué)院科研實驗中心）

[1]廖維靖,劉淑紅,范明,等.線栓阻斷大鼠總動脈制作缺血性腦損傷模型的改良[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2002,24(6):345-348.

[2].Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without eraniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1);84-91.

[3]李廣意,曾杰,趙娟等小鼠活體灌注顯示細(xì)微腦血管的方法[J].解剖學(xué)雜志,2013,36(3):20.

[4]迪麗努爾·沙比托夫,朱毅忠紅花黃色素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2006,13(2):128.

[5]周琴,廖維靖,楊萬同等阿魏酸鈉促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注后神-血管生成作用的研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2006,21(3):33.

李妍

李廣意（1977～），女，實驗師，研究方向為神經(jīng)解剖學(xué)。

湘財教指〔2015〕54號15C0146長醫(yī)研[2014]2號KY201440

湘財教[2014]85號14C0130