不同血氧飽和度影響主肺動(dòng)脈壓力變化的離體血管模型研究

溫彬，劉垚，孟健，李勇男，唐躍，潘湘斌

不同血氧飽和度影響主肺動(dòng)脈壓力變化的離體血管模型研究

溫彬，劉垚，孟健，李勇男，唐躍，潘湘斌

目的：建立不同血氧飽和度影響主肺動(dòng)脈壓力變化的離體模型，為進(jìn)一步探索肺動(dòng)脈高壓機(jī)制提供研究平臺(tái)。

方法：取新西蘭大耳白兔20只，隨機(jī)選取5只作為正常對(duì)照組。其余15只分離肺動(dòng)脈后將血管置于培養(yǎng)液中，并接入體外循環(huán)系統(tǒng)；以新鮮肝素化兔血灌流培養(yǎng)48 h，灌注壓力維持40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；期間通過(guò)調(diào)節(jié)膜肺給氧量控制血氧飽和度，建立3個(gè)模型組（n=5）：高飽和度組（90%～100%）、中飽和度組（65%～75%）、低飽和度組(40%～50%)。轉(zhuǎn)流結(jié)束后獲取離體血管和正常對(duì)照組兔肺血管行病理形態(tài)分析、肺動(dòng)脈組織IPP6.0定量分析以及勻漿一氧化氮含量分析比較。

結(jié)果：3個(gè)模型組轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間均達(dá)到48 h，壓力穩(wěn)定控制在40 mmHg，血氧飽和度由高到低分別為（97.94±1.01）%、（72.14±12.85）%、（43.83±8.71）% （P＜0.05）。病理分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈相比，3個(gè)模型組離體培養(yǎng)的肺動(dòng)脈管壁均明顯增厚；隨著血氧飽和度降低，3個(gè)模型組離體培養(yǎng)的肺動(dòng)脈彈力纖維逐漸增多、增粗,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立了不同血氧飽和度影響主肺動(dòng)脈壓力變化的離體血管模型。

高血壓，肺性；模型，心血管；血氧飽和度

完全型大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（transposition of great arteries，TGA）是一種左右心室和主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈位置異常的疾病。我們?cè)谂R床工作中發(fā)現(xiàn)，合并室間隔缺損（vascular septal defect，VSD）的大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（TGA）所致的肺動(dòng)脈高壓比單純VSD導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓具有更好的手術(shù)適應(yīng)證[1]。進(jìn)一步活檢發(fā)現(xiàn)，在相同的肺動(dòng)脈壓力下，TGA患者肺血管重構(gòu)程度較輕[2]，可能與TGA患者肺動(dòng)脈連接于解剖左心室、肺動(dòng)脈內(nèi)血氧飽和度異常增高有關(guān)。

上述發(fā)現(xiàn)為研究肺動(dòng)脈高壓提供了新的方向，但是，難以在人體上進(jìn)一步探索發(fā)生機(jī)制，急需構(gòu)建動(dòng)物模型提供研究平臺(tái)。由于TGA患者心臟結(jié)構(gòu)改變巨大，影響肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展的因素極為復(fù)雜，目前少有動(dòng)物模型能夠模擬。為了模擬不同血氧飽和度所產(chǎn)生的差異性，我們建立了一種新型離體血管模型，在恒定壓力下體外培養(yǎng)主肺動(dòng)脈，同時(shí)通過(guò)膜肺給氧調(diào)控血氧飽和度，以研究不同血氧飽和度對(duì)高壓環(huán)境下肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由心血管植入材料臨床前研究評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成（依托單位中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。選取成年健康雄性新西蘭大耳白兔20只，清潔級(jí)，體重2.5 kg左右(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，隨機(jī)選取5只作為未灌注培養(yǎng)的正常對(duì)照組，其余15只依據(jù)離體血管培養(yǎng)時(shí)的血氧飽和度隨機(jī)分為3個(gè)模型組（n=5）：高飽和度組(90%～100%)、中飽和度組(65%～75%)、低飽和度組 (40%～50%)。

離體血管制備：稱重，經(jīng)兔耳緣靜脈分別注射1%肝素鈉溶液(200 U/kg)，3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）。麻醉滿意后仰臥固定，胸腹部備皮，消毒，剪開(kāi)腹壁，暴露下腔靜脈。16G套管針穿刺下腔靜脈，50 ml無(wú)菌注射器采血，注入一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司）中待用。取血后，向上延長(zhǎng)腹部切口，解剖暴露胸腔，迅速聯(lián)合摘取心肺并置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在此過(guò)程中注意不損傷肺動(dòng)脈。無(wú)菌培養(yǎng)皿放入冰盒內(nèi)，精細(xì)分離主肺動(dòng)脈及左右肺動(dòng)脈，剪去纖維結(jié)締組織和肺組織。分別經(jīng)右心室和肺血管分支遠(yuǎn)端插入一次性動(dòng)脈插管，插管不宜深入，以免損傷血管內(nèi)皮，3-0絲線綁扎連接處。弱勢(shì)血管分支端留置22G套管針并連接powerlab生理記錄儀，用于循環(huán)壓力監(jiān)測(cè)。各分支置管完畢后剪去心臟和其余肺組織。

循環(huán)回路構(gòu)建：離體血管循環(huán)系統(tǒng)（圖1）包括動(dòng)物體外循環(huán)配套回流室及管路（東莞科威醫(yī)療用品公司）、滾壓泵（德國(guó)Stockert）、特制動(dòng)物膜肺（東莞科威醫(yī)療用品公司）、光學(xué)血氧飽和度監(jiān)測(cè)接頭（美敦力Biotrend氧飽和度儀）?；亓魇揖嚯x體血管高度約為30 cm，維持壓力恒定。滾壓泵轉(zhuǎn)速均勻，提供平穩(wěn)血流。膜肺進(jìn)氣口連接空氧混合器并接入中心供氣系統(tǒng)，提供穩(wěn)定濃度和流量的氧氣。離體血管置于DMEM高糖培養(yǎng)液中（包含100 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 μg/L的兩性霉素B、5%的胎牛血清），并置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）中，設(shè)定溫度37℃，二氧化碳濃度為5%。

圖1 離體血管循環(huán)模式圖

轉(zhuǎn)流過(guò)程：管道連接完畢，1%肝素鈉溶液預(yù)充排氣。接入離體血管，設(shè)定灌注壓力40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），經(jīng)回流室逐步換入新鮮肝素化兔血。如圖1所示，滾壓泵將血液從回流室泵出，流經(jīng)血栓過(guò)濾器、膜肺、血氧飽和度監(jiān)測(cè)點(diǎn)、離體血管后回流至回流室。根據(jù)光學(xué)血氧飽和度儀顯示數(shù)值間斷開(kāi)閉空氧混合器給氧，維持血氧飽和度恒定。每6 h更換全血，每24 h更換培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集：轉(zhuǎn)機(jī)開(kāi)始后，每小時(shí)于離體血管前三通閥處抽取1 ml血液做血?dú)夥治觯ㄑ排鄆Stat-300便攜式血?dú)夥治鰞x），記錄整個(gè)轉(zhuǎn)流過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)血氧飽和度值。

標(biāo)本采集：持續(xù)灌注48 h后，取下離體血管，以4℃磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)沖洗。洗凈后，部分管壁組織浸泡于10%中性福爾馬林中，固定24 h備用。對(duì)固定好的血管組織常規(guī)進(jìn)行蠟塊包埋，切片，采用彈力纖維、肌纖維、膠原纖維三色染色，用于評(píng)價(jià)肺血管重構(gòu)病變。另取剩余標(biāo)本勻漿處理后檢測(cè)一氧化氮含量，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS24.0進(jìn)行處理和數(shù)據(jù)分析，對(duì)轉(zhuǎn)流過(guò)程中不同組別的血氧結(jié)果采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3個(gè)模型組離體血管轉(zhuǎn)機(jī)結(jié)果：3組離體血管轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間均達(dá)到48 h，轉(zhuǎn)機(jī)過(guò)程中無(wú)破裂，無(wú)漏血滲血，剪開(kāi)管壁未見(jiàn)附壁血栓形成。

3個(gè)模型組血氧飽和度和血氧分壓結(jié)果（表1）：3組血氧飽和度和血氧分壓數(shù)值之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。血氧飽和度結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，該模型可以建立循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)血氧飽和度梯度。

表1 3個(gè)模型組血氧飽和度和血氧分壓結(jié)果（n=5，±s）

表1 3個(gè)模型組血氧飽和度和血氧分壓結(jié)果（n=5，±s）

注：與高飽和度組比較*P＜0.05，與中飽和度組比較△P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

項(xiàng)目 高飽和度組 中飽和度組 低飽和度組血氧飽和度 (%) 97.94±1.01△ 72.14±12.85* 43.83±8.71*△血氧分壓 (mmHg) 174.15±28.65△ 42.15±14.35* 20.85±10.13*△

正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈和3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈的病理形態(tài)分析（圖2、表2）：肉眼觀察：相比于正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈，3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈均出現(xiàn)管壁增厚，管壁通透度下降。鏡下觀察（圖2）顯示：3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織以中膜增厚為主。采用自動(dòng)圖像分析軟件(Image Pro Plus6.0)進(jìn)行定量分析顯示（表2）：隨著血氧飽和度降低，3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈中膜層彈力纖維（黑色）增多、變粗、變長(zhǎng)，分布密集；相比于正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈，3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈肌纖維（黃色）、膠原纖維（粉紅色）均明顯增加（P均＜0.05）。

圖2 正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈和3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織病理染色結(jié)果(n=5，×20)

表2 正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈和3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織IPP6.0定量分析結(jié)果(n=5,±s）

表2 正常對(duì)照組兔肺動(dòng)脈和3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織IPP6.0定量分析結(jié)果(n=5,±s）

注：與高飽和度組比較*P＜0.05，與中飽和度組比較△P＜0.05，與低飽和度組比較▲P＜0.05

分組 管壁厚度 (μm) 彈力纖維 (pixel) 肌纖維 (pixel) 膠原纖維 (pixel)正常對(duì)照組 233.50±12.96*△▲ 8 697.3±467.3*△▲ 8 149.3±419.6*△▲ 6 661.7±676.5*△▲高飽和度組 390.02±7.25△▲ 10 600.3±348.2△▲ 9 701.0±214.4△▲ 14 661±855.4△▲中飽和度組 450.35±19.13*▲ 31 531.3±1 465.0*▲ 10 462.3±359.4*▲ 17 252.7±765.2*▲低飽和度組 548.17±6.16*△ 66 115.7±5 713.0*△ 14 139.0±598.8*△ 21 874.3±1 296.3*△

3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織勻漿一氧化氮含量分析結(jié)果（圖3）：隨著血氧飽和度水平降低，高飽和度組、中飽和度組、低飽和度組肺動(dòng)脈組織勻漿一氧化氮含量逐漸升高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖3 3個(gè)模型組離體培養(yǎng)肺動(dòng)脈組織勻漿一氧化氮含量比較（n=5）

3 討論

雖然多年來(lái)對(duì)缺氧或高氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓進(jìn)行了大量研究，但是血氧飽和度對(duì)肺動(dòng)脈高壓的影響與缺氧或高氧對(duì)肺動(dòng)脈高壓的影響并不相同。因?yàn)榧词刮爰冄酰７蝿?dòng)脈內(nèi)的血氧飽和度仍會(huì)基本維持在76%的正常水平，不會(huì)像TGA那樣能增高到接近100%[2]。正常情況下，肺循環(huán)和體循環(huán)是串聯(lián)的，而TGA將兩個(gè)循環(huán)變?yōu)椴⒙?lián)：肺循環(huán)的氧合血進(jìn)行重復(fù)循環(huán)，可以維持血氧飽和度接近100%；體循環(huán)的非氧合血引起組織缺氧，使左右心室負(fù)荷加重。合并有VSD或者動(dòng)脈導(dǎo)管未閉的TGA患者因生后肺動(dòng)脈壓下降，形成體-肺循環(huán)分流，肺循環(huán)血量逐漸增多，逐漸形成肺動(dòng)脈高壓[3]，其病理表現(xiàn)為：肺血管壁明顯增厚，尤其以中膜增厚最為明顯，彈力纖維增多增粗[4,5]。隨著肺血管重構(gòu)加重，一氧化氮水平升高，可能是離體血管的急性代償反應(yīng)[6,7]：飽和度降低導(dǎo)致肺血管重構(gòu)趨于明顯，同時(shí)缺氧導(dǎo)致一氧化氮合酶分泌增多[8]，管壁代償性分泌一氧化氮以減輕肺動(dòng)脈高壓形成。

本研究通過(guò)構(gòu)建離體模型模擬類似的病理生理改變，模型由體外組織培養(yǎng)和體外循環(huán)灌注兩部分構(gòu)成。組織培養(yǎng)技術(shù)至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究中廣泛采用的技術(shù)方法。將離體組織放入配置好的培養(yǎng)液中，并置于二氧化碳恒溫箱內(nèi)模擬生物體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，可以維持細(xì)胞活性。Lehoux等[9]將離體頸動(dòng)脈置于DMEM高糖培養(yǎng)液中并給予不同壓力灌注，研究了高血壓發(fā)生機(jī)制。另一方面，體外循環(huán)技術(shù)是心臟外科領(lǐng)域非常成熟的技術(shù)。滾壓泵可以維持平穩(wěn)血流和保持壓力恒定，膜肺用于氧合血液，同時(shí)排除二氧化碳，維持循環(huán)內(nèi)氧飽和度穩(wěn)定。

本研究通過(guò)調(diào)節(jié)回流室距離離體血管的高度[10]和滾壓泵轉(zhuǎn)速兩方面維持壓力恒定，調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)壓力為40 mmHg。正常兔肺動(dòng)脈平均壓為（11.2±3.2）mmHg，體-肺分流高壓模型肺動(dòng)脈壓為（19.2±3.7）mmHg（P＜0.05）[11]，大于此模型壓力可形成肺動(dòng)脈高壓表現(xiàn)，但是壓力過(guò)高又會(huì)增加滲漏風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)法達(dá)到預(yù)期灌注時(shí)間。本研究多次平衡灌注壓力與灌注時(shí)間的關(guān)系，將壓力設(shè)定為40 mmHg，屬于高壓灌注，也可形成類似肺動(dòng)脈高壓的病理表現(xiàn)。

調(diào)節(jié)血氧飽和度是該模型的關(guān)鍵點(diǎn)及難點(diǎn)，我們?cè)趯?shí)施本研究前，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了大量的摸索工作，發(fā)現(xiàn)調(diào)高給氧濃度雖可使血氧飽和度增加，但并不能維持穩(wěn)定：恒定給氧流量50 ml/min和氧濃度60%通氣，血氧飽和度升高至100%，穩(wěn)定一段時(shí)間后（平臺(tái)期），開(kāi)始緩慢下降；即使維持流量不變，抬高給氧濃度到100%，血氧飽和度也無(wú)法維持在100%，表現(xiàn)為持續(xù)更長(zhǎng)平臺(tái)期后逐漸下降；完全關(guān)閉給氧，氧飽和度則無(wú)上升階段，逐漸緩慢下降。血氧飽和度降低可能與血細(xì)胞自身代謝產(chǎn)生酸性產(chǎn)物積累相關(guān)，故需要通過(guò)間斷開(kāi)放氣體以排除循環(huán)內(nèi)產(chǎn)生的二氧化碳，才可使氧飽和度上升。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了不同血氧飽和度影響主肺動(dòng)脈高壓發(fā)展的離體血管模型，該模型簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠。該方法可為進(jìn)一步探索不同血氧飽和度對(duì)高壓環(huán)境下肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響機(jī)制提供基本模型。

[1]劉迎龍, 胡盛壽, 沈向東, 等. 大于6月齡伴室間隔缺損并重度肺動(dòng)脈高壓心室大動(dòng)脈連接異常的大動(dòng)脈調(diào)轉(zhuǎn)術(shù). 中華胸心血管外科雜志, 2009, 25: 364-367.

[2]Pan X, Zheng Z, Hu S, et al. Mechanisms of pulmonary hypertension related to ventricular septal defect in congenital heart disease. Ann Thorac Surg, 2011, 92: 2215-2220.

[3]羅鵬, 龐玲品, 吳源聰, 等. 先天性心臟病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓肺組織芳香烴受體的表達(dá)及其與肺血管重構(gòu)的相關(guān)性研究. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2015, 30: 971-975.

[4]潘湘斌, 鄭哲, 胡盛壽, 等. 合并室間隔缺損的大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位所致肺動(dòng)脈高壓的可逆性程度及其分子機(jī)制. 中華胸心血管外科雜志,2010, 26: 81-85.

[5]馬勝軍, 劉桂清, 馬增山, 等. 先天性心臟病伴重度肺動(dòng)脈高壓患者動(dòng)脈血?dú)庋醴謮号c肺血管病理改變關(guān)系的研究. 中國(guó)循環(huán)雜志,2004, 19: 300-302.

[6]Hong E, Larios F, Gómez-Viquez NL, et al. Role of alpha adrenoceptors and nitric oxide on cardiovascular responses in acute and chronic hypertension. J Physiol Biochem, 2011, 67: 427-435.

[7]袁杰, 李菊香, 張寶紅, 等. 高血壓大鼠主動(dòng)脈一氧化氮合成途徑的變化. 高血壓雜志, 2002, 10: 463-467.

[8]Hoehn T, Preston AA, Mcphaden AR, et al. Endothelial nitric oxide synthase (NOS) is upregulated in rapid progressive pulmonary hypertension of the newborn. Intens Care Med, 2003, 29: 1757-1762.

[9]Lehoux S, Lemarie CA, Esposito B, et al. Pressure-induced matrix metalloproteinase-9 contributes to early hypertensive remodeling.Circulation, 2004, 109: 1041-1047.

[10]Bardy N, Karillon GJ, Merval R, et al. Differential effects of pressure and flow on DNA and protein synthesis and on fibronectin expression by arteries in a novel organ culture system. Circulation Res, 1995, 77:684.

[11]王偉, 張宜乾, 吳樹(shù)明. 兔高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型的建立. 中國(guó)病理生理雜志, 2006, 22: 612-617.

An in vitro Vascular Model for Studying the Impact of Different Blood Oxygen Saturation on Main Pulmonary Artery Pressure Changes

WEN Bin, LIU Yao, MENG Jian, LI Yong-nan, TANG Yue, PAN Xiang-bin.
Department of Cardiac Surgery,National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing(100037), China
Corresponding Author: PAN Xiang-bin, Email: xiangbin428@hotmail.com

Objective: To establish anin vitrovascular model to study the impact of different blood oxygen (O2) saturation on main pulmonary artery pressure changes in order to further explore the mechanism of pulmonary hypertension.

Methods: 20 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: Normal control group and 3 experimental groups as High O2(90%-100%)saturation group, Middle O2(65%-75%)saturation group and Low O2(40%-50%) saturation group,n=5 in each group. Thein vitropulmonary artery segments were treated with fresh heparinized rabbit blood and connected to extracorporeal circulation system for 48h at perfusion pressure at 40 mmHg; the condition of O2saturation was regulated by membrane oxygenator. Pathological morphology was compared among different groups.

Results:The bypass time in all 3 groups was 48h and the pressure was stably controlled at 40 mmHg. Blood O2contents in High O2saturation group, Middle O2saturation group and Low O2saturation group were (97.94±1.01) %, (72.14±12.85) %and (43.83±8.71) % respectively,P＜0.05. Pathological analysis indicated that compared with Normal control group, 3 experimental groups had increased thickness in pulmonary artery wall; upon O2saturation decreasing, the elastic fibers in pulmonary artery became increasing and more thickening accordingly.

Conclusion: We established anin vitrovascular model to study the impact of different blood O2saturation on main pulmonary artery pressure changes in experimental rabbits.

Hypertension, pulmonary; Model, cardiovascular; Oxygen saturation

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1024.)

國(guó)家自然科學(xué)基金（81400041）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20131106120006）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院 心外科

溫彬 碩士研究生 主要研究方向：先天性心臟病所致肺動(dòng)脈高壓機(jī)制研究 Email：wenbin96723@163.com 通訊作者：潘湘斌Email: xiangbin428@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1024-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.020

2017-06-08）

（編輯：朱柳媛）