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    組織蛋白酶S對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響

    2017-11-02 03:06:19白莉艷類延娜成憲武李香
    中國循環(huán)雜志 2017年10期
    關(guān)鍵詞:微管亞組蛋白酶

    白莉艷,類延娜,成憲武,李香

    基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

    組織蛋白酶S對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響

    白莉艷,類延娜,成憲武,李香

    目的:探討組織蛋白酶S (CatS)對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響。

    方法:分別在C57BL6野生型雄性小鼠(CatS+/+組)和CatS基因敲除雄性小鼠(CatS-/-組)建立下肢缺血模型,每組8只,分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進(jìn)行比較分析。再將CatS+/+組小鼠,分為正常對照亞組、選擇性CatS抑制劑(LHVS)亞組、非選擇性CatS抑制劑(E64d)亞組和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(GM6001)亞組,每組2只,觀察小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素(FITC)-CD31標(biāo)記微管腔形成情況。

    結(jié)果:(1)CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流,缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:CatS-/-組小鼠術(shù)后第7、14、21天缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組(P均<0.05)。(2)CatS-/-組小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。(3)LHVS、E64d以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較,均明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成,兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。(4)主動脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成。

    結(jié)論:CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用,不但增加了主動脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量,并且促進(jìn)了缺血下肢的血流恢復(fù)。這些結(jié)果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

    組織蛋白酶類;微管腔;血管再生

    下肢動脈硬化性疾?。↙EAD)其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。國外研究顯示,LEAD 患者伴有持續(xù)性疼痛者占28%,需要血管重建或截肢手術(shù)者占8.2%。更觸目驚心的臨床研究報(bào)道,LEAD嚴(yán)重肢體缺血患者1年病死率約25%,截肢率高達(dá)45%[1]。2002年,血管內(nèi)介入治療問世后,給LEAD的臨床治療帶來希望,但是,術(shù)后早中期25%~45%支架內(nèi)再狹窄等,束縛了LEAD介入治療的廣泛臨床應(yīng)用[2]。被譽(yù)為分子搭橋術(shù)的血管再生醫(yī)學(xué)引起全世界醫(yī)學(xué)專家的注目。然而,缺血后血管再生及細(xì)胞治療的分子機(jī)制尚不明確。因此,尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點(diǎn)、明確其作用機(jī)制、開發(fā)有效安全的治療措施成為各國醫(yī)學(xué)專家共同的任務(wù)和亟需解決的難題。本研究旨在觀察組織蛋白酶S (CatS)對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響,為尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    動物來源及分組:8周齡C57BL6野生型雄性小鼠(CatS+/+組)和8周齡CatS基因敲除雄性小鼠(CatS-/-組)由日本名古屋大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室提供,體重為21~25 g。第一組實(shí)驗(yàn):分別在CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠建立下肢缺血模型,每組8只。分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進(jìn)行比較分析。第二組實(shí)驗(yàn):再將CatS+/+組小鼠,分為正常對照亞組、選擇性CatS抑制劑(LHVS)亞組、非選擇性CatS抑制劑(E64d)亞組和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(GM6001)亞組,每組2只,觀察小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素(FITC)-CD31標(biāo)記微管腔形成情況。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    下肢缺血模型的建立:首先分離股神經(jīng)后結(jié)扎股動脈根部,剝離股動脈三個(gè)主要分支并結(jié)扎,然后切除股動脈主干及其分支,建立下肢缺血模型。激光多普勒血流儀測定下肢血流:采用Laser Doppler Perfusion Imager (Lisca AB 公司)的激光多普勒血流儀,測量術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)(左側(cè)下肢)和對側(cè)非缺血側(cè)(右側(cè)下肢)的血流灌注情況。每次測量之前,給予小鼠腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉,麻醉后采取仰臥位,置于37℃條件下15 min。仰臥位掃描之后,存儲圖像,圖像存儲形式為整個(gè)雙下肢區(qū)域的二維圖像,經(jīng)過PIMⅡPatch Test WIZARD軟件分析,血流灌注情況表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與非缺血側(cè)的血流灌注情況的比值表示其缺血下肢血流恢復(fù)情況。

    1.3 小鼠主動脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)步驟

    取材:心臟采血處死小鼠,體式顯微鏡下鈍性分離小鼠胸主動脈,使用顯微剪和眼科鑷小心剔除血管周圍脂肪及結(jié)締組織。將分離的主動脈轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基中[3]。消化:取下胸主動脈后,將其置于預(yù)先復(fù)溫的Ⅱ型膠原酶( 2 g/L) 中,放入37℃ 培養(yǎng)箱消化6~7 min,主動脈內(nèi)插入球囊,將內(nèi)皮細(xì)胞層朝外。饑餓:盡可能將血管均勻地剪成約1 mm長的動脈環(huán)。取出動脈環(huán)放入無血清培養(yǎng)基中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓過夜。Ⅰ型膠原包埋主動脈環(huán):預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋膠原至終濃度為 1 g/L,使用 NaOH( 200 g/L) 調(diào)整 pH 至 7.4。Ⅰ型膠原以約200 μl/孔包被預(yù)冷的24 孔板,將動脈環(huán)包埋入液態(tài)基質(zhì)膠。24孔板在室溫平衡10 min后放入37℃培養(yǎng)箱,孵育30 min,待膠原凝固后,正常對照亞組和LHVS亞組、E64d亞組和GM6001亞組,均加入DMEM +血管內(nèi)皮生長因子( VEGF,50 ng /ml) 100 μl /孔覆蓋膠原表面,隔天換液,培養(yǎng)7天。其中,LHVS濃度為5 nmol/L,E64d濃度為 10 μmol/L,GM6001濃度為 20 μmol/L。在倒置顯微鏡下觀察主動脈環(huán)微管腔出芽面積(×200倍放大)。出芽面積用定量分析區(qū)域內(nèi)血管每個(gè)圖像的像素所占的百分比表示。

    1.4 主動脈環(huán)試驗(yàn)

    用分子遺傳學(xué)觀察血管生成的新方法,觀察內(nèi)皮細(xì)胞組成的微血管網(wǎng)絡(luò)。CatS+/+小鼠反轉(zhuǎn)后的主動脈環(huán),置于預(yù)先包被有Collagen type l膠原的6 cm的培養(yǎng)皿中,給予VEGF(最終濃度為50 ng/ml)+內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(EBM-2)中培養(yǎng)7天。然后用免疫熒光法FITC-CD31標(biāo)記微血管出芽情況。將1:100配成的FITC mouse anti-humenCD31置入后,37℃ 培養(yǎng) 90 min,0.01 M PBS(0.2 M Na2HPO411.5 g, NaH2PO4·2H2O 2.2 g, NaCl 80 g 溶于 1 000 ml水,pH=7.4)清洗3次,多聚甲醛溶液(4%PFA)主要由多聚甲醛、磷酸鹽、去離子水組成,pH=7.4,室溫浸泡10 min后, PBS清洗3次,玻片上涂4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI),將動脈環(huán)封片后熒光顯微鏡觀察[4]。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS15.0分析系統(tǒng),計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示,用student的非配對T檢驗(yàn)或Tukey post hoc test 雙因素多重統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CatS+/+ 和CatS-/- 兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動態(tài)變化(圖1)。

    CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù),術(shù)后第7、14、21天CatS-/-組小鼠缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組(P均<0.05)。

    圖1 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動態(tài)變化(n=8)

    2.2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成(圖2)

    CatS-/-組小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

    2.3 利用組織蛋白酶S抑制劑(LHVS,E64d)及MMP抑制劑(GM6001)觀察小鼠

    主動脈環(huán)微管腔形成情況(圖3)。LHVS、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較,明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

    圖2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成(n=4,×200)

    圖3 各亞組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況(n=2,×200)

    2.4 小鼠主動脈環(huán)的免疫熒光鑒定(圖4)。

    倒置顯微鏡下觀察,綠色熒光為內(nèi)皮細(xì)胞由FITC- CD31特異性標(biāo)記,藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核。在免疫組化中,CD31是主要用于證明內(nèi)皮細(xì)胞的存在。結(jié)果表明:主動脈環(huán)培養(yǎng)以后形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成

    圖4 小鼠主動脈環(huán)的免疫熒光鑒定(×200)

    3 討論

    2004年,Cheng等[5,6]報(bào)道了CatS 在損傷性增生內(nèi)膜及心力衰竭心肌中表達(dá)明顯增高,并在心血管重構(gòu)中起著重要作用。此后,也發(fā)現(xiàn)CatS主要在血管平滑肌細(xì)胞膜外與ανβ3 整合素結(jié)合,調(diào)控平滑肌細(xì)胞的移動及浸潤功能[7]。藥物干預(yù)CatS可以抑制動脈斑塊形成及改善斑塊穩(wěn)定性[8]。這些研究結(jié)果提示,CatS參與動脈粥樣斑塊形成、發(fā)展、破裂和破裂后修復(fù)的全過程。以往的散在報(bào)道顯示:CatS一方面通過降解、失活成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)或分解4型膠原蛋白產(chǎn)生具有抗血管再生活性的血管抑制素,另一方面通過修飾以及釋放血管生長調(diào)節(jié)因子控制腫瘤血管新生[9]。2010年島田等日本學(xué)者利用基因敲除或藥物干預(yù)方法驗(yàn)證骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞-組織蛋白酶L 在角膜和脈絡(luò)膜血管再生過程中作用[10]。Urbich 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮祖細(xì)胞中組織蛋白酶L高水平表達(dá),并促使骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢于缺血血管床中發(fā)揮了重要作用。以上研究結(jié)果揭示:CatS在動脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[12],亦可能參與血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能調(diào)控。下肢缺血性疾病最主要的病因?yàn)閯用}粥樣硬化,因此,CatS可以成為參與缺血性血管再生的關(guān)鍵成員。

    本研究結(jié)果表明:(1)CatS-/-組小鼠下肢血流的恢復(fù)明顯受到抑制。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流,缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:CatS-/-組小鼠術(shù)后第7、14、21天缺血下肢血流恢復(fù)均明顯慢于CatS+/+組(P均<0.05)。(2)CatS-/-小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+小鼠比較明顯減少,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(3)LHVS亞組、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較,均明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。(4)主動脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內(nèi)皮細(xì)胞組成。目前較多的研究集中于CatS在動脈硬化性心血管疾病中的表達(dá)及其作用,而CatS在缺血性血管生成中表達(dá)及其作用尚少見報(bào)道[13]。本研究提示:CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用,不但增加了主動脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量,并且促進(jìn)了缺血下肢的血流恢復(fù)。這些結(jié)果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

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    Impact of Cathepsins S on Aortic Ring-derived Micro Vascular Cavity Formation in Experimental Mice

    BAI Li-yan, LEI Yan-na, CHENG Xian-wu, LI Xiang.
    Department of Cardiology, Yanbian University Affiliated Hospital, Yanji (133000), Jilin, China
    Corresponding Author: LI Xiang, Email:15526770377@163.com

    Objective: To investigate the impact of cathepsins S (CatS) on aortic ring-derived micro vascular cavity formation in experimental mice.

    Methods: Hindlimb ischemia model was established in CatS+/+and CatS-/-mice,n=8 in each group. The blood fl ow in hindlimb was measured before is chemic surgery; immediately and 1, 4, 7, 14, 21 days after surgery. CatS+/+mice were further divided into 4 subgroups: Normal control subgroup, Selective CatS inhibitor (LHVS) subgroup, Non-selective CatS inhibitor(E64d) subgroup and MMP inhibitor (GM6001) subgroup;n=2 in each subgroup. The mice aortic ring-derived micro vascular cavity formation was observed by FITC-CD31 immunof l uorescence method.

    Results:①CatS-/-mice had inhibited blood fl ow recovery after is chemic surgery. Laser Doppler blood fl ow (LDBF)examination indicated that compared with CatS+/+group, CatS-/-group had slower hindlimb blood flow recovery,P<0.05;②CatS-/-group had the less aortic ring-derived micro vascular cavities,P<0.001.③Compared with Normal control subgroup,LHVS subgroup, E64d subgroup and GM6001 subgroup had suppressed micro vascular cavity formation, allP<0.05.④Aortic ring-derived micro vascular cavity was composed by endothelial cells.

    Conclusion: CatS plays a beneficial role in is chemic vascular regeneration in experimental mice; it is not only increasing aortic ring-derived micro vascular cavity formation, but also promoting blood flow recovery in is chemic hindlimb. Our finding provides a theoretical basis for new therapeutic target in is chemic vascular regeneration.

    Cathepsins; Micro vascular cavity; Vascular regeneration

    (Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1015.)

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81660240)

    133000 吉林省延吉市,延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科(白莉艷、成憲武、李香),重癥監(jiān)護(hù)病房(類延娜)

    白莉艷 住院醫(yī)師 碩士研究生 主要從事組織蛋白酶與心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究 Email: zhongtian200330@163.com 通訊作者:李香Email:15526770377@163.com

    R54

    A

    1000-3614(2017)10-1015-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.018

    2016-11-01)

    (編輯:王寶茹)

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