喜樹堿對HaCaT細(xì)胞自噬的影響

郝陽陽 張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳楊

313000浙江湖州，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍九八臨床學(xué)院 解放軍第九八醫(yī)院皮膚科（郝陽陽、張梁宇、陸亞琪、朱曉楊、陳楊），藥械科（王翔）

·論著·

喜樹堿對HaCaT細(xì)胞自噬的影響

郝陽陽 張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳楊

313000浙江湖州，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍九八臨床學(xué)院 解放軍第九八醫(yī)院皮膚科（郝陽陽、張梁宇、陸亞琪、朱曉楊、陳楊），藥械科（王翔）

目的 探討喜樹堿對HaCaT細(xì)胞自噬的影響。方法 將HaCaT細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組用0.1%二甲基亞砜處理，實(shí)驗(yàn)組分別用5、10、25、50、100、200 nmol∕L濃度的喜樹堿處理。不同濃度喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞24、48 h，用CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測藥物作用24 h后細(xì)胞凋亡情況，免疫印跡法檢測自噬相關(guān)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、p62的變化；選取10 nmol∕L喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞24 h，間接免疫熒光法檢測細(xì)胞自噬蛋白LC3的變化。結(jié)果5、10 nmol∕L喜樹堿對HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡無顯著影響，50、100、200 nmol∕L喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h，增殖抑制率分別為（31.23±1.00）%，（54.21±8.10）%，（66.75±10.70）%；25、50、100、200 nmol∕L喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞48 h，增殖抑制率分別為（25.81±5.99）%、（44.35±5.32）%、（65.81±8.28）%、（73.23±9.59）%，與同時段對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。50、100、200 nmol∕L喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h，凋亡率分別為（14.46±2.38）%、（19.15±1.59）%、（29.88±1.37）%，與對照組（3.80±0.13）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。5、10 nmol∕L喜樹堿處理HaCaT細(xì)胞24 h后，LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)。間接免疫熒光顯示10 nmol∕L喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組自噬體陽性細(xì)胞百分率分別為（36.67±4.55）%、（6.23±0.92）%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.546，P=0.003）。結(jié)論 5、10 nmol∕L喜樹堿可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生自噬，但對細(xì)胞增殖、凋亡無影響。50、100、200 nmol∕L喜樹堿抑制HaCaT細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，自噬水平降低。

銀屑?。幌矘鋲A；自噬；凋亡；HaCaT細(xì)胞

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與自身免疫、炎癥密切相關(guān)，角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、角化不全是其發(fā)病機(jī)制之一［1］。自噬是細(xì)胞的一種自我吞噬的過程，在細(xì)胞處于饑餓、感染等應(yīng)激狀態(tài)時，細(xì)胞會發(fā)生自噬［2］。喜樹堿作為一種生物堿單體，其外用制劑用于治療尋常性銀屑病，尤其是慢性斑塊型銀屑病，療效與0.02%丙酸氯倍他索乳膏相當(dāng)［3］。有研究表明，銀屑病皮損的自噬水平較正常表皮下降［4］，阻斷自噬可使人表皮細(xì)胞炎癥因子顯著上調(diào)［5］，提高銀屑病皮損的自噬水平能否成為治療銀屑病的一種方法？目前喜樹堿對人角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的影響尚不清楚，我們觀察喜樹堿對HaCaT細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用并進(jìn)行初步探討。

材料與方法

一、主要試劑

喜樹堿（含量＞95%，日本東京化成工業(yè)公司）。HaCaT細(xì)胞系購于美國ATCC細(xì)胞庫。二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）。胰酶+乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），兔抗人自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）單克隆抗體（美國Novus公司），兔抗人p62單克隆抗體（美國Proteintech公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.藥物處理及分組：喜樹堿以DMSO溶解后，-20℃避光保存，喜樹堿存儲濃度為10 mol∕L，使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，DMSO的終濃度≤0.1%。HaCaT細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組喜樹堿的濃度分別為5、10、25、50、100、200 nmol∕L，對照組含0.1%DMSO。5、10、25 nmol∕L為低濃度，50、100、200 nmol∕L為高濃度。

3.CCK8檢測細(xì)胞增殖抑制率：將對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞（1×104∕m1）接種于96孔板，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h；去上清液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度（5、10、25、50、100、200 nmol∕L）喜樹堿的完全培養(yǎng)基100 μl，每一濃度設(shè)置6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入含10 μl CCK8溶液的無血清培養(yǎng)基100 μl，37℃、5%CO2下孵育1 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測量各孔吸光度A值，細(xì)胞增殖抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值）∕（對照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

4.膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素∕碘化丙錠（Annexin?FITC∕PI）雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞按2×105∕ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄上清，實(shí)驗(yàn)組加入含有不同濃度喜樹堿的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，離心后，用1 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2次，棄上清，加入300 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl AV?FITC混勻后，室溫避光孵育10～15 min。上機(jī)前，加入5 μl碘化丙錠，開始檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

5.Western印跡檢測LC3、p62蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞處理同上。去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2遍。加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解后，高速離心，取上清。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將上樣緩沖液與蛋白混合，煮沸。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)有蛋白的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）用3%BSA室溫封閉2 h，再用稀釋過的相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，用二抗孵育2 h后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.間接免疫熒光法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105∕ml的密度接種于內(nèi)置14 mm蓋玻片的24孔板，每孔500 μl，待細(xì)胞貼壁以后，加入喜樹堿濃度為10 nmol∕L的培養(yǎng)液，并設(shè)置只加入0.1%DMSO的對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，4%甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌2次，0.5%Triton X?100室溫作用5 min，PBS洗滌2次，5%BSA室溫封閉1 h，加入LC3抗體（1∶200），陰性對照以PBS代替一抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌2次，加入相應(yīng)熒光二抗，PBS洗滌，加入DAPI，PBS洗滌，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。在核周和胞質(zhì)出現(xiàn)3個以上高密度綠色熒光點(diǎn)為自噬體陽性細(xì)胞。在顯微鏡（×200）下隨機(jī)選取5個視野，統(tǒng)計(jì)每個視野中自噬體陽性的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。各均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊。不同濃度喜樹堿對細(xì)胞增殖抑制以及凋亡的總體差異用單因素方差分析，組間的多重比較用Dunnett t檢驗(yàn)，自噬體陽性細(xì)胞率比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同濃度喜樹堿對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

0.1%DMSO對照組、5、10、25、50、100、200 nmol∕L喜樹堿對細(xì)胞的增殖抑制率在24 h分別為（1.51± 0.59）%、（3.21±0.78）%、（3.79±1.17）%、（5.59± 1.23）%、（31.23±1.00）%、（54.21±8.10）%、（66.75± 10.70）%。與DMSO組相比，50、100、200 nmol∕L組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.05，P＜0.001）。各組增殖抑制率在48 h分別為（2.10±0.88）%、（2.62± 0.86）%、（2.80±1.03）%、（25.81±5.99）%、（44.35± 5.32）%、（65.81±8.28）%、（73.23±9.59）%，與DMSO組相比，25、50、100、200 nmol∕L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.78，P＜0.001），喜樹堿對HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性。見表1。

表1 不同濃度喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h、48 h增殖抑制率（%，±s）

表1 不同濃度喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h、48 h增殖抑制率（%，±s）

注：n=3，a：與同時段對照組比較，P＜0.001

組別對照組喜樹堿濃度5 nmol∕L 10 nmol∕L 25 nmol∕L 50 nmol∕L 100 nmol∕L 200 nmol∕L 24 h 1.51±0.59 48 h 2.10±0.88 3.22±0.78 3.79±1.17 5.60±1.23 31.23±1.00a 54.21±8.10a 66.75±10.70a 2.62±0.86 2.81±1.03 25.81±5.99a 44.35±5.32a 65.81±8.28a 73.23±9.59a

二、不同濃度喜樹堿對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

以Annexin V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，對照組凋亡率為（3.80±0.13）%，5、10、25、50、100、200 nmol∕L喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h，其凋亡率分別為（4.02± 0.09）%、（4.19±1.01）%、（5.25±0.60）%、（14.46± 2.38）%、（19.15±1.59）%、（29.88±1.37）%。與對照組相比，50、100、200 nmol∕L組的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=186.90，P＜0.001）。見表2。

表2 不同濃度喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h凋亡率（%，±s）

表2 不同濃度喜樹堿作用HaCaT細(xì)胞24 h凋亡率（%，±s）

注：n=3，a：與對照組比較，P＜0.001

組別對照組喜樹堿濃度5 nmol∕L 10 nmol∕L 25 nmol∕L 50 nmol∕L 100 nmol∕L 200 nmol∕L 24 h（%）3.80±0.13 4.02±0.09 4.20±1.01 5.25±0.60 14.46±2.38a 19.15±1.59a 29.88±1.37a

三、喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞后LC3、p62蛋白的表達(dá)

不同濃度喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞24 h，LC3?Ⅱ蛋白在喜樹堿為5、10 nmol∕L濃度時表達(dá)上調(diào)最為顯著，50、100、200 nmol∕L組LC3?Ⅱ表達(dá)下調(diào)。p62蛋白表達(dá)以5、10 nmol∕L喜樹堿組下調(diào)明顯。見圖1。

圖1 不同濃度喜樹堿對HaCaT細(xì)胞LC3、p62表達(dá)的影響 1：對照組；2：5 nmol∕L喜樹堿；3：10 nmol∕L喜樹堿；4：25 nmol∕L喜樹堿；5：50 nmol∕L喜樹堿；6：100 nmol∕L喜樹堿；7：200 nmol∕L喜樹堿

四、喜樹堿作用后自噬水平的變化

以10 nmol∕L喜樹堿處理細(xì)胞24 h，LC3間接免疫熒光染色顯示細(xì)胞核及胞質(zhì)呈現(xiàn)高密度綠色熒光點(diǎn)，喜樹堿處理組綠色熒光較對照組增強(qiáng)。見圖2。對照組和實(shí)驗(yàn)組自噬體陽性細(xì)胞百分率分別為（6.23±0.92）%、（36.67±4.55）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.546，P=0.003）。

討論

喜樹堿具有抗腫瘤活性，對多種腫瘤細(xì)胞有促凋亡作用，它可使DNA鏈不能正常閉合，引起非致死性DNA單鏈斷裂，阻斷DNA合成，使細(xì)胞周期停滯在S期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另外，喜樹堿還通過抑制細(xì)胞端粒酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6?7］。喜樹堿的外用制劑主要用于治療慢性斑塊型銀屑病，其治療機(jī)制主要是誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化，臨床上有較為滿意的療效［8］。細(xì)胞自噬是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的保護(hù)性機(jī)制，細(xì)胞自噬通過形成自噬溶酶體來清除失去功能和變性受損的細(xì)胞器、大分子物質(zhì)以及入侵的微生物等，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和更新［9?10］。LC3是自噬的特征性標(biāo)志物，哺乳動物L(fēng)C3和酵母自噬相關(guān)基因（ATG）8為同源物，它包括LC3?Ⅰ、LC3?Ⅱ兩種形式，LC3?Ⅰ以溶解狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時，LC3?Ⅰ被泛素化加工修飾后，與自噬泡膜表面腦磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，從而形成LC3?Ⅱ，LC3?Ⅱ特異地定位于自噬前體及自噬體的內(nèi)外膜上，因此，其含量的高低可反映細(xì)胞自噬水平［11］。抗代謝藥如5氟尿嘧啶、雷帕霉素等可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬［12?13］，同為抗代謝藥的羥喜樹堿可誘導(dǎo)人Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)生自噬［14］。

圖2 間接免疫熒光檢測LC3觀察自噬體形成 對照組LC3綠色熒光彌散分布于胞質(zhì)中，10 nmol∕L喜樹堿作用細(xì)胞24 h可見LC3綠色熒光聚集成較大的綠色熒光點(diǎn)，分布于核周及胞質(zhì)中2A：10 nmol∕L喜樹堿組（×100）；2C：對照組（×100）；2B、2D：分別為A、C的局部放大（×400）

本研究中，25、50、100、200 nmol∕L喜樹堿均能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物濃度和作用時間的增加，其對細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，呈時間和濃度依賴性，5、10 nmol∕L喜樹堿對HaCaT細(xì)胞增殖幾乎不產(chǎn)生影響，與以往研究一致［15］。50、100、200 nmol∕L喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率明顯增加，且與濃度呈正相關(guān)，而5、10、25 nmol∕L喜樹堿對細(xì)胞凋亡沒有顯著影響。在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面，5、10 nmol∕L喜樹堿作用24 h可引起HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生自噬，LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)升高，p62水平下降，免疫熒光可見LC3綠色熒光聚集點(diǎn)增多，透射電鏡可觀察到雙層膜的自噬體機(jī)構(gòu)，證明細(xì)胞的自噬水平升高，p62的降解增加［16］，在此濃度下，藥物對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生輕度的抑制，對細(xì)胞凋亡幾乎不產(chǎn)生影響。本研究表明，喜樹堿在低濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而高濃度喜樹堿對細(xì)胞主要為促凋亡作用。研究表明，自噬和凋亡存在十分密切的關(guān)系，在不同的研究體系中，自噬和凋亡可能共同促進(jìn)細(xì)胞的死亡，也可能是相互抑制，自噬可通過抑制凋亡而使細(xì)胞繼續(xù)存活［17］。因此我們推測，低濃度喜樹堿對HaCaT細(xì)胞主要為誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬，自噬對凋亡可能有一定的抑制作用，而在高濃度喜樹堿條件下，對細(xì)胞的凋亡作用占主導(dǎo)，自噬水平降低，此時凋亡對自噬產(chǎn)生抑制效應(yīng)。本研究提示，喜樹堿可在對細(xì)胞增殖、凋亡不產(chǎn)生影響的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬，該濃度喜樹堿治療銀屑病的作用機(jī)制可能區(qū)別于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。然而，喜樹堿誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬的機(jī)制以及自噬與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、炎癥的關(guān)系尚待更深入的研究。

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Effects of camptothecin on the autophagy of HaCaT cells

Hao Yangyang,Zhang Liangyu,Wang Xiang,Lu Yaqi,Zhu Xiaoyang,Chen Yang
Department of Dermatology,98th Hospital of People′s Liberation Army,98th Clinical College of People′s Liberation Army,Anhui Medical University,Huzhou 313000,Zhejiang,China（Hao YY,Zhang LY,Lu YQ, Zhu XY,Chen Y）;Department of Drug and Equipment,98th Hospital of People′s Liberation Army,98th Clinical College of People′s Liberation Army,Anhui Medical University,Huzhou 313000,Zhejiang,China（Wang X）

Chen Yang,Email:98cy@163.com

Objective To evaluate effects of camptothecin on the autophagy of HaCaT cells. Methods Some cultured HaCaT cells were divided into several groups to be treated with camptothecin at concentrations of 5,10,25,50,100 and 200 nmol∕L,and 0.1%dimethyl sulfoxide（DMSO）（control group）,respectively.Cell counting kit?8（CCK?8）assay was conducted to estimate the proliferative activity of HaCaT cells after 24?and 48?hour treatment,flow cytometry to evaluate cell apoptosis after 24?hour treatment,and Western blot analysis to measure the expression of autophagy?related proteins microtubule?associated protein 1 light chain 3（LC3）and p62.Some HaCaT cells were divided into 2 groups to be treated with 10 nmol∕L camptothecin and 0.1%DMSO for 24 hours,respectively.Then,indirect immunofluorescence assay（IFA）was performed to determine the LC3 expression.Results Camptothecin at low concentrations of 5 and 10 nmol∕L had no significant effects on the proliferation and apoptosis of HaCaT cells.Compared with the control group,the cellular proliferative rates were significantly inhibited by（31.23±1.00）%,（54.21±8.10）%and（66.75±10.70）%in the 50?,100?and 200?nmol∕L camptothecin groups after 24?hour treatment respectively,and by（25.81±5.99）%,（44.35±5.32）%,（65.81±8.28）% and（73.23±9.59）%in the 25?,50?,100?and 200?nmol∕L camptothecin groups after 48?hour treatment respectively（all P＜0.001）.After 24?hour treatment,the apoptosis rates were significantly higher in the 50?, 100?and 200?nmol∕L camptothecin groups（14.46%±2.38%,19.15% ±1.59%,29.88%±1.37%, respectively）than in the control group（3.80%±0.13%,all P＜0.001）.After 24?hour treatment with 5 and 10 nmol∕L camptothecin,the protein expression of LC3Ⅱwas significantly up?regulated,while p62 protein expression was significantly down?regulated.IFA showed that the percentage of autophagosome?positive cells was significantly higher in the 10?nmol∕L camptothecin group than in the control group after 24?hour treatment（36.67%±4.55%vs.6.23%±0.92%,t=6.546,P=0.003）.Conclusions Camptothecin at low concentrations of 5 and 10 nmol∕L can induce autophagy of HaCaT cells,but has no obvious effects on cell proliferation and apoptosis.Camptothecin at concentrations of 50,100 and 200 nmol∕L can inhibit cell proliferation,promote cell apoptosis,and decrease autophagy levels.

Psoriasis;Camptothecin;Autophagy;Apoptosis;HaCaT cells

陳楊，Email：98cy@163.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.003

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目（13QNP045）；南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（12Z03）

Fund programs:Military Youth Training Program for Medical Science and Technology（13QNP045）; Key Project for Medical Science and Technology Innovation of Nanjing Military Area（12Z03）

2016?08?09）

（本文編輯：吳曉初）