4-羥苯基維胺在不同載體中對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡影響

李周娜 陳香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延邊大學附屬醫(yī)院皮膚科

4-羥苯基維胺在不同載體中對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡影響

李周娜 陳香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延邊大學附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討4-羥苯基維胺（4-HPR）在不同載體中對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）增殖及凋亡的影響。方法采用薄膜-超聲分散法制備4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液。用不同濃度（0～80 mg/L）4-HPR脂質(zhì)體溶液作用原代HKF 6～48 h后，噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖情況。將部分HKF分成3組，分別用15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液、4-HPR微泡處理，每組再分成兩個亞組，一個亞組在給藥后接受超聲處理，另一亞組不做超聲處理。作用24 h后，噻唑藍（MTT）法檢測HKF的增殖情況。流式細胞儀檢測15 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體或4-HPR微泡處理24 h后HKF的凋亡情況。結(jié)果成功制備4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液。MTT檢測顯示，4-HPR脂質(zhì)體溶液在1～80 mg/L濃度范圍內(nèi)對HKF增殖有抑制作用，且增殖抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)（r=0.633，P＜0.01）。超聲處理后4-HPR微泡組與4-HPR溶液及4-HPR脂質(zhì)體組對HKF的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率分別為（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，較對照組（6.18±0.61）%均顯著增加（均P＜0.01）。結(jié)論成功制備4-HPR微泡，不同載體中4-HPR可促進HKF凋亡，進而抑制增殖，其中4-HPR微泡結(jié)合超聲抑制作用較4-HPR脂質(zhì)體強。

維甲酸；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；細胞增殖；4-羥苯基維胺

維A酸類藥物對體外培養(yǎng)的成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）DNA合成具有干擾作用，可抑制成纖維細胞增殖及膠原代謝［1］。4-羥苯基維胺（4-hydroxyphenyl-retinamide，4-HPR）是人工合成的全反式維A酸文獻顯示，4-HPR對多種惡性腫瘤細胞有較高的抗腫瘤活性，毒性低于其他維A酸類藥物［2］。臨床上瘢痕疙瘩有腫瘤樣生長的特性，推測4-HPR也可用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治療。但4-HPR水溶性差，直接給藥效果不佳。為了開發(fā)一種治療瘢痕疙瘩的納米藥物載體，提高4-HPR的溶解度，我們結(jié)合超聲波技術(shù)，研究4-HPR對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKF）增殖及凋亡的作用，為臨床上更好地治療瘢痕疙瘩提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.細胞株：將瘢痕疙瘩原代培養(yǎng)保存于液氮中的HKF（來自中國醫(yī)學科學院藥物研究所）取出，復蘇，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長滿90%時傳代，取第3～5代細胞用于實驗。

2.主要試劑和儀器：流式細胞儀（FACS Calibur）產(chǎn)自美國BD公司；超聲波細胞粉碎機（JY92-IIN）產(chǎn)自寧波新芝生物科技股份有限公司；4-HPR產(chǎn)自南京圣賽化工有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒產(chǎn)自上海貝博生物科技有限公司；噻唑藍（MTT）、膽固醇、甲醇（HPLC級）均產(chǎn)自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基產(chǎn)自美國HyClone公司；甲氧基聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-2000（mPEG-DSPE2000）產(chǎn)自美國 Laysan Bio公司；蛋黃卵磷脂（EPC）產(chǎn)自上海東尚公司。

二、方法

1.藥物配制：

（1）4-HPR 溶液：20 μg 4-HPR 加入 200 μl 0.04%的二甲基亞砜（DMSO）溶解，-20℃長期保存，實驗時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至相應濃度。

（2）4-HPR脂質(zhì)體：EPC 28 mg、膽固醇2.5 mg、mPEG-DSPE2000 3 mg、4-HPR 3 mg，加入適量氯仿，渦旋、轉(zhuǎn)蒸得到淡黃色膜狀物，加入4 ml去離子水水浴水化，靜置后得到載4-HPR脂質(zhì)體混懸液，水膜過濾得4-HPR脂質(zhì)體溶液［3］。

（3）4-HPR微泡：取4-HPR脂質(zhì)體溶液1 ml，加入10 μl全氟戊烷，冷水浴內(nèi)超聲60 s，得4-HPR微泡溶液。置于4℃冰箱內(nèi)密封保存，30 d內(nèi)保存過程中，觀察外觀變化。

2.細胞增殖實驗（MTT法）：

（1）不同濃度4-HPR脂質(zhì)體溶液對細胞增殖的影響：采用MTT比色法檢測。將HKF以4 000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，分別向各孔內(nèi)加入4-HPR脂質(zhì)體溶液，使藥物終濃度分別為0、1、2.5、5、10、20、40和80 mg/L，同時設空白組（不加細胞），繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入（避光條件下）5 g/L的MTT溶液 20 μl，置 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 4 h，加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，置酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度（A）。細胞增殖抑制率（%）=（A對照-A實驗）/（A對照-A空白）× 100%。

（2）超聲及不同載體中HRP對細胞增殖的影響：細胞接種實驗如同前操作，細胞分為3組，分別用含15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液和4-HPR微泡的含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，每組再分為2個亞組，超聲亞組給藥后立即進行超聲，另一亞組則不予超聲處理。超聲方法為在培養(yǎng)皿底部涂層超聲耦合劑，利用低強度聚焦超聲儀以頻率3 MHz，功率 1 W/cm2，刺激周期 20%，超聲 30 s［4］。設對照組，僅加入細胞，但不給藥，其他處理同上。MTT法檢測細胞增殖情況，具體方法同上。

3.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：將HKF以1×105個/孔接種入6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)48 h。實驗分為對照組、4-HPR脂質(zhì)體組、4-HPR微泡組：4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組分別加入15 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體和微泡，對照組則加入含等體積5%葡萄糖的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，冷PBS洗滌2次，加入結(jié)合液400 μl懸浮細胞，再加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素染色液，混勻后4℃避光孵育15 min，再加10 μl碘化丙錠染色液，混勻，4 ℃孵育（避光）5 min后，收集細胞立即用流式細胞儀檢測。

4.統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)以Excel記錄，計量資料用±s表示，用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，細胞增殖抑制率比較采用重復測量的方差分析，組間比較采用Bonferroni法，藥物濃度與細胞增殖抑制率的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，對成纖維細胞凋亡的影響采用獨立樣本T檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。。

結(jié) 果

一、不同載體藥物形態(tài)學觀察

4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液在外觀上未見明顯區(qū)別，均呈現(xiàn)為略帶藍色乳光的淡黃色澄清液體。在透射電鏡下觀察4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液均呈球形或類球形結(jié)構(gòu)，大小均勻、外觀圓整（圖1）。兩種溶液置于4℃冰箱內(nèi)密封保存，30 d保存過程中，一直為淡黃色澄清液體，說明制備藥物穩(wěn)定性良好，可用于下一步實驗。

二、4-HPR脂質(zhì)體溶液對HKF增殖的影響

1～80 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體溶液作用24 h對HKF增殖有抑制作用，抑制率和藥物濃度呈正相關(guān)（r=1.158，P＜ 0.001）。見圖2。半數(shù)抑制濃度（IC50）估計值為15.01 mg/L，95%置信區(qū)間為13.10～17.02 mg/L。重復測量的方差分析顯示，增加溶液濃度或者延長作用時間均能使細胞增殖抑制率增加（F值分別為5.45、11.26，P值均 ＜ 0.001），并且藥物濃度和作用時間表現(xiàn)為兩個相對獨立的因素，彼此之間交互作用不顯著（F=0.217，P=0.685）。

三、4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體和4-HPR微泡聯(lián)合超聲對HKF增殖的影響

圖1 透射電鏡觀察4-HPR脂質(zhì)體（1A）和4-HPR微泡（1B）

圖2 不同濃度4-羥苯基維胺作用不同時間對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響 2A：增殖抑制率隨時間的變化曲線；2B：增殖抑制率隨藥物濃度的變化曲線

在不超聲的情況下，4-HPR溶液對HKF的抑制作用大于4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體，而4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體的抑制作用相當。超聲處理后，4-HPR微泡對HKF的抑制率顯著增加（t=9.440，P=0.001），4-HPR溶液和4-HPR脂質(zhì)體的抑制作用也明顯增強；對照組聯(lián)合超聲對HKF的增殖抑制率約為10%，見表1。

四、4-HPR對HKF凋亡的影響

4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率分別為（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，較對照組（6.18±0.61）%均顯著增加（t值分別為16.59、52.12，均P＜ 0.01）。見圖3。

討 論

由于4-HPR的水溶性較差，在制備4-HPR脂質(zhì)體的過程中，載體與藥物的比例要適當，使所投的載體能包裹藥物，盡量降低游離藥物的量。本研究選擇氯仿作為溶劑溶解4-HPR、PEG-DSPE和EPC，得到澄清的溶液，未見沉淀，溶解良好，旋蒸后成膜均勻。在4-HPR脂質(zhì)體中加入全氟戊烷超聲后得到4-HPR微泡，穩(wěn)定性增強，全氟戊烷能夠很好地包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部。

表1 各組藥物在有或無超聲處理時對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的抑制率（%，±s）

表1 各組藥物在有或無超聲處理時對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的抑制率（%，±s）

注：n=5。a：與對照組比較，P ＜ 0.01；b：與4-HPR溶液組比較，P＜0.05或＜0.01；c：與4-HPR脂質(zhì)體組比較，P＜0.01

分組對照組4-HPR溶液組4-HPR脂質(zhì)體組4-HPR微泡組F值P值P值＜0.001 0.007 0.036 0.001 t值8.660 5.080 2.550 9.440非超聲處理0 44.00±4.58a 30.33±1.53ab 34.33±5.86ab 25.063＜0.001超聲處理10.00±2.00 59.33±2.52a 34.67±1.52ab 73.00±4.00abc 29.394＜0.001----

圖3 流式細胞儀觀察不同載體中4-HPR對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響 3A：對照組；3B：4-HPR脂質(zhì)體組；3C：4-HPR微泡組

大量研究表明，4-HPR在體外實驗中可引起多種腫瘤細胞的凋亡［5］。4-HPR主要通過維A酸受體（RAR）和非RAR途徑抑制細胞生長及誘導腫瘤細胞凋亡，但具體作用機理尚未明確，目前認為主要是通過提高活性氧、神經(jīng)酰胺的水平，刺激半胱天冬酶活性增加等機制來誘導腫瘤細胞凋亡［6］。

本研究顯示，4-HPR對HKF增殖的抑制作用具有濃度、外界條件依賴性。在藥物濃度相同的情況下，4-HPR溶液對HKF的抑制作用明顯強于4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體，可能是因為4-HPR溶液中藥物直接暴露于單層貼壁細胞，而4-HPR脂質(zhì)體與4-HPR微泡在細胞培養(yǎng)過程中脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)逐漸分解緩慢釋藥，所以作用較4-HPR溶液緩慢。而且，超聲處理后4-HPR溶液組和4-HPR脂質(zhì)體組細胞抑制率相對于未經(jīng)超生處理時有明顯升高，表明超聲波對藥物的釋放和吸收有促進作用；4-HPR微泡組由于超聲的作用，微泡破碎，對細胞的抑制作用顯著大于4-HPR溶液組、4-HPR脂質(zhì)體組；對照組超聲處理后對細胞具有一定的增殖抑制，說明超聲不僅對納米粒的釋藥和藥物吸收有促進作用，對HKF的增殖也有抑制作用。

細胞凋亡實驗顯示，在同等強度超聲作用下，4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率與對照組相比均明顯增高，其中4-HPR微泡組最為顯著，說明4-HPR微泡聯(lián)合超聲能更有效地誘導HKF凋亡。

綜上，我們認為4-HPR可以有效抑制HKF增殖，誘導其發(fā)生凋亡，且4-HPR微泡聯(lián)合超聲較4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液能更有效地抑制HKF增殖并誘導其凋亡，為臨床上更好地治療瘢痕疙瘩提供理論和實驗依據(jù)。

［1］Huang C,Ogawa R.Pharmacological treatment for keloids［J］.Expert Opin Pharmacother,2013,14（15）:2087-2100.DOI:10.1517/14656566.2013.826651.

［2］Sogno I,Venè R,Ferrari N,et al.Angioprevention with fenretinide:targeting angiogenesis in prevention and therapeutic strategies［J］.Crit Rev Oncol Hematol,2010,75（1）:2-14.DOI:10.1016/j.critrevonc.2009.10.007.

［3］Badaoui FZ,張燦.載藥聚合物膠束的制備和腫瘤靶向性研究進展［J］.北方藥學,2013,10（6）:61-62,63.

［4］Rapoport NY,Nam KH,Gao Z,et al.Application of ultrasound for targeted nanotherapy of malignant tumors［J］.Acoust Phys,2009,55（4-5）:594-601.DOI:10.1134/S1063771009040162.

［5］Vratilova J,Frgala T,Maurer BJ,et al.Liquid chromatography method for quantifying N-（4-hydroxyphenyl）retinamide and N-（4-methoxyphenyl）retinamide in tissues［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,808（2）:125-130.DOI:10.1016/j.jchromb.2004.02.031.

［6］Gao ZG,Fain HD,Rapoport N.Controlled and targeted tumor chemotherapy by micellar-encapsulated drug and ultrasound［J］.J Control Release,2005,102（1）:203-222.DOI:10.1016/j.jconrel.2004.09.021.

Effects of 4-hydroxyphenyl retinamide in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts

Li Zhouna,Chen Xiangru,Jin Zhehu
Department of Dermatology,Yanbian University Hospital,Yanji 133000,Jilin,China

Jin Zhehu,Email:jinzh_621@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of 4-hydroxyphenyl retinamide（4-HPR）in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts（HKFs）.MethodsA filmultrasonic dispersion method was used to prepare 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles.Primary HKFs werein vitrotreated with the 4-HPR liposome solution at different concentrations of 0-80 mg/L for 6-48 hours,and the proliferative activity of HKFs was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.Some other HKFs were divided into 3 experimental groups to be treated with 15 mg/L 4-HPR solution（4-HPR solution group）,15 mg/L 4-HPR liposome solution（4-HPR liposome solution group）and 15 mg/L 4-HPR microbubbles（4-HPR microbubble group）,respectively,and each group was divided into ultrasonic-treated and-untreated subgroups.HKFs without treatment served as control group.After 24-hour treatment,MTT assay was conducted to evaluate the proliferative activity of HKFs in the above groups,flow cytometry to detect apoptosis of HKFs in all groups except the 4-HPR solution group.ResultsThe 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles were successfully prepared.MTT assay showed inhibitory effects of 4-HPR liposome solution at concentrations of 1-80 mg/L on the proliferation of HKFs,and the proliferation inhibition rate was positively associated with the drug concentrations（r=0.633,P＜ 0.01）.After the ultrasonic treatment,inhibitory effects on the proliferation of HKFs significantly differed among the 4-HPR microbubble group,4-HPR solution group and 4-HPR liposome solution group（P＜ 0.01）.The 4-HPR liposome solution group and the 4-HPR microbubble group both showed significantly increased apoptosis rates（21.81% ±3.73%,39.79% ±1.61%,respectively）compared with the control group（6.18% ± 0.61%,bothP＜ 0.01）.ConclusionThe 4-HPR microbubbles are successfully prepared,and 4-HPR in different vehicles all can promote HKF apoptosis and suppress HKF proliferation,among which,4-HPR microbubbles in combination with ultrasonic treatment have stronger inhibitory effects than the 4-HPR liposome solution.

Tretinoin;Keloid;Fibroblasts;Cell proliferation;4-Hydroxyphenyl-retinamide

金哲虎，Email：jinzh_621@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.010

國家自然科學基金（81260233）；吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究項目［吉教科合字（2012）第2號］；吉林省衛(wèi)生廳科研課題（2011Z085）；吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)專項（2013C034）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81260233）;Science and Technology Research Project of the Education Department of Jilin Province during the 12th Five-Year Plan Period［（2012）2］;Research Foundation of Health Department of Jilin Province of China（2011Z085）;Research and Development Planning Project of Industries and Technology of Jilin Province of China（2013C034）

2016-12-02）

（本文編輯：尚淑賢）