高通量測(cè)序分析重度尋常痤瘡患者和健康人腸道菌群差異

閆慧敏 趙惠娟 郭獨(dú)一 張春雷 姜薇

100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

高通量測(cè)序分析重度尋常痤瘡患者和健康人腸道菌群差異

閆慧敏 趙惠娟 郭獨(dú)一 張春雷 姜薇

100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

目的利用高通量測(cè)序技術(shù)分析重度尋常痤瘡患者和健康人腸道菌群的差異。方法門診確診的重度尋常痤瘡患者10例及年齡、性別相匹配的健康人10例，分別收集糞便標(biāo)本，提取細(xì)菌DNA，行16S rRNA測(cè)序鑒定微生物的種類，并進(jìn)行菌群差異分析。結(jié)果兩組腸道菌群多樣性未發(fā)現(xiàn)顯著差異，僅在腸道菌群的相對(duì)豐度上發(fā)現(xiàn)個(gè)別具有顯著差異的菌。兩組標(biāo)本主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門組成。比較兩組在門、屬水平上菌群相對(duì)豐度，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在種水平上，Blautia producta、Coprococcus eutactus在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論重度尋常痤瘡患者和健康人相比，菌群多樣性指數(shù)未見明顯差異。但某些細(xì)菌菌種存在顯著差異。

尋常痤瘡；腸道菌群；高通量測(cè)序

近期有學(xué)者提出，腸道微生物可能也參與尋常痤瘡的發(fā)?。?］，尋常痤瘡患者發(fā)生胃腸道癥狀（口臭、胃反流、腹脹、便秘）的風(fēng)險(xiǎn)高于正常人［2］。我們選取10例重度尋常痤瘡患者和10例年齡、性別相匹配的健康人，并收集他們的糞便，通過高通量測(cè)序細(xì)菌16S rRNA基因序列技術(shù)分析比較重度尋常痤瘡患者與健康人腸道菌群分布的差異。

材料與方法

一、對(duì)象

2016年1-8月在北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科就診的重度尋常痤瘡（診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國(guó)痤瘡治療指南［3］）患者（患者組）以及健康人群。重度尋常痤瘡患者10例，男4例，女6例，年齡17～ 35（平均24.4）歲，體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）＜24。無皮膚病的健康對(duì)照組10例，男4例，女6例，年齡19～31（平均24.9）歲，BMI＜24。兩組入選者年齡、性別、體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：過去2個(gè)月內(nèi)局部或系統(tǒng)使用過抗生素、激素、維A酸類藥物及免疫抑制劑；有胃腸道疾病及其他系統(tǒng)性疾??；孕期及哺乳期婦女。

二、試劑與方法

1.標(biāo)本采集：收集上述20例研究對(duì)象的糞便于無菌容器中，-20℃儲(chǔ)存。

2.DNA提?。翰杉瘶?biāo)本后24 h內(nèi)提取DNA，采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit DNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）提取DNA，使用QubitFluorometer試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）檢測(cè)DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品完整性。DNA于-20℃儲(chǔ)存。

3.生物信息學(xué)分析：提取患者組和對(duì)照組細(xì)菌總DNA后，送至深圳華大基因科技有限公司行16S rRNA基因V4區(qū)高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)分析。①使用FLASH軟件將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成1條序列，得到高變區(qū)的Tags；②用UPARSE軟件以與16S rRNA序列相似度＞97%對(duì)序列進(jìn)行操作單元（OTU）聚類，得到OTU的代表序列，通過RDP classier軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)（Greengene）比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8；③使用mothur軟件（http：//www.mothur.org/wiki/Calculators）分析微生物的群落多樣性及豐度，Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括Observed species指數(shù)，Chao指數(shù)，Shannon指數(shù)，其中Observed species、Chao指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，Shannon指數(shù)反映群落的多樣性，計(jì)算樣本的Alpha多樣性值并用R軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線圖；④采用Beta多樣性分析樣品在物種多樣性方面的差異，其中，Clustering聚類分析可以判斷各樣品的物種組成相似性，樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似；PCA分析是將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，兩個(gè)樣品距離越近，則表示兩個(gè)樣品的組成越相似。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Wilcoxon Rank-Sum Test分析兩組樣品在不同分類學(xué)水平的差異，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、樣品測(cè)序與聚類

20份樣品共測(cè)出641 745條高質(zhì)量的近全長(zhǎng)16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品32 087條，其中患者組共得到321 276條，對(duì)照組320 469條。20個(gè)樣本中共聚類為588 OTUs，其中患者組467 OTUs，對(duì)照組501 OTUs，380 OTUs為兩者共有。

二、Alpha多樣性分析

Observed species指數(shù)稀釋曲線、Chao指數(shù)稀釋曲線均達(dá)到平臺(tái)期，表示測(cè)序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種（圖1、2）；對(duì)照組和患者組的Shannon指數(shù)均分布在2.0～3.5之間（圖3），兩組的物種多樣性未見明顯差異。此外，Observed species指數(shù)分布、Chao指數(shù)分布、Shannon指數(shù)分布對(duì)照組與患者組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響，相同物種豐富度情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性，由于所有樣品的測(cè)序深度已達(dá)到要求，所以Shannon結(jié)果未受影響。

三、微生物分類

圖1 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便細(xì)菌總DNA Observed species指數(shù)稀釋曲線

圖2 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便細(xì)菌總DNA Chao指數(shù)稀釋曲線

圖3 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便細(xì)菌總DNA Shannon指數(shù)盒形圖

表1 重度尋常痤瘡患者和健康對(duì)照腸道菌群樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

表1 重度尋常痤瘡患者和健康對(duì)照腸道菌群樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）

注：n=20。Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，Shannon指數(shù)反映群落的多樣性

組別對(duì)照組患者組P值例數(shù)10 10 Observed species 184.30±55.86 188.60±28.89 0.85 Chao 202.08±53.23 209.72±32.41 0.85 Shannon 2.77±0.80 2.73±0.56 1.00

588 OTUs分屬于12個(gè)細(xì)菌門，其中11個(gè)細(xì)菌門為兩組共有，迷蹤菌門（Elusimicrobia）只存在于對(duì)照組，對(duì)照組和患者組大部分的腸道菌群屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmcutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），見圖4。對(duì)照組與患者組的平均豐度擬桿菌門最高分別為58.71%、60.80%，其次是厚壁菌門31.24%、30.59%，變形菌門6.64%、6.34%，放線菌門1.84%、0.35%，梭桿菌門（Fusobacteria）1.39%、1.82%，兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中，有1例患者和1例健康人梭桿菌門豐度較高。

分析屬水平，20份標(biāo)本共鑒定出83個(gè)細(xì)菌屬，其中擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）、布勞特菌（Blautia）、梭桿菌屬（Faecalibacterium）、梭菌屬（Fusobacterium）、毛螺菌屬（Lachnospira）、巨單胞菌屬（Megamonas）、顫螺菌屬（Oscillospira）、巨球菌屬（Megasphaera）、Parabacteroides、薩特菌屬（Sutterella）、羅氏菌屬（Roseburia）、Phascolarctobacterium、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）在兩組中含量豐富（＞1%）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

在種水平上，20份標(biāo)本共鑒定出55個(gè)細(xì)菌種，在兩組中豐度較高的種（＞1%）有糞擬桿菌（Bacteroides caccae）、普通擬桿菌（Bacteroides plebeius）、單形擬桿菌（Bacteroides uniformis）、柔嫩梭菌群（Faecalibacterium prausnitzii）、普氏菌卡布里（Prevotella copri），其中，Blautia producta的平均豐度對(duì)照組為0.05%，患者組為0.02%，P=0.038；Coprococcus eutactus平均豐度對(duì)照組為0.18%，患者組為0.01%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他菌種組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

四、Beta多樣性分析

本研究中，Clustering聚類分析，對(duì)照組和患者組未聚集成兩個(gè)明顯的簇，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCA分析，對(duì)照組和患者組樣品彼此間的距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組微生物的種類及豐度均相似。見圖7、8。

圖4 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便樣品細(xì)菌門水平物種豐度圖

圖5 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便樣品細(xì)菌屬水平物種豐度圖

圖6 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便樣品細(xì)菌種水平物種豐度圖

討 論

人類腸道系統(tǒng)大約有1 000多種細(xì)菌，在糞便中的微生物細(xì)胞密度約為1 013～1 014個(gè)/g，其中，70%的微生物位于結(jié)腸［4］。我們采用高通量測(cè)序方法分析重度尋常痤瘡患者和健康人腸道微生物組成的差別。由于肥胖［5］、年齡［6］會(huì)影響腸道微生物的組成，故我們選取的研究對(duì)象為青年人，BMI＜ 24。

本研究共得到了641 745條序列，聚類成588 OTUs，分成12個(gè)門、83個(gè)屬、55個(gè)種，兩組常見的細(xì)菌門均是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，兩組擬桿菌門、厚壁菌門之和占了腸道菌群的90%，擬桿菌門的含量更高，與其他兩項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究的結(jié)果一致［6-7］，但與美國(guó)人及埃及人的研究結(jié)果不同［8］。在美國(guó)人腸道研究顯示，厚壁菌門含量最高，其次是擬桿菌門，且兩者之比為1.4，埃及人為1.1，而本研究為0.5。這可能是由東西方飲食習(xí)慣不同造成的。有研究顯示，高蛋白、高動(dòng)物脂肪飲食會(huì)導(dǎo)致擬桿菌門含量高，而長(zhǎng)期的碳水化合物飲食會(huì)導(dǎo)致厚壁菌門含量高［9］，厚壁菌門/擬桿菌門的比值可作為潛在的人類腸道病理狀況的的生物學(xué)指標(biāo)［4］。本研究中兩組厚壁菌門/擬桿菌門比值相同，說明患者組的腸道微生物和對(duì)照組相似，并非處于病理狀況。

圖7 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便細(xì)菌總DNA clustering聚類圖 N：健康對(duì)照組；P：患者組

Manzhalii等［10］發(fā)現(xiàn)，Bafidobacteria、Lactobacteria可以改善面部具有丘疹、膿皰患者的臨床癥狀，而在本研究中，此兩種菌在痤瘡患者組的豐度與對(duì)照組無明顯差異。Loveman等［11］為了驗(yàn)證腸道微生物是否參與尋常痤瘡的發(fā)生，用培養(yǎng)的方法來分析尋常痤瘡患者和正常人腸道微生物，未發(fā)現(xiàn)差異。由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只能培養(yǎng)出腸道微生物的10%～30%［12］，所以我們采用了現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)16S RNA測(cè)序來鑒定和分析腸道微生物菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Blautia producta、Coprococcus eutactus存在顯著差異，尋常痤瘡患者腸道內(nèi)兩種菌的比例明顯降低。Blautia producta屬于革蘭染色陽(yáng)性厭氧菌，厚壁菌門梭菌綱，它在腸道內(nèi)與其他菌群一起加強(qiáng)腸道功能并抵抗病原菌的入侵［13］，將不易消化的碳水化合物轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸為人體供能，還可與其他梭菌屬一起增加腸道內(nèi)丁酸鹽的形成，并能降解黏蛋白、β 天冬氨酰甘氨酸、膽紅素［14］。Coprococcus eutactus也屬于梭菌綱，革蘭陽(yáng)性厭氧菌，也具有產(chǎn)生丁酸鹽的能力［15］。丁酸鹽主要在結(jié)腸形成，不僅具有維持腸道功能穩(wěn)定的作用，且具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化的功能［16］。丁酸鹽還可以調(diào)節(jié)結(jié)腸中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化和增殖［17］，增加小鼠T細(xì)胞抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化的能力［18］。有研究報(bào)道，腸易激綜合征患者比健康人腸道內(nèi)Coprococcus eutactus及其相關(guān)菌含量明顯減少［19］，輕型濕疹患者腸道內(nèi)Coprococcus eutactus及其他產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌種類及豐度比重度濕疹患者增多，提示丁酸鹽可減輕濕疹的癥狀［20］。這兩種菌在尋常痤瘡患者組腸道菌群中含量明顯降低，腸道內(nèi)丁酸鹽形成減少，腸道穩(wěn)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，進(jìn)而誘發(fā)或加重尋常痤瘡的發(fā)生，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

圖8 10例重度尋常痤瘡患者和10例健康對(duì)照糞便微生物群落主成分分析圖 藍(lán)色線條（P）：重度尋常痤瘡患者；紅色線條（N）：健康對(duì)照

本研究表明，尋常痤瘡患者和健康人腸道菌群多樣性無差異，在腸道微生物的相對(duì)豐度上發(fā)現(xiàn)個(gè)別具有顯著差異的菌，即產(chǎn)丁酸鹽的菌種（Blautia producta、Coprococcus eutactus），尋常痤瘡患者組較健康組的產(chǎn)丁酸鹽的菌種含量明顯減少，提示產(chǎn)丁酸鹽的相關(guān)菌可能具有減輕尋常痤瘡癥狀的作用。

因本研究樣本量相對(duì)較小，故未對(duì)性別進(jìn)行分組，但性別對(duì)腸道微生物也有一定影響［21］，16S rRNA序列分析技術(shù)對(duì)微生物的種類的鑒定仍存在一定局限性，因此腸道菌群對(duì)尋常痤瘡發(fā)病影響的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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High-throughput sequencing analysis of gut microbiome in patients with severe acne vulgaris and healthy individuals

Yan Huimin,Zhao Huijuan,Guo Duyi,Zhang Chunlei,Jiang Wei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

Jiang Wei,Email:jiangwei7366@163.com

ObjectiveTo compare differences of gut microbiome between patients with severe acne vulgaris and healthy individuals by using high-throughput sequencing technology.MethodsStool samples were collected from 10 outpatients with severe acne vulgaris and 10 age-and sex-matched healthy controls.Then,the bacterial DNA was extracted and subjected to 16S rRNA sequencing for the identification of microbial species,and the differences of gut microbiome were compared between the patients and controls.ResultsThere were no significant differences in the diversity of intestinal microflora,but only the relative abundance of a few bacteria differed significantly between the two groups.Gut microbiome in the two groups mainly consisted ofBacteroidetes,Firmicutes,ProteobacteriaandActinobacteria.There were no significant differences in the relative abundance of bacteria at the phylum and genus levels between the two groups.However,the relative abundance ofBlautia productaandCoprococcus eutactusat the species level differed remarkably between the two groups.ConclusionNo significant differences in the bacterial diversity indices are found,but some bacterial species significantly differ between the patients with severe acne vulgaris and healthy controls.

Acne vulgaris;Gut microbiome;High-throughput sequencing

姜薇，Email：jiangwei7366@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201216）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81201216）

2016-12-07）

（本文編輯：顏艷）