薄層色譜-生物自顯影技術(shù)在活性物質(zhì)篩選中的應(yīng)用

丁曉艷，趙英博，王偉杰，白聰聰，關(guān)佩沛

薄層色譜-生物自顯影技術(shù)在活性物質(zhì)篩選中的應(yīng)用

丁曉艷，趙英博，王偉杰，白聰聰，關(guān)佩沛*

薄層色譜-生物自顯影技術(shù)(TLC-bioautography)將薄層色譜分離和生物活性測(cè)定相結(jié)合，是一種活性指導(dǎo)下的快速靶向追蹤分離、篩選活性成分的方法。此法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度和專屬性高，常應(yīng)用于抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化，以及對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑、葡萄糖苷酶抑制劑等活性天然產(chǎn)物的篩選。筆者對(duì)薄層色譜-生物自顯影技術(shù)在活性物質(zhì)篩選方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

薄層色譜-生物自顯影；抗菌；膽堿酯酶抑制活性；抗氧化；葡萄糖苷酶抑制活性

0 引言

薄層色譜-生物自顯影技術(shù)(TLC-bioautography)是上個(gè)世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種將現(xiàn)代色譜技術(shù)和生物技術(shù)結(jié)合在一起的快速尋找天然活性化合物的方法?；钚猿煞挚稍诒影迳现苯语@現(xiàn)肉眼可見的斑點(diǎn)，可從粗提物中直接篩選出活性成分，是一種活性指導(dǎo)下的快速靶向追蹤分離、篩選活性成分的方法。傳統(tǒng)的從天然產(chǎn)物中分離活性成分的方法首先要分離出天然產(chǎn)物中的化合物，然后篩選各化合物的活性，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)分離出的化合物為非活性物質(zhì)或者化合物的量不足以進(jìn)行大量活性篩查的情況。而TLC-生物自顯影技術(shù)可使樣品分離、定位和活性評(píng)價(jià)一次完成，在活性指導(dǎo)下進(jìn)行分離可以減小化合物分離的盲目性，大大縮短活性成分的分離時(shí)間。該法具有操作簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低、靈敏度和專屬性高等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物分離和活性物質(zhì)篩選中得到了廣泛的應(yīng)用[1]。TLC-生物自顯影技術(shù)最初用于抗菌活性成分的篩選[2-3]，后來(lái)逐漸被應(yīng)用于抗氧化、膽堿酯酶抑制活性、葡萄糖苷酶抑制活性、脂酶抑制活性等方面的篩選，筆者就TLC-生物自顯影技術(shù)在天然產(chǎn)物活性成分篩選方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 TLC-生物自顯影對(duì)抗菌活性的篩選

應(yīng)用TLC-生物自顯影進(jìn)行抗菌活性的篩選是TLC-生物自顯影技術(shù)應(yīng)用最早的方面，也是迄今應(yīng)用最多、最廣泛的方法。其基本原理是利用薄層板將混合物展開，然后將薄層板與接種了細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)基相接觸，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，無(wú)抗菌活性的部位會(huì)被生長(zhǎng)出的病原微生物所覆蓋，通過(guò)加入四唑鹽等染色而呈現(xiàn)背景色，而有抗菌活性的部位因抑制了細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)而呈現(xiàn)抑制斑點(diǎn)，這樣就可從混合物中篩選出活性成分[2-3]。常用的四唑鹽有噻唑藍(lán)(MTT)、對(duì)碘硝基四唑紫(INT)、氯化三苯四氮唑(TTC)等。

TLC-生物自顯影技術(shù)用于抗菌活性篩選主要有3種形式，即瓊脂擴(kuò)散生物自顯影法[4](Agar-diffusion bioautography)、瓊脂覆蓋生物自顯影法[5](Agar-overlay bioautography)和直接生物自顯影法[6](Direct bioautography)。前2種方法存在靈敏度低等缺點(diǎn)，應(yīng)用受到一定限制，而直接法中化合物分離、預(yù)處理、培養(yǎng)及自顯影都直接在薄層板上進(jìn)行，是現(xiàn)在應(yīng)用最多的生物自顯影方法。

應(yīng)用TLC-生物自顯影方法可以指導(dǎo)從來(lái)自植物提取物或微生物代謝產(chǎn)物中分離具有抗菌活性的化合物，根據(jù)TLC-生物自顯影的結(jié)果，可對(duì)提取物各部分的生物活性進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而有目的地進(jìn)行下一步的提取分離。部分利用TLC-生物自顯影技術(shù)篩選天然產(chǎn)物中抗菌活性成分的應(yīng)用情況見表1。

2 TLC-生物自顯影對(duì)葡萄糖苷酶抑制劑的篩選

葡萄糖苷酶的作用是水解葡萄糖苷鍵釋放出葡萄糖，是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶。近年來(lái)，葡萄糖苷酶抑制劑的篩選受到廣泛關(guān)注，因?yàn)棣?葡萄糖苷酶抑制劑可以減慢小腸中淀粉類物質(zhì)分解為葡萄糖的速度，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖，可以成為有效的2型糖尿病的治療藥物。Salazar等[11]首先將TLC-生物自顯影技術(shù)應(yīng)用于β-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選，其以七葉苷為酶底物，F(xiàn)eCl3為染色劑，在薄層板上，有β-葡萄糖苷酶抑制劑活性的部位顯示白色斑點(diǎn)，而其他無(wú)活性部位顯示深棕色背景。但是這一方法采用植物提取物作為酶底物，具有一定的局限性。

Sim?es-Pires等[12]在此基礎(chǔ)上，建立了專屬性更強(qiáng)的TLC-生物自顯影方法用于α-和β-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選。其方法是將待測(cè)植物提取物在薄層板上展開后噴上α-(或β-)葡萄糖苷酶，孵育后噴2-萘基-α-D-吡喃葡萄糖苷(或2-萘基-β-D-吡喃葡萄糖苷)與固藍(lán)(Fast Blue Salt)的混合溶液，2～5 min后即可顯色。其原理是α-葡萄糖苷酶可以水解酶底物2-萘基-α-D-吡喃葡萄糖苷釋放出2-萘酚，2-萘酚與固藍(lán)鹽反應(yīng)生成紫色的重氮鹽染料。在薄層板上，有活性化合物存在的部分呈現(xiàn)白色斑點(diǎn)，其他部分形成紫色背景。此法靈敏度較高，化合物環(huán)己烯四醇B、粟精胺和米格列醇的檢測(cè)限可分別低至0.1、0.05、0.005 μg。Theiler等[13]在此方法基礎(chǔ)上做了輕微調(diào)整，以HPTLC-生物自顯影結(jié)果為指導(dǎo)，從J.secunda葉子的提取物中快速富集并分離了新的具有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的化合物2-咖啡酰氧基-4-羥基-戊二酸及非對(duì)映異構(gòu)體secundarellone B、C。Yang等[14]也在TLC-生物自顯影技術(shù)的指導(dǎo)下，從塊根糙蘇(PhlomistuberosaL.)中分離了20個(gè)化合物，其中15個(gè)化合物顯示了很好的α-葡萄糖苷酶抑制劑活性，其IC50值在0.067～1.203 mmo/L范圍內(nèi)，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖[IC50值為(3.72±0.113) mmol/L]。

表1 TLC-生物自顯影技術(shù)應(yīng)用于抗菌活性物質(zhì)的篩選

注：“—“未測(cè)定

3 TLC-生物自顯影對(duì)抗氧化劑的篩選

自由基是生物體產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起生物體衰老與疾病。TLC-生物自顯影可對(duì)天然提取物中具有自由基清除及抗氧化活性的化合物進(jìn)行篩選。最常應(yīng)用的顯色劑是1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl radical，DPPH)[15-16]，紫色的DPPH可與具有抗氧化活性的化合物結(jié)合生成黃色的DPPH-H，在展開的薄層板上噴灑DPPH后，具有抗氧化活性的部位呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，而其他部位未發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)紫色背景。如Gu等[15]以TLC-生物自顯影的結(jié)果作為指導(dǎo)，從紫蘇子(Perillafrutescensvar.acuta)中分離得到4個(gè)具有抗氧化活性的化合物，其中迷迭香酸和木犀草素顯示了非常顯著的自由基清除能力(IC50分別為8.61、7.50 μmol/L)。

為了優(yōu)化生物自顯影在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用，谷麗華等[17]選擇了2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基反應(yīng)體系，結(jié)果顯示，在可見光下檢視或在734 nm下掃描，薄層板獲得明顯的藍(lán)色背景色，具有清除ABTS自由基活性的化合物與ABTS+·反應(yīng)生成無(wú)色的ABTS-H而呈現(xiàn)白色斑點(diǎn)。此外，Corsino等[18]用β胡蘿卜素檢測(cè)薄層板上的抗氧化劑，用0.02%的β胡蘿卜素二氯甲烷溶液噴灑展開后的薄層板，在自然光照射下即可使薄層板上的背景色褪去，而活性部位仍顯黃色。Su等[19]將展開后的薄層板浸在黃嘌呤氧化酶(XO)溶液中孵育，然后再將薄層板浸在含有黃嘌呤和氯化硝基四氮唑藍(lán)的溶液中孵育，具有清除O2·-活性的部位顯示白色或黃色條帶，而無(wú)活性部位顯示紫色背景。

4 TLC-生物自顯影對(duì)膽堿酯酶抑制劑的篩選

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是在世界范圍內(nèi)越來(lái)越普遍的老年性疾病，其發(fā)病率越來(lái)越高，同時(shí)愈趨年輕化。目前普遍使用乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑治療AD，其基礎(chǔ)是膽堿能假說(shuō)。植物是AChE抑制劑的主要來(lái)源，采用TLC-生物自顯影技術(shù)可以高效快速地對(duì)植物提取物中具有AChE抑制活性的物質(zhì)進(jìn)行篩選。最初使用的是Ellman′s法，以硫代乙酰膽堿(Acetylthio choline)為底物，DTNB[5,5-dithiobis-(2-nitro benzoic acid)]為顯色劑[20]，但這種方法的檢測(cè)靈敏度不高。Marston等[21]以乙酸1-萘酯為酶底物，固藍(lán)B鹽為顯色劑，可使檢測(cè)靈敏度提高，是目前比較常用的方法。此方法檢測(cè)模型藥物毒扁豆堿的檢測(cè)限可低至1 ng，加蘭他敏的檢測(cè)限可至10 ng[21]。Yang等[22]在此基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，降低了酶的用量，增加了酶與底物的孵育時(shí)間，同時(shí)降低顯色劑濃度，可將方法的檢測(cè)限大大降低。用此法測(cè)定模型藥物石杉?jí)A甲的檢測(cè)限可低至1×10-10μg，毒扁豆堿的檢測(cè)限可低至1×10-5μg。Ramallo等[23]將酶液加到瓊脂中，可將TLC-生物自顯影與MS結(jié)合，進(jìn)一步分析粗提物中活性成分的化學(xué)式，從而加速AChE抑制劑的確認(rèn)，避免了薄層板上離子成分對(duì)MS分析的干擾。但是，以上方法只適用于正相薄層板，對(duì)于反相薄層板，其表面為疏水性，阻礙了包含酶液和試劑的親水性層在反相薄層板表面沉積，另外，親水層和疏水層界面的排斥還降低了化合物的擴(kuò)散效率。為此，Ramallo等[24]發(fā)展了適用于反相薄層板的TLC-生物自顯影系統(tǒng)。此法將具有兩親性的三嵌段共聚物Pluronic?加入酶液中，既提高了酶穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，又有助于AChE向非極性的反相板遷移。并且該法以吲哚乙酸酯為酶底物，既可以用熒光法又可以用可見光法檢測(cè)活性斑點(diǎn)。

5 TLC-生物自顯影對(duì)脂酶抑制劑的篩選

胰脂肪酶是體內(nèi)消化三酰甘油的一種重要的酶，抑制胰脂肪酶可以降低小腸中膳食脂肪的吸收效率，從而減輕肥胖。應(yīng)用TLC-生物自顯影技術(shù)可以幫助從天然產(chǎn)物中篩選出高效的脂酶抑制劑。Hassan等[25]在之前方法的基礎(chǔ)上，建立了用該技術(shù)篩選脂酶抑制劑的方法。該法以α-乙酸萘酯為底物，固藍(lán)B鹽為顯色劑，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照藥物奧利司他的檢測(cè)靈敏度可低至0.01 μg，對(duì)于成分復(fù)雜的植物粗提物如野茶樹Camelliasinensis(L.) kuntz和迷迭香RosmarinusofficinalisL，當(dāng)上樣量分別達(dá)到82 和56 μg時(shí)，也可顯示出明顯的脂酶抑制劑活性。而此法的特異性不強(qiáng)，因此，Tang等[26]發(fā)展了一種更穩(wěn)定可靠、特異性更強(qiáng)的方法，此法采用β-肉豆蔻酸萘酯為底物，更能模擬人的生理過(guò)程。Tang等[26]用此法分析了6種純化合物和3種植物粗提物的脂酶抑制劑活性，其中化合物奧利司他的檢測(cè)限可達(dá)0.01 ng，方法的靈敏度和特異性都顯著提高。Bayineni等[27]也建立了一種TLC-生物自顯影篩選脂酶抑制劑的方法，該法以p-硝基苯基丁酸酯為底物，溴麝香草酚藍(lán)為顯色劑，結(jié)果脂酶抑制劑的活性區(qū)域會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)色斑點(diǎn)，而非活性區(qū)域呈現(xiàn)黃綠色的背景。此法對(duì)奧利司他的檢測(cè)限可達(dá)1 ng。

6 TLC-生物自顯影對(duì)酪氨酸酶抑制劑的篩選

酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，其活性與人的色素障礙性疾病密切相關(guān)。酪氨酸酶抑制劑可用于人的色素沉著性疾病，如黑色素瘤、色斑等，也可以用于化妝品的增白劑及果蔬的保鮮等。Wangthong等[28]首先將TLC-生物自顯影技術(shù)用于酪氨酸酶抑制劑的篩選，此法在展開的薄層板上噴灑酪氨酸酶和L-酪氨酸，具有酪氨酸酶抑制活性的部位會(huì)形成白色斑點(diǎn)，而無(wú)活性部位則呈棕紫色背景。然而L-酪氨酸水溶性較差，導(dǎo)致反應(yīng)體系中酶底物不足，而使檢測(cè)靈敏度降低(陽(yáng)性對(duì)照藥曲酸僅為15.6～20.0 ng)。Taibon等[29]將方法改進(jìn)，直接用水溶性較好的L-DOPA作為酶底物，并進(jìn)一步在L-DOPA中加入Triton-X100以避免假陽(yáng)性結(jié)果。Zhou等[30]也用L-DOPA作為酶底物，優(yōu)化了酶和底物濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間、反應(yīng)系統(tǒng)pH值以及薄層板類型等條件，降低了酶使用量，提高了檢測(cè)靈敏度，陽(yáng)性對(duì)照藥曲酸的檢測(cè)限可低至1 ng。García等[31]用兩親性共聚物凝膠包被的方法，進(jìn)一步將方法的可用范圍擴(kuò)展到反相薄層板。

7 其他方面的應(yīng)用

TLC-生物自顯影技術(shù)因其快速、有效、方便等特點(diǎn)，已在天然藥物化學(xué)中占有越來(lái)越重要的位置?？蒲泄ぷ髡哌€在開發(fā)更廣泛的TLC-生物自顯影技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。如：Gu等[32]應(yīng)用TLC-生物自顯影方法用于二肽基肽酶Ⅳ抑制劑的篩選，Salazar等[33]應(yīng)用TLC-生物自顯影方法用于沙門氏菌PhoP-PhoQ調(diào)節(jié)系統(tǒng)抑制劑的篩選等。期待TLC-生物自顯影技術(shù)有更廣闊的應(yīng)用前景。

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ApplicationofTLC-bioautographyinactivecomponentsscreening

DING Xiao-yan,ZHAO Ying-bo,WANG Wei-jie,BAI Cong-cong,GUAN Pei-pei*

(College of Life and Health Sciences,Northeastern University,Shenyang 110169,China)

TLC-bioautography is a method of fast target tracking,separating and screening of active ingredients,which is based on the combination of thin-layer chromatography with bioactivity assays.This method has the advantages of simple operation,saving time,and high sensitivity and specificity,which is often used in the active components screening of antibacteria,antifungus,antioxidant,cholinesterase inhibitors,glucosidase inhibitiors and others.In this paper,the application of TLC-bioautography in the screening of active substances is reviewed.

TLC-bioautography;Antimicrobial;Cholinesterase inhibition;Antioxidation;Glucosidase inhibition

2017-04-17

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽(yáng) 110169

東北大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目(160100)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201710030