高精料日糧對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和生物胺生成的影響

王東升，張露露

（1.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海 200436；2.北京中農(nóng)榜樣蛋雞育種有限責(zé)任公司，北京 102100）

高精料日糧對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和生物胺生成的影響

王東升1，張露露2

（1.上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海 200436；2.北京中農(nóng)榜樣蛋雞育種有限責(zé)任公司，北京 102100）

為研究飼喂高精料日糧條件下奶牛瘤胃發(fā)酵情況，選取4頭初產(chǎn)的健康荷斯坦牛進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂高精料日糧顯著提高了奶牛瘤胃液中乳酸、總VFA、丁酸、戊酸和總支鏈VFA的含量，同時(shí)乙丙比顯著降低，但未能顯著降低乙酸和NH3-N水平；同時(shí)，與飼喂低精料日糧相比，飼喂高精料的奶牛瘤胃液中的生物胺含量顯著增加（P<0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，瘤胃液pH與瘤胃液中生物胺含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。高精料日糧顯著提高了瘤胃液中的乳酸桿菌數(shù)量（P<0.05），但對(duì)牛鏈球菌數(shù)量無(wú)顯著影響（P>0.05）。結(jié)果表明，飼喂高精料改變了奶牛瘤胃的微生物菌群，進(jìn)而影響了瘤胃的發(fā)酵參數(shù)，并促進(jìn)消化道內(nèi)異常代謝產(chǎn)物——生物胺的生成與轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響奶牛的健康。

精粗比；奶牛；瘤胃液；生物胺

瘤胃酸中毒是現(xiàn)代規(guī)模集約化養(yǎng)殖條件下的主要營(yíng)養(yǎng)代謝疾病之一。雖然現(xiàn)在的普遍看法是，高精料日糧導(dǎo)致瘤胃pH過(guò)低是引起瘤胃酸中毒的主要因素，但其他微生物源的毒性因子，如乙醇、胺類和內(nèi)毒素也在酸中毒發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[1,2]。在這些毒性因子中，生物胺如組胺、酪胺和色胺是由瘤胃中相應(yīng)氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生的。在這三種生物胺中，組胺由于其在蹄葉炎中的特殊作用而備受關(guān)注[3,4]。但目前人們對(duì)瘤胃液中酪胺、色胺、腐胺和甲胺的來(lái)源、產(chǎn)量和代謝的了解仍不充分。因此，本試驗(yàn)研究了高精料條件下奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)、微生物菌群情況、生物胺變化情況，同時(shí)也評(píng)價(jià)了瘤胃液pH與生物胺含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用4頭裝有永久性瘺管的健康初產(chǎn)奶牛（初始體重為473.75±49.56kg，泌乳期60～140d），并隨機(jī)進(jìn)行2×2交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)期21d。日糧滿足或超過(guò)奶牛每天產(chǎn)20kg牛奶的能量要求(NRC, 2001)，日飼喂2次（07:00，18:00），日糧組成見(jiàn)表1。在整個(gè)試驗(yàn)期，奶牛分欄飼養(yǎng)(剩料量在5%左右)，并自由飲水。

1.2 瘤胃液樣品及其分析

每期試驗(yàn)的第12、15、17天在采食前0h和采食后4h，第21天在采食前0h和采食后2、4、6、8、10、12h采集瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾后，立即測(cè)定pH。濾液保存在-20℃，以測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、氨態(tài)氮（NH3-N)、乳酸和生物胺的含量。VFA采用Qin[5]建立的毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定；NH3-N采用Weatherburn[6]建立的比色法進(jìn)行測(cè)定；乳酸采用Barker等[7]建立的比色法測(cè)定；生物胺采用反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[8]。

表1 日糧原料組成和營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 飼料樣的化學(xué)分析

在試驗(yàn)期收集飼料原料，利用國(guó)標(biāo)法測(cè)定DM、Ash、EE、NDF和ADF的含量。其中NFC的計(jì)算公式為：NFC=100-（%NDF+%CP+%Ash+%EE）。CP采用Krishnamoorthy等[9]建立的方法測(cè)定。

1.4 DNA的提取和乳酸菌、鏈球菌的測(cè)定

解凍的樣品，利用吳惠芬等[10]建立的方法提取DNA，然后將得到的DNA樣品保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

利用Real time PCR法測(cè)定乳酸菌和鏈球菌，引物見(jiàn)表2。Real Time PCR測(cè)定使用AB 7300系統(tǒng)和序列測(cè)定軟件（version 1.3）。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ 10min、40個(gè)循環(huán)的95℃變性和60℃復(fù)性/延伸，而其溶解曲線的程序是：95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、60℃15s。為評(píng)價(jià)每種引物的擴(kuò)增效率，DNA模板(每個(gè)混合體系中50ng)被混合和序列稀釋8倍。

表2 定量PCR所用引物

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS18.0混合模型中的重復(fù)度量來(lái)分析瘤胃液pH、生物胺、NH3-N 和VFA的含量。

瘤胃液pH與瘤胃內(nèi)、外周血液中和糞中生物胺濃度的相關(guān)性分析利用GraphPad Prism version 5.00的Pearson進(jìn)行。P<0.05表示差異顯著；P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料的營(yíng)養(yǎng)成分

與低精料日糧相比，高精料日糧的非纖維性碳水化合物含量更高，中性洗滌纖維含量更低（表1）。本研究中，高、低精料日糧的干物質(zhì)、凈能及可降解蛋白含量均可滿足試驗(yàn)牛營(yíng)養(yǎng)需要。

表3 瘤胃液中pH和VFA平均濃度

2.2 瘤胃液中pH和VFA的變化

圖1 兩個(gè)處理組pH、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、總VFA、乙丙比、總支鏈VFA和乳酸的濃度變化

在本研究中，飼喂低精料日糧奶牛的瘤胃pH與飼喂高精料的奶牛相比顯著升高(P<0.05)，而且瘤胃pH受采樣時(shí)間點(diǎn)的影響顯著(P<0.05)。在低精料組，瘤胃pH在飼喂后4h一直延續(xù)到采樣結(jié)束都保持在5.8以上。另外，采樣各天之間的數(shù)據(jù)表明：瘤胃pH受日糧和測(cè)量天的影響十分明顯。而天內(nèi)的數(shù)據(jù)表明：飼喂高精料和飼喂低精料日糧的奶牛相比，瘤胃中乳酸、丁酸、戊酸、總支鏈VFA和總VFA的含量明顯增加(P<0.05)，丙酸有增加的趨勢(shì)(P=0.051)，而乙酸沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。丙酸和丁酸在采食后4h和8h有顯著性增加(P<0.05)。不僅總VFA，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和總支鏈VFA含量均不受采樣天的影響，而且也不受采樣天與日糧處理的相互作用的影響（表3）。

2.3 瘤胃液中生物胺和NH3-N濃度的變化

表4 瘤胃液中生物胺和NH3-N濃度

圖2 兩個(gè)處理組酪胺、腐胺、組胺、甲胺、色胺和氨態(tài)氮濃度變化

表4表明，瘤胃液中生物胺與NH3-N濃度的天內(nèi)變化為：與飼喂低精料相比，飼喂高精料奶牛瘤胃液的酪胺、腐胺、組胺、甲胺、色胺濃度有顯著性增加（P<0.05），NH3-N濃度差異不大（P＞0.05）。其中，酪胺、腐胺、甲胺和色胺在采食后8h和10h有顯著性增加，而組胺是在采食后4h和6h有顯著性增加。

2.4 相關(guān)性分析

表5 瘤胃液pH與瘤胃液中生物胺含量的相關(guān)性

表5的結(jié)果表明：瘤胃pH與瘤胃中生物胺的濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)性（P<0.05）。

2.5 Real Time PCR 結(jié)果

表6 瘤胃液中主要產(chǎn)胺微生物的數(shù)量變化

由表6產(chǎn)胺微生物的相對(duì)數(shù)量的天間變化的數(shù)據(jù)可知：總菌和牛鏈球菌的相對(duì)數(shù)量不受飼喂的日糧精粗比、采樣天以及其交互作用的影響（P>0.05）。然而，乳酸桿菌的相對(duì)數(shù)量受飼喂日糧精粗比的影響顯著（P<0.05），但是不受采樣天和采樣天與飼喂日糧精粗比的交互作用的影響（P>0.05）。

3 討論

3.1 瘤胃液pH、VFA和乳酸

本研究顯示，瘤胃pH隨著精料的增加而降低，其與先前Mould等[11]的報(bào)道一致。在高精料條件下，可發(fā)酵碳水化合物對(duì)瘤胃pH的影響是由于其含有較少的中性洗滌纖維，另外，當(dāng)以玉米籽粒替代玉米青貯后，高精料中的非纖維性碳水化合物增加。由于玉米的消化率相對(duì)較高，因此，其發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生更多的VFA，最終導(dǎo)致瘤胃pH下降。本研究還顯示，飼喂高精料日糧增加了瘤胃液中VFA含量，該結(jié)果與Calsamiglia等[12]和Simmons等[13]的報(bào)道相一致。然而，盡管奶牛在亞急性酸中毒狀態(tài)下也能產(chǎn)生乳酸，但是由于乳酸發(fā)酵菌仍然具有活力[14]，能夠迅速代謝乳酸生成VFA，使其不能大量聚集。一般認(rèn)為，當(dāng)瘤胃中乳酸濃度超過(guò)40mmol/L時(shí)，奶牛處于急性酸中毒狀態(tài)[5]，然而在亞急性酸中毒狀態(tài)下其乳酸濃度并不超過(guò)5mmol/L[15,16]。而在本試驗(yàn)中，當(dāng)給奶牛飼喂高精料時(shí)，雖高精料組瘤胃液中的乳酸含量顯著性增加，但其濃度仍保持在正常濃度范圍內(nèi)（<5mmol/L），該結(jié)果說(shuō)明瘤胃pH的下降主要源于VFA的累積，而非乳酸累積所致。

3.2 瘤胃液中的生物胺及微生物

過(guò)去的研究表明，漢普母羊的瘤胃液中含有較高濃度的血管活性胺；當(dāng)提供含有大量可發(fā)酵碳水化合物的日糧時(shí)，瘤胃液中的色胺和酪胺的濃度會(huì)迅速增加[17]。因此，可以假設(shè)發(fā)酵碳水化合物的細(xì)菌（鏈球菌屬和乳酸菌屬）至少部分與它們的產(chǎn)生有關(guān)。本試驗(yàn)的研究表明：乳酸菌屬的細(xì)菌數(shù)量隨著可發(fā)酵碳水化合物的添加而顯著增加，然而牛鏈球菌屬細(xì)菌的數(shù)目卻有降低趨勢(shì)，這與前人研究結(jié)果不一致[18]?？赡艿脑蛉缦拢航o奶牛飼喂含大量可發(fā)酵碳水化合物的高精料時(shí)，牛鏈球菌的快速增殖僅僅出現(xiàn)在開(kāi)始飼喂和不適應(yīng)高精料日糧的階段。當(dāng)牛適應(yīng)高精料日糧后，瘤胃液中牛鏈球菌的數(shù)量降低，且其數(shù)量的下降不完全歸因于瘤胃液pH的下降[19]。因此，與牛鏈球菌相比，高精料下瘤胃生物胺數(shù)量的增加更可能與乳酸菌數(shù)量的增多有關(guān)。

高精料組瘤胃中的酪胺、腐胺、組胺、甲胺和色胺濃度與低精料組相比有顯著性增加，但是這5種生物胺的濃度與先前Sjaasted[20]、Bailey等[18]、Krause等[21]和Engelmann等[22]報(bào)道的并不一致。目前試驗(yàn)測(cè)得的生物胺濃度(酪胺 20.76μg/L，腐胺 55.1μmol/L，組胺>70μg/L，甲胺 9.2mg/100mL，色胺 6.31μg/L)相比先前報(bào)道的生物胺濃度(酪胺未測(cè)得，腐胺 12.37μmol/L，組胺 8.29mol/L，色胺 7.0μmol/L)有顯著性增加，但比另外的研究報(bào)道低[8,23,24]。這些結(jié)果表明，飼喂高精料增加了瘤胃的生物胺含量，而其反應(yīng)速度取決于飼喂精料水平和該日糧飼喂的持續(xù)時(shí)間。

3.3 瘤胃液pH與瘤胃液中生物胺濃度的相關(guān)性

瘤胃中酪胺、腐胺、組胺、甲胺和色胺含量受日糧組成、瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響[25～27]。前人研究表明，瘤胃pH與瘤胃液中的酪胺、腐胺、組胺、甲胺和色胺的濃度有相關(guān)性[28,29]。本試驗(yàn)得出的結(jié)論是，瘤胃液中酪胺、腐胺、組胺、甲胺和色胺濃度與瘤胃pH呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，高精料日糧能顯著提高奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)、生物胺濃度以及產(chǎn)胺微生物的數(shù)量，并降低瘤胃pH，但對(duì)瘤胃中乙酸無(wú)顯著影響。瘤胃液pH與瘤胃液中的生物胺濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。

[1]Dunlop R H. Phthogenesis of ruminant lactic acidosis[J]. Adv Vet Comp Med, 1972, 16:259-302.

[2]Owen F N, Secrist D S, Hill W J, et al. Acidosis in cattle: a review[J]. J Anim Sci, 1998, 76:275-286.

[3]Brent B E. Relationship of acidosis to other feedlot ailments[J]. J Anim Sci, 1976, 43:930-935.

[4]Nocek J E. Bovine acidosis:implications on laminitis[J]. J Dairy Sci, 1997, 80:1005-1028.

[5]Qin W L. Determination of rumen volatile fatty acids by means of gas chromatography (in Chinese, with English abstract)[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 1983, 3:82-89.

[6]Weatherburn M W. Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia[J]. Anal Chem, 1967, 39:971-974.

[7]Barker S B, Summerson W H. The colorimetric determination of lactic acid in biological material[J]. J Biol Chem, 1941, 138:535.

[8]王東升,霍文婕,朱偉云,等.反相高效液相色譜法測(cè)定瘤胃液中的生物胺[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(12):2165-2169.

[9]Krishnamoorthy U, Muscato T V, Sniffen C J, et al. Nitrogen fractions of selected feedstuffs[J]. J Dairy Sci, 1982, 65:217-225.

[10]吳惠芬,毛勝勇,姚文,等. 豬源乳酸菌產(chǎn)乳酸及其抑菌特性研究[J].微生物學(xué)報(bào),2005,32(1):79-84.

[11]Mould F L, Orskov E R.Manipulation of rumen fluid pH and its influence on cellulolysis in sacco, dry matter degradation and the rumen microflora of sheep offered either hay or concentrate[J].Animal Feed Science & Technology,1983,10(1):1-14.

[12]Calsamiglia S, Cardozo P W, Ferret A, et al. Changes in rumen microbial fermentation are due to a combined effect of type of diet and pH[J]. J Anim Sci, 2008, 86:702-711.

[13]Simmons N L, Chaudhry A S, Graham C, et al. Dietary regulation of ruminal bovine UT-B urea transporter expression and localization[J]. J Anim Sci, 2009, 87:3288-3299.

[14]Goad D W, Goad C L, Nagaraja T G. Ruminal microbial and fermentative changes associated with experimentally induced subacute acidosis in steers[J]. J Anim Sci, 1998, 76:234-241.

[15]Bramley E, Lean I J, Fulkerson W J, et al. The definition of acidosis in dairy herds predominantly fed on pasture and concentrates[J]. J Dairy Sci, 2008, 91:308-321.

[16]Lean I J, Rabiee A. Effect of feeding grain on ruminal acidosis in cattle: Acidosis indices. Pages 258-259 in Ruminant Physiology:Digestion, Metabolism, and Effects of Nutrition on Reproduction and Welfare[C].Wageningen Academic Publishers, Wageningen,the Netherlands, 2009.

[17]Irwin L N, Mitchell G E, Tucker R E, et al. Histamine, tyramine,tryptamine and electrolytes during glucose induced lactic acidosis[J]. J Anim Sci, 1979, 48:367-374.

[18]Bailey S R, Rycroft A, Elliott J. Production of amines in equine cecal contents in an in vitro model of carbohydrate overload[J]. J Anim Sci, 2002, 80:2656-2662.

[19]Wells J E, Krause D O, Callaway T R, et al. A bacteriocinmediated antagonism by ruminal lactobacilli against Streptococcus bovis[J]. FEMS Microbiol Ecol, 1997, 22:237-243.

[20]Sjaasted ? V. Determination and occurrence of histamine in rumen liquor of sheep[J]. Acta Vet Scand, 1967, 8:50-70.

[21]Krause K M, Oetzel G R. Understanding and preventing subacute ruminal acidosis in dairy herds: a review[J]. Anim Feed Sci Tech,2006, 126:215-236.

[22]Engelmann W, Zeyner A, Markuske K D, et al. LC analysis of histamine and other biogenic amines in digesta cultures[J].Chromatographia, 2009, 70:1207-1213.

[23]Hill K J, Mangan J L. The Formation and distribution of methylamine in the ruminant digestive tract[J]. Biochem J, 1964, 93:39-45.

[24]Sanford J. Formation of histamine in ruminal fluid[J]. Nature,1963, 119:829.

[25]Cohen S S. A Guide to the Polyamines[M]. Oxford University Press, New York, 1998.

[26]Garner M R, Gronquist M R, Russell J B. Nutritional requirements of Allisonella histaminiformans, a ruminal bacterium that decarboxylates histidine and produces histamine[J]. Curr Microbiol, 2004, 49:295-299.

[27]Connil N, Breton Y L, Dousset X, et al. Identification of the Enterococcus faecalis tyrosine decarboxylase operon involved in tyramine production[J]. Appl Environ Microbiol, 2002,68(7):3537-3544.

[28]Krizsan S J, Randby ? T. The effect of fermentation quality on the voluntary intake of grass silage by growing cattle fed silage as the sole feed[J]. J Anim Sci, 2007, 85:984-996.

[29]Linares D M, Fernandez M, del Rio B, et al. The tyrosyl-tRNA synthetase like gene located in the tyramine biosynthesis cluster of Enterococcus durans is transcriptionally regulated by tyrosine concentration and extracellular pH[J]. BMC Microbiol, 2012,12:23-47.

Effects of High Concentrate Diet on Rumen Fermentation and Biogenic Amines in the Rumen of Dairy Cows

WANG Dong-sheng1, ZHANG Lu-lu2
(1.Shanghai Bright Holstan Co., Ltd., Shanghai 200436; 2.Beijing Middle Example Laying Hens Breeding Co.,Ltd., Beijing 102100)

This study was conducted to investigate the effect of high concentrate diet feeding on rumen fermentation characteristics. Four cannulated primiparous (60 to 140d in milk period) Holstein dairy cows were assigned to 2 diets in a 2×2 crossover experimental design. Results showed that HighC feeding increased the averages of total volatile fatty acids, butyrate, valerate, total branched-chain VFA and decreased the acetate to propionate ratio in the rumen.HighC feeding did not signi fi cantly increased the daily average of acetate and NH3-N (P＜0.05), and has an increase trend for propionate (0.05＜P＜0.10). The average concentration of tyramine, putrescine, histamine, methylamine and tryptamine were higher in the rumen of HighC group compared with the LowC (P＜0.05). Correlation analysis showed that there was a signi fi cant negative relationship between ruminal pH and biogenic amines in the rumen fl uid (P＜0.05). In addition, the relative quantitation of Lactobacillus spp. were affected by the diet fed (P＜0.05).In conclusion, results suggest that HighC feeding caused translocation of biogenic amine from the digestive tract and increase of predominant ruminal biogenic amine-forming Lactobacillus spp. Further research is warranted to explore the role of amine and the concrete biogenic amine-forming microorganism in animal physiologic activities,especially in in fl ammation response during HighC feeding.

Concentrate-to-forage ratio; Dairy cow; Ruminal fl uid; Biogenic amine

S823.4

A

1004-4264（2017）10-0011-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.10.003

2017-02-13

王東升（1987-），男，山東濰坊人，碩士，主要從事奶牛研發(fā)項(xiàng)目管理工作。

張露露（1989-），女，漢，河北石家莊人，碩士，主要從事飼料檢測(cè)、畜禽疾病控制等研究工作。