HLA?DRB1等位基因與四川漢族人尋常型天皰瘡的相關(guān)性研究

夏登梅 閆薇 徐飛 王蓮 李薇

610041成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科（第一作者現(xiàn)在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，646000四川瀘州）

·研究報(bào)道·

HLA?DRB1等位基因與四川漢族人尋常型天皰瘡的相關(guān)性研究

夏登梅 閆薇 徐飛 王蓮 李薇

610041成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科（第一作者現(xiàn)在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，646000四川瀘州）

目的探討HLA?DRB1等位基因與四川漢族人尋常型天皰瘡的相關(guān)性。方法采用聚合酶連反應(yīng)-序列特異性引物（PCR?SSP）對(duì)19例四川漢族尋常型天皰瘡患者和25例健康對(duì)照組進(jìn)行低分辨和高分辨HLA?DRB1等位基因分型，計(jì)算各等位基因頻率。采用χ2檢驗(yàn)比較兩組等位基因頻率。結(jié)果在尋常型天皰瘡患者和健康對(duì)照者中共檢出9種低分辨DRB1等位基因和19種高分辨DRB1等位基因。與健康對(duì)照組相比，尋常型天皰瘡患者DRB1*14等位基因頻率（39.47%，15/38）及DRB1*1405等位基因頻率（15.79%，6/38）均顯著高于健康對(duì)照組［8.00%（4/50），2.00%（1/50）］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.43、4.25，均P＜0.05）。結(jié)論DRB1*14可能是四川漢族尋常型天皰瘡患者的常見易感基因，其中DRB1*1405與尋常型天皰瘡最具有相關(guān)性。

天皰瘡；HLA?DRB1鏈；等位基因

研究表明，尋常型天皰瘡（PV）具有遺傳易感性且存在地區(qū)差異。人類白細(xì)胞抗原（HLA）?DRB1基因是各地區(qū)報(bào)道最多的PV相關(guān)易感基因，我們采用高分辨聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR?SSP）法檢測(cè)四川漢族PV患者HLA?DRB1基因，探討其與PV的相關(guān)性。

一、對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2013年9月至2014年12月于四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科確診的19例四川漢族PV患者作為PV組。本院體檢中心25例健康志愿者作為健康對(duì)照組。PV組中男11例，女8例，年齡20～69歲；健康對(duì)照組中男13例，女12例，年齡21～72歲；兩組間性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.DNA提取和制備：兩組人員均采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝靜脈血3 ml，利 用QIAamp濾柱從靜脈血中提取基因組DNA，采用超微量分光光度計(jì)（美國(guó)GE公司）測(cè)定吸光度（A值）。要求樣本DNA純度（A260/280）為1.6～1.9，濃度為75～125 mg/L。提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.PCR?SSP法檢測(cè)HLA?DRB1易感基因：嚴(yán)格按照AB/DR/DQ SSP試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）說明操作。擴(kuò)增引物及條件見文獻(xiàn)［1］。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio?Rad公司）分析結(jié)果、照相，采用 Unimatch4.0.7 Bata Tools?Local軟件分析系統(tǒng)判斷結(jié)果。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：根據(jù)每個(gè)等位基因出現(xiàn)的次數(shù)計(jì)算該等位基因的陽(yáng)性數(shù)及等位基因頻率，等位基因頻率=等位基因數(shù)/等位基因總數(shù)（例數(shù)×2）。應(yīng)用SAS9.2軟件包處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法比較兩組HLA?DRB等位基因頻率，同時(shí)計(jì)算OR值及其95%可信區(qū)間（95%CI），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

納入的19例患者中黏膜主導(dǎo)型1例，皮膚黏膜型18例。

1.低分辨DRB1等位基因檢測(cè)：共檢出9種低分辨DRB1等位基因（表1）。PV患者中DRB1*14基因頻率（39.47%）明顯高于健康對(duì)照組（8.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.高分辨DRB1等位基因檢測(cè)：共檢出19種高分辨DRB1等位基因（表2）。PV患者DRB1*1405基因頻率（15.79%）明顯高于健康對(duì)照組（2.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、討論

已有研究顯示，DRB1*04中DRB1*0402基因頻率在白人PV中普遍較高［2］，國(guó)內(nèi)PV患者則主要與DRB1*0403、DRB1*0406有關(guān)［3］。本文四川PV患者中均未見DRB1*0402和DRB1*0403等位基因，支持易感基因存在人種和地區(qū)差異性，DRB1*0406頻率較健康對(duì)照組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。本研究PV患者存在DRB1*1401、DRB1*1404、DRB1*1405、DRB1*1407、DRB1*1408、DRB1*1418和DRB1*1454等位基因，其中DRB1*1405基因頻率顯著高于健康對(duì)照組，這與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)及日本人群中的報(bào)道一致［4?5］。本研究中1例患者同時(shí)攜帶DRB1*0406和DRB1*1418，另1例攜帶DRB1*1202和DRB1*1418，國(guó)內(nèi)有報(bào)道DRB1*1202為保護(hù)性基因［3］，故DRB1*1418是否是該患者發(fā)生PV的易感基因有待進(jìn)一步證實(shí)。DRB1*1454已被認(rèn)為是斯洛伐克人患PV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［6］，本研究中有2例患者攜帶DRB1*1454，其中1例同時(shí)攜帶DRB1*0406，另1例攜帶DRB1*0701，但與健康對(duì)照組DRB1*1454攜帶率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需進(jìn)一步對(duì)DRB1*1418、DRB1*1454進(jìn)行氨基酸序列分析，以明確其是否與該地區(qū)PV發(fā)病有關(guān)。

表1 尋常型天皰瘡（PV）組與健康對(duì)照組HLA-DRB1低分辨等位基因頻率比較

表2 尋常型天皰瘡（PV）組與健康對(duì)照組HLA-DRB1高分辨等位基因頻率比較

家族性PV患者并不多見，對(duì)其易感基因的研究較少。日本有學(xué)者報(bào)道一家系兩姐妹共同的易感基因?yàn)镈RB1*1405［7］。本研究中兩例為姐妹，其姐先發(fā)病，首發(fā)口腔，逐漸累及皮膚，口腔損害較皮膚嚴(yán)重；3年后胞妹胸背部出現(xiàn)皮損，后累及口腔，口腔及皮膚損害均較嚴(yán)重，姐妹DRB1基因分別為DRB1*1408+DRB1*1501、DRB1*1405+DRB1*1501?？梢奃RB1*1501可能是其共同的致病基因，與報(bào)道的DRB1*15是保護(hù)基因不一致［8］。DRB1*1405和DRB1*1408是其各自特有的易感基因，是否與臨床表現(xiàn)出現(xiàn)的順序、嚴(yán)重程度及家族性PV有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。PV患者可存在皮膚黏膜同時(shí)受累，或者僅僅只有黏膜受累。本研究19例患者中18例為皮膚與黏膜同時(shí)受累，只有1例患者為黏膜主導(dǎo)型。該黏膜主導(dǎo)型患者的易感基因?yàn)镈RB1*1408，另18例患者中7例攜帶DRB1*0406，6例DRB1*1405，4例DRB1*1404，5例DRB1*1202。易感基因與PV臨床表現(xiàn)間的具體關(guān)系需進(jìn)一步研究明確。

HLA?DRB1基因具有復(fù)雜的多態(tài)性，且有地區(qū)、種族差異性。本文通過PCR?SSP法對(duì)四川漢族PV患者中HLA?DRB1基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DRB1*1405基因頻率顯著高于健康對(duì)照組，但未見DRB1*0402和DRB1*0403基因。本文中涉及的兩例家族性PV患者，DRB1*1501可能是其共同的致病基因。但是本研究樣本量較小，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步序列分析，以期對(duì)該地區(qū)漢族人的易感基因提供更可靠論據(jù)。

［1］吳桂菊,張勇,朱海琴,等.HLA?DRB1和HLA?DQB1基因多態(tài)性與天皰瘡的相關(guān)性［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2011,31（7）:948?951.

［2］Lombardi ML,Mercuro O,Ruocco V,et al.Common human leukocyte antigen alleles in pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus Italian patients［J］.J Invest Dermatol,1999,113（1）:107?110.DOI:10.1046/j.1523?1747.1999.00626.x.

［3］周淑華,林麟,靳培英,等.HLA?DR基因與漢族尋常型天皰瘡易感性及臨床表型相關(guān)性的研究［J］.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2004,18（8）:451 ?452,469.DOI:10.3969/j.issn.1001 ?7089.2004.08.002.

［4］Miyagawa S,Higashimine I,Iida T,et al.HLA?DRB1*04 and DRB1*14 alleles are associated with susceptibility to pemphigus among Japanese［J］.J Invest Dermatol,1997,109（5）:615 ?618.DOI:10.1111/1523?1747.ep12337585.

［5］Párnická Z, ?vecová D,Javor J,et al.High susceptibility to pemphigus vulgaris due to HLA?DRB1*14:54 in the Slovak population［J］.Int J Immunogenet,2013,40（6）:471?475.DOI:10.1111/iji.12052.

［6］Yamamoto T,Ikeda K,Sasaoka S,et al.Human leukocyte antigen genotypes and antibody profiles associated with familial pemphigus in Japanese［J］.J Dermatol,2011,38（7）:711?716.DOI:10.1111/j.1346?8138.2010.01057.x.

［7］Zivanovic D,Bojic S,Medenica L,et al.Human leukocyte antigen class II（DRB1 and DQB1）alleles and haplotypes frequencies in patients with pemphigus vulgaris among the Serbian population［J］.HLA,2016,87（5）:367?374.DOI:10.1111/tan.12796.

［8］耿龍,翟寧,張慶瑞,等.中國(guó)北方漢族尋常型天皰瘡與HLA?DRB1等位基因的相關(guān)性研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2000,17（4）:303?304.

Association analysis between HLA?DRB1 alleles and pemphigus vulgaris in a Han population in Sichuan

Xia Dengmei,Yan Wei,Xu Fei,Wang Lian,Li Wei
Department of Dermatology and Venereology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China（The current affiliation of the first author was Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,China）

Li Wei,Email:liwei@mcwcums.com

ObjectiveTo investigate the association between HLA?DRB1 alleles and pemphigus vulgaris（PV）in a Han population in Sichuan.MethodsPolymerase chain reaction with sequence?specific primer（PCR?SSP）method was used for low?resolution and high?resolution typing of HLA?DRB1 alleles in 19 patients of Han nationality with PV and 25 healthy controls in Sichuan.Allele frequencies were calculated,and differences in the allele frequency between the above two groups were compared by using chi?square test.ResultsTotally,9 kinds of DRB1 low?resolution alleles and 19 kinds of DRB1 high?resolution alleles were identified in the PV patients and healthy controls.Frequencies of the DRB1*14 allele（39.47%［15/38］vs.8.00%［4/50］,χ2=17.43,P＜ 0.05）and DRB1*1405 allele（15.79%［6/38］vs.2.00%［1/50］,χ2=4.25,P＜ 0.05）were significantly higher in the PV patients than in the healthy controls.ConclusionThe HLA?DRB1*14 allele may be a common susceptibility gene for PV in the Han population in Sichuan,and the HLA?DRB1*1405 allele may be most closely associated with PV.

Pemphigus;HLA?DRB1 Chains;Allele

李薇，Email：liwei@mcwcums.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.010

四川省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題（140051）

Fund program:Scientific Research Project of Health and Family Planning Commission of Sichuan Province（140051）

2016?08?05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）