• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞自噬相關(guān)基因差異表達(dá)分析

    2017-11-01 21:57:40龔晴麗李雪丁高中凌雨婷趙文娥熊喜喜魯嚴(yán)
    中華皮膚科雜志 2017年8期
    關(guān)鍵詞:差異

    龔晴麗 李雪 丁高中 凌雨婷 趙文娥 熊喜喜 魯嚴(yán)

    210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(龔晴麗、李雪、丁高中、凌雨婷、熊喜喜、魯嚴(yán));南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心(趙文娥)

    ·論著·

    氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞自噬相關(guān)基因差異表達(dá)分析

    龔晴麗 李雪 丁高中 凌雨婷 趙文娥 熊喜喜 魯嚴(yán)

    210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(龔晴麗、李雪、丁高中、凌雨婷、熊喜喜、魯嚴(yán));南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心(趙文娥)

    目的探討過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)黑素細(xì)胞自噬的影響及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期健康人黑素細(xì)胞,分為空白對(duì)照組(不予任何處理)、陽(yáng)性對(duì)照組(100 nmol/L西羅莫司處理)和實(shí)驗(yàn)組(體積分?jǐn)?shù)為10?7~10?3的H2O2處理),處理4 h后,使用CCK8法、流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組黑素細(xì)胞活性及凋亡率。吖啶橙染色檢測(cè)自噬小泡,透射電鏡下觀察自噬小體,Western印跡檢測(cè)自噬特異性蛋白Beclin 1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)。最后采用包含84個(gè)自噬相關(guān)基因的RT2Profiler PCR Array篩選自噬相關(guān)的差異表達(dá)基因。結(jié)果黑素細(xì)胞分別經(jīng)10?3、5 × 10?4、10?4、5 × 10?5、10?5、5 ×10?6、10?6H2O2處理后,細(xì)胞增殖活性及凋亡率與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為286.95、301.23,均P<0.05),且隨H2O2體積分?jǐn)?shù)升高,增殖活性降低,凋亡率升高。除5 × 10?6H2O2組分別與10?5、10?6H2O2組間相比細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,上述各H2O2組間兩兩比較,黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吖啶橙染色及電鏡觀察發(fā)現(xiàn),10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司處理的黑素細(xì)胞中有自噬小體形成。Western印跡顯示,10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司組黑素細(xì)胞Beclin 1表達(dá)量和LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率均較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。RT2 Profiler PCR Array結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,10?5H2O2組、10?6H2O2組和西羅莫司組中ATG12、ATG3、ULK1、PIK3CG、PTEN、PIK3C3表達(dá)均顯著上調(diào),EIF2AK3表達(dá)顯著下調(diào);10?5H2O2組和西羅莫司組mTOR表達(dá)顯著下調(diào),ULK2表達(dá)顯著上調(diào);10?6H2O2組mTOR表達(dá)未發(fā)生明顯改變,AMPK、JNK1表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)論體積分?jǐn)?shù)為10?5和10?6的H2O2均能有效誘導(dǎo)黑素細(xì)胞自噬,可能與影響相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)相關(guān)。

    黑素細(xì)胞;自噬;過(guò)氧化氫;氧化性應(yīng)激;寡核苷酸序列分析;細(xì)胞凋亡

    Namazi等[1]提出“黑素細(xì)胞經(jīng)表皮丟失”即:氧化應(yīng)激下線粒體結(jié)構(gòu)功能障礙與自噬能力降低是導(dǎo)致黑素細(xì)胞粘附功能降低及經(jīng)表皮丟失的重要原因[2?4]。適量的自噬被認(rèn)為是重要的細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)[5]。如何調(diào)整氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞的自噬水平從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用,需要明確這一過(guò)程中黑素細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。我們應(yīng)用不同體積分?jǐn)?shù)的過(guò)氧化氫(H2O2)模擬氧化應(yīng)激環(huán)境,誘導(dǎo)黑素細(xì)胞發(fā)生自噬,采用PCR陣列技術(shù)(PCR array)篩選相關(guān)差異表達(dá)基因,探討氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞自噬特有的調(diào)節(jié)方式。

    材料與方法

    一、主要試劑及儀器

    Ham F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司),G418、左旋多巴(L?DOPA)、西羅莫司(美國(guó)Sigma公司),山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),H2O2溶液(南京化學(xué)試劑有限公司),CCK8試劑盒(日本Dojindo公司),膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V?FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司),吖啶橙(美國(guó)Amresco生化試劑公司),鼠抗人Beclin 1抗體、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)抗體、鼠抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(美國(guó) Sigma公司),RT2Profiler PCR Array(德國(guó)Qiagen公司),128C型酶標(biāo)儀(奧地利CliniBio公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter有限公司)。

    二、黑素細(xì)胞培養(yǎng)及處理

    標(biāo)本來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚組織(已征得患者知情同意)。根據(jù)Swope等[6]的方法獲得單細(xì)胞懸液,接種于含常規(guī)黑素細(xì)胞培養(yǎng)基[7]的培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。24 h后換液去除未貼壁細(xì)胞,并加入G418,48 h后改用不含G418的培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),用2.5 g/L胰酶消化傳代。L-多巴染色鑒定黑素細(xì)胞。

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分為空白對(duì)照組(不予任何處理)、陽(yáng)性對(duì)照組(100 nmol/L西羅莫司[8]處理)和實(shí)驗(yàn)組[不同體積分?jǐn)?shù)(10?3,5 × 10?4,10?4,5 × 10?5,10?5,5 × 10?6,10?6,5 × 10?7,10?7)H2O2處理],處理 4 h后,檢測(cè)黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡率,并篩選出體積分?jǐn)?shù)為10?4、10?5和10?6的H2O2進(jìn)行吖啶橙染色、電鏡觀察及Western印跡實(shí)驗(yàn)。最后,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定用體積分?jǐn)?shù)為 10?5和10?6的 H2O2誘導(dǎo)后進(jìn)行PCR array實(shí)驗(yàn),檢測(cè)自噬相關(guān)差異表達(dá)基因。

    三、CCK8檢測(cè)H2O2處理后黑素細(xì)胞的增殖活性

    向已處理好的96孔板中每孔加入100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK8溶液,孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A450值)。每組設(shè)4個(gè)平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

    四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)黑素細(xì)胞凋亡率

    黑素細(xì)胞經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)H2O2處理后,胰酶消化,收集各組細(xì)胞,每組加入500 μl結(jié)合緩沖液、5 μl Annexin?FITC和5 μl PI混勻,室溫避光反應(yīng)5 ~15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率,將Annexin?FITC單標(biāo)+Annexin?FITC和PI雙標(biāo)細(xì)胞視為凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    五、吖啶橙染色檢測(cè)自噬小泡

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于小培養(yǎng)皿中,細(xì)胞處理同前,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,用4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞10 min,再加入0.01%吖啶橙溶液,室溫避光孵育10~20 min后,PBS清洗3次,倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。

    六、透射電鏡下觀察自噬小體

    細(xì)胞處理同上,作用4 h后收集各組黑素細(xì)胞,加入4℃預(yù)冷的3%戊二醛,固定2 h以上,PBS洗滌3次,再加1%鋨酸固定2 h,PBS洗滌3次,經(jīng)脫水后包埋、切片(厚度為80 nm),3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,置于透射電鏡下觀察自噬小體并攝片。

    七、Western印跡檢測(cè)LC3B、Beclin 1蛋白表達(dá)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿,細(xì)胞經(jīng)上述處理后,提取各組細(xì)胞總蛋白,經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS?PAGE)電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h,與Beclin 1、LC3B特異性抗體及相應(yīng)二抗作用后,經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯色。用Image J軟件分析圖片,計(jì)算LC3B、Beclin 1與GAPDH的灰度比值。

    八、PCR array檢測(cè)自噬相關(guān)基因的差異表達(dá)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑素細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,細(xì)胞經(jīng)上述處理4 h后,按照試劑盒說(shuō)明操作提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。實(shí)時(shí)PCR采用RT2Profiler PCR Array檢測(cè)自噬相關(guān)的84個(gè)基因,包含5種管家基因即次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、β2微球蛋白、大核糖體蛋白、GAPDH和β肌動(dòng)蛋白。計(jì)算循環(huán)數(shù)閾值(Ct),ΔCt=目的基因Ct-平均管家基因 Ct,ΔΔCt= 實(shí)驗(yàn)組 ΔCt- 對(duì)照組 ΔCt,2?ΔΔCt值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組相應(yīng)基因表達(dá)的倍數(shù)。

    九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示,各組間差異比較采用單因素方差分析法,各處理組與空白對(duì)照組比較采用LSD法,各處理組間兩兩比較采用SNK法,劑量效應(yīng)采用Pearson相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。登陸網(wǎng)站http://www.sabiosciences.com/dataanalysis.php在線分析PCR Array檢測(cè)結(jié)果,差異表達(dá)基因定義為2?ΔΔCt≥ 2的基因。

    結(jié) 果

    一、H2O2可降低黑素細(xì)胞的增殖活性

    如表1所示,黑素細(xì)胞經(jīng)10-7~10-3H2O2處理后,細(xì)胞增殖活性與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨H2O2體積分?jǐn)?shù)升高而明顯下降(r=-0.979,P<0.001)。100 nmol/L西羅莫司組黑素細(xì)胞增殖活性與空白對(duì)照組、5×10?7H2O2組和10?7H2O2組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05),與其他各H2O2組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除5 × 10?7H2O2與10?7H2O2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.518)外,其他各H2O2組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    二、H2O2對(duì)黑素細(xì)胞凋亡的影響

    分別經(jīng)西羅莫司和H2O2處理4 h后,黑素細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨H2O2體積分?jǐn)?shù)升高而升高(r=0.950,P<0.001)。西羅莫司組與除5 × 10?7H2O2組外的其他各H2O2組相比,黑素細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除5 × 10?7與10?7H2O2組間、5 × 10?6與10?5或10?6H2O2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)外,其余各H2O2組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    三、吖啶橙染色檢測(cè)結(jié)果

    10?4H2O2組吖啶橙染色未見(jiàn)紅色點(diǎn)狀熒光,西羅莫司、10?5H2O2、10?6H2O23組黑素細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

    四、透射電鏡下觀察自噬小體

    空白對(duì)照組黑素細(xì)胞內(nèi)自噬小泡少見(jiàn),細(xì)胞膜及核膜結(jié)構(gòu)完整,線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。10?4H2O2處理組黑素細(xì)胞中線粒體腫脹,嵴排列紊亂,伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,未見(jiàn)到自噬小泡。在西羅莫司、10?5H2O2、10?6H2O23個(gè)處理組中發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞內(nèi)自噬小泡明顯增多,并觀察到線粒體自噬,且線粒體損傷較10?4H2O2組輕,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整。見(jiàn)圖2。

    表1 不同體積分?jǐn)?shù)H2O2對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響(±s)

    表1 不同體積分?jǐn)?shù)H2O2對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響(±s)

    注:n=3。a:與空白對(duì)照組比較,P<0.05;b:與西羅莫司組比較,P<0.05

    組別空白對(duì)照組西羅莫司組H2O2組10?3 5 × 10?4 10?4 5 × 10?5 10?5 5 × 10?6 10?6 5 × 10?7 10?7 F值P值增殖活性(A450)0.958±0.041 0.927±0.041凋亡率(%)10.08±1.13b 15.20±1.05a 0.247±0.008ab 0.307±0.026ab 0.388±0.036ab 0.509±0.039ab 0.669±0.032ab 0.748±0.039ab 0.798±0.021ab 0.895±0.014a 0.909±0.022a 286.95<0.05 61.74±1.63ab 53.72±2.30ab 43.76±3.32ab 34.51±3.43ab 22.03±1.47ab 20.85±1.20ab 18.04±3.05ab 12.71±0.58 12.01±1.02b 301.23<0.05

    圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察自噬小泡(吖啶橙染色×200) 1A:空白對(duì)照組胞質(zhì)中見(jiàn)少量紅色熒光;1B:10?4H2O2組細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)均呈黃綠色熒光,未見(jiàn)紅色熒光;1C~1E:分別為10?5H2O2組、10?6H2O2組、西羅莫司組,3組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)斑點(diǎn)狀紅色熒光,熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì)照組 圖2 透射電鏡下觀察自噬小體(黃色箭頭) 2A:空白對(duì)照組(×30 000)自噬小泡少見(jiàn),細(xì)胞膜及核膜結(jié)構(gòu)完整,線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常;2B:10?4H2O2組(×30 000),線粒體腫脹、嵴排列紊亂,伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,未見(jiàn)到自噬小泡;2C ~2E:分別為10?5H2O2組(× 30 000)、10?6H2O2組(× 20 000)、西羅莫司組(× 30 000),黑素細(xì)胞內(nèi)自噬小泡明顯增多,可見(jiàn)線粒體自噬,且線粒體損傷較10?4H2O2處理組輕,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整

    五、Beclin 1與LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率比較

    黑素細(xì)胞經(jīng)西羅莫司、10?5H2O2和10?6H2O2作用后,Beclin 1/GAPDH灰度比值分別為2.953±0.480、2.048±0.212和2.550±0.281,均顯著高于空白對(duì)照組(0.952 ± 0.110,均P<0.05),而 10?4H2O2組(0.521±0.062)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05);LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率分別為6.088± 0.064、5.287 ±0.314和6.032±0.082,均顯著高于空白對(duì)照組(2.151 ± 0.106,均P<0.05),而10?4H2O2組(2.396 ±0.144)與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.105),且西羅莫司組和 10?6H2O2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.697)。見(jiàn)圖3。

    六、差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因

    見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組相比,各處理組的自噬相關(guān)基因12(ATG12)、自噬相關(guān)基因3(ATG3)、失調(diào)51樣激酶1(ULK1)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位γ(PIK3CG)、磷脂酰肌醇-3-激酶class 3(PIK3C3)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因(PTEN)表達(dá)均顯著上調(diào),真核生物翻譯起始因子-2α-激酶-3基因(EIF2AK3)表達(dá)顯著下調(diào);10?5H2O2組和西羅莫司組哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白(mTOR)基因顯著下調(diào),失調(diào)51樣激酶2(ULK2)顯著上調(diào);10?6H2O2組mTOR未發(fā)生明顯改變,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、c?Jun氨基末端激酶1(JNK1)顯著上調(diào)。

    圖3 Western印跡檢測(cè)各處理組Beclin 1與LC3B表達(dá) 1:空白對(duì)照組;2:10?4H2O2組;3:10?5H2O2組;4:10?6H2O2組;5:西羅莫司組。LC3B:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B;GAPDH:3?磷酸甘油醛脫氫酶

    表2 H2O2作用后黑素細(xì)胞與空白對(duì)照組相比差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因(2?ΔΔCt)a

    討 論

    自噬與凋亡之間存在復(fù)雜的相互作用。在某些特定情況下,自噬能夠抵抗或延緩凋亡,利于細(xì)胞存活;但有些情況下又可與凋亡協(xié)作導(dǎo)致細(xì)胞死亡或在凋亡缺陷時(shí)作為后備機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]。H2O2濃度、作用時(shí)間及作用的細(xì)胞類(lèi)型不同,細(xì)胞可能發(fā)生自噬、自噬性死亡、凋亡或壞死等[10]。為了誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞發(fā)生自噬,我們首先檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)H2O2對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組黑素細(xì)胞相比,10?4~ 10?3H2O2處理的黑素細(xì)胞增殖活性明顯降低,且凋亡率顯著升高;而10?7、5 × 10?7H2O2組黑素細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且5 × 10?6與 10?5H2O2組間及5 × 10?6與 10?6H2O2組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,僅 10?4、10?5、10?6H2O23組黑素細(xì)胞增殖活性及凋亡率與空白對(duì)照組相比及組間比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以,在后續(xù)自噬實(shí)驗(yàn)中選擇了這3個(gè)濃度。而根據(jù)吖啶橙染色、透射電鏡及Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在10?5及10?6H2O2這兩組觀察到黑素細(xì)胞發(fā)生自噬,故選擇這兩個(gè)濃度進(jìn)行PCR array實(shí)驗(yàn)。

    自噬分子機(jī)制復(fù)雜,涉及30多個(gè)ATG基因、50個(gè)溶酶體水解酶及多條信號(hào)途徑[11]。目前已證實(shí)ULK1/2?ATG13?ATG17復(fù)合物的形成可啟動(dòng)自噬,并受mTOR調(diào)控[12]。當(dāng)mTOR被抑制時(shí),ATG13去磷酸化并和ULK1/2?ATG17復(fù)合物結(jié)合,激活ULK1/2,引發(fā)自噬[13]。已知mTOR的上游受多條信號(hào)通路的調(diào)控,磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是經(jīng)典的調(diào)節(jié)自噬的mTOR上游信號(hào)途徑[14]。PTEN是一腫瘤抑制因子,對(duì)PI3K/AKT途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[15],從而抑制mTOR激活,促進(jìn)自噬發(fā)生。

    本研究顯示,與空白對(duì)照組相比,10?5H2O2組和西羅莫司組PIK3CG、PTEN、ULK1、ULK2均顯著上調(diào)2倍以上,10?5H2O2組和西羅莫司組mTOR顯著下調(diào),而10?6H2O2組mTOR無(wú)明顯改變。由此,我們推測(cè)10?5H2O2和西羅莫司可能主要通過(guò)PTEN負(fù)調(diào)節(jié)PIK3/AKT/mTOR依賴性途徑來(lái)促進(jìn)自噬。而Ueno等[16]證明,在PTEN缺陷自噬受抑制的肝細(xì)胞中,西羅莫司并不能通過(guò)抑制mTOR來(lái)激發(fā)自噬,推測(cè)PTEN可通過(guò)mTOR非依賴性途徑調(diào)節(jié)自噬,10?6H2O2可能通過(guò)以上途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞發(fā)生自噬。

    Egan等[17]在線粒體自噬中觀察到,氧化應(yīng)激作用下線粒體去極化能夠迅速減少細(xì)胞內(nèi)ATP水平,激活A(yù)MPK,使其磷酸化,從而直接促進(jìn)ULK1磷酸化,激活自噬。此外,在饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和心肌細(xì)胞自噬中觀察到,AMPK還可通過(guò)磷酸化JNK1,使凋亡相關(guān)蛋白BCL2發(fā)生多位點(diǎn)磷酸化,從而抑制BCL2?Beclin 1結(jié)合,Beclin 1得以解離,使得PIK3C3?BECN1多重復(fù)合物活性增加,從而促進(jìn)自噬發(fā)生[18?20]。本研究顯示,與空白對(duì)照組相比,10?6H2O2組AMPK、JNK1顯著上調(diào),BCL2與BECN1的上調(diào)倍數(shù)大于其他兩組;各組PIK3C3均顯著上調(diào)。由此推斷,10?6H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞自噬可能通過(guò)上述途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外,10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司可能均直接刺激PIK3C3活性增加,促進(jìn)自噬。

    值得注意的是,EIF2AK3在10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司組中均出現(xiàn)顯著下調(diào),且下調(diào)倍數(shù)>15。EIF2AK3參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類(lèi)似激酶?真核細(xì)胞翻譯啟始子2α(PERK?eIF2α)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[21],近年研究發(fā)現(xiàn),ERS途徑也是自噬的重要調(diào)控通路[22]。在ERS狀態(tài)下,EIF2AK3通過(guò)自身胞質(zhì)側(cè)羧基端的蛋白激酶催化促進(jìn)自身磷酸化,繼而使eIF2α蛋白51位絲氨酸磷酸化,導(dǎo)致蛋白合成受抑,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷。EIF2AK3下調(diào)和EIF2AK3磷酸化水平增高是同時(shí)進(jìn)行的,這也合理解釋了10?5H2O2、10?6H2O2組 EIF2AK3 基因較空白對(duì)照組顯著下調(diào)的結(jié)果。由此推測(cè),ERS可能參與調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞自噬,通過(guò)EIF2AK3自身磷酸化來(lái)磷酸化eIF2α,進(jìn)而上調(diào)ATG12并促進(jìn)自噬。

    綜上所述,10?5H2O2和10?6H2O2模擬的氧化應(yīng)激條件均可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞發(fā)生自噬,且不同濃度H2O2的誘導(dǎo)機(jī)制可能不僅涉及共同的調(diào)節(jié)通路,還涉及不同的調(diào)節(jié)方式。

    [1]Namazi MR.Neurogenic dysregulation,oxidative stress,autoim?munity, and melanocytorrhagy in vitiligo: can they be interconnected?[J].Pigment Cell Res,2007,20(5):360 ?363.DOI:10.1111/j.1600?0749.2007.00408.x.

    [2]Prignano F,Pescitelli L,Becatti M,et al.Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesional vitiligo skin[J].J Dermatol Sci,2009,54(3):157 ?167.DOI:10.1016/j.jdermsci.2009.02.004.

    [3]李雪,周梅華,吳迪,等.白癜風(fēng)皮損邊緣黑素細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察[J].中華皮膚科雜志,2013,46(9):636?639.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2013.09.008.

    [4]Schallreuter KU,Gibbons NC,Zothner C,et al.Hydrogen peroxide?mediated oxidative stress disrupts calcium binding on calmodulin:more evidence for oxidative stress in vitiligo[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360(1):70?75.DOI:10.1016/j.bbrc.2007.05.218.

    [5]Lemasters JJ.Selective mitochondrial autophagy,or mitophagy,as a targeted defense againstoxidative stress,mitochondrial dysfunction,and aging[J].Rejuvenation Res,2005,8(1):3 ?5.DOI:10.1089/rej.2005.8.3.

    [6]Swope VB,Medrano EE,Smalara D,et al.Long?term proliferation of human melanocytes is supported by the physiologic mitogens alpha?melanotropin,endothelin?1,and basic fibroblast growth factor[J].Exp Cell Res,1995,217(2):453?459.DOI:10.1006/excr.1995.1109.

    [7]Hu DN,McCormick SA,Seedor JA,et al.Isolation,purification and cultivation of conjunctival melanocytes[J].Exp Eye Res,2007,84(4):655?662.DOI:10.1016/j.exer.2006.12.003.

    [8]Li X,Wu D,Shen J,et al.Rapamycin induces autophagy in the melanoma cell line M14 via regulation of the expression levels of Bcl?2 and Bax[J].Oncol Lett,2013,5(1):167 ?172.DOI:10.3892/ol.2012.986.

    [9]Eisenberg?Lerner A,Bialik S,Simon HU,et al.Life and death partners:apoptosis,autophagy and the cross?talk between them[J].Cell Death Differ,2009,16(7):966 ?975.DOI:10.1038/cdd.2009.33.

    [10]Whittemore ER,Loo DT,Watt JA,et al.A detailed analysis of hydrogen peroxide?induced cell death in primary neuronal culture[J].Neuroscience,1995,67(4):921?932.

    [11]Chen Y,Klionsky DJ.The regulation of autophagy?unanswered questions[J].J Cell Sci,2011,124(Pt 2):161?170.DOI:10.1242/jcs.064576.

    [12]Kabeya Y,Kamada Y,Baba M,et al.Atg17 functions in cooperation with Atg1 and Atg13 in yeast autophagy[J].Mol Biol Cell,2005,16(5):2544?2553.DOI:10.1091/mbc.E04?08?0669.

    [13]Jung CH,Jun CB,Ro SH,et al.ULK?Atg13?FIP200 complexes mediate mTOR signaling to the autophagy machinery[J].Mol Biol Cell,2009,20(7):1992?2003.DOI:10.1091/mbc.E08?12?1249.

    [14]Batty IH,Hickinson DM,Downes CP.Cross?talk between phospholipase C and phosphoinositide 3?kinase signalling pathways[J].Biochem Soc Trans,1997,25(4):1132?1137.DOI:10.1042/bst0251132.

    [15]Maehama T,Dixon JE.The tumor suppressor,PTEN/MMAC1,dephosphorylates the lipid second messenger,phosphatidylino?sitol 3,4,5?trisphosphate[J].J Biol Chem,1998,273(22):13375?13378.

    [16]Ueno T,Sato W,Horie Y,et al.Loss of Pten,a tumor suppressor,causes the strong inhibition of autophagy without affecting LC3 lipidation[J].Autophagy,2008,4(5):692?700.

    [17]Egan DF,Shackelford DB,Mihaylova MM,et al.Phosphorylation of ULK1(hATG1)by AMP?activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy[J].Science,2011,331(6016):456?461.DOI:10.1126/science.1196371.

    [18]Itakura E,Kishi C,Inoue K,et al.Beclin 1 forms two distinct phosphatidylinositol 3?kinase complexes with mammalian Atg14 and UVRAG[J].Mol Biol Cell,2008,19(12):5360?5372.DOI:10.1091/mbc.E08?01?0080.

    [19]Wei Y,Pattingre S,Sinha S,et al.JNK1?mediated phosphorylation of Bcl?2 regulates starvation ?induced autophagy[J].Mol Cell,2008,30(6):678?688.DOI:10.1016/j.molcel.2008.06.001.

    [20]He C,Zhu H,Li H,et al.Dissociation of Bcl?2?Beclin1 complex by activated AMPK enhances cardiac autophagy and protects against cardiomyocyte apoptosis in diabetes[J].Diabetes,2013,62(4):1270?1281.DOI:10.2337/db12?0533.

    [21]Verfaillie T,Salazar M,Velasco G,et al.Linking ER stress to autophagy:potential implications for cancer therapy[J/OL].Int J Cell Biol,2010[2015?04?05].http://www.ncbi.nlm.nih.gov,SSL+IJCB2010?930509.pdf.DOI:10.1155/2010/930509.

    [22]Yorimitsu T,Klionsky DJ.Endoplasmic reticulum stress:a new pathway to induce autophagy[J].Autophagy,2007,3(2):160 ?162.

    Differential expression of autophagy?related genes in melanocytes under oxidative stress

    Gong Qingli,Li Xue,Ding Gaozhong,Ling Yuting,Zhao Wen′e,Xiong Xixi,Lu Yan
    Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China(Gong QL,Li X,Ding GZ,Ling YT,Xiong XX,Lu Y);Department of Analysis and Testing Center,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China(Zhao WE)

    Lu Yan,Email:luyan6289@163.com

    ObjectiveTo evaluate the effect of hydrogen peroxide(H2O2) on autophagy in melanocytes,and to explore its possible regulatory mechanisms.MethodsNormal human melanocytes at exponential growth phase were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,positive control group treated with 100 nmol/L sirolimus solution,and experiment groups treated with H2O2solution at different volume fractions of 10?7-10?3respectively.After 4?hour treatment,cell counting kit?8(CCK?8)assay and flow cytometry were performed to evaluate the cellular proliferative activity and detect apoptosis of melanocytes respectively.Acridine orange staining was performed to detect autophagosome formation,transmission electron microscopy to observe ultrastructural changes of autophagosomes,and Western blot analysis to measure the expression of autophagy?specific protein Beclin 1 and microtubule?associated protein 1 light chain 3B(LC3B).A total of 84 autophagy?related genes were analyzed by RT2Profiler PCR Array,so as to screen differentially expressed autophagy?related genes.ResultsAfter the treatment with H2O2at different volume fractions of 10?3,5 × 10?4,10?4,5 × 10?5,10?5,5 × 10?6and 10?6,experiment groups showed significantly decreased cellular proliferative activity,but significantly increased apoptosis rate compared with the blank control group(F=286.95,301.23,respectively,bothP< 0.05).With the increase in volume fractions of H2O2,the cellular proliferative activity was significantly gradually decreased(P< 0.05),while the apoptosis rate showed an opposite trend(P< 0.05),except that the 5 ×10?6H2O2group showed no significant differences in the apoptosis rate compared with the 10?5H2O2group and 10?6H2O2group.Acridine orange staining and electron microscopy showed autophagosome formation in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group.Western blot analysis revealed that Beclin1 expression and LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ ratio were significantly higher in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group than in the blank control group(allP< 0.05).RT2Profiler PCR Array showed significant up?regulation of ATG12,ATG3,ULK1,PIK3CG,PTEN and PIK3C3 genes and significant down?regulation of EIF2AK3 gene in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group compared with the blank control group.In the 10?5H2O2group and positive control group,the mTOR gene was significantly up?regulated,and the ULK2 gene was significantly down?regulated.The 10?6H2O2group showed no obvious changes in the expression of mTOR gene,but significant up?regulation of AMPK and JNK1 genes.ConclusionH2O2at volume fractions of 10?5and 10?6can induce autophagy in melanocytes,likely by influencing the expression of some related signaling molecules.

    Melanocytes;Autophagy;Hydrogen peroxide;Oxidative stress;Oligonucleotide array sequence analysis;Apoptosis

    魯嚴(yán),Email:luyan6289@163.com

    10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.001

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81171517);江蘇省“333工程”培養(yǎng)資金(BRA2013279)

    Fund programs:National Natural Science Foundation of China(81171517);The“333”P(pán)roject of Jiangsu Province(BRA2013279)

    2016?07?12)

    (本文編輯:尚淑賢)

    猜你喜歡
    差異
    “再見(jiàn)”和bye-bye等表達(dá)的意義差異
    JT/T 782的2020版與2010版的差異分析
    相似與差異
    關(guān)于中西方繪畫(huà)差異及對(duì)未來(lái)發(fā)展的思考
    收藏界(2019年3期)2019-10-10 03:16:40
    找句子差異
    DL/T 868—2014與NB/T 47014—2011主要差異比較與分析
    生物為什么會(huì)有差異?
    法觀念差異下的境外NGO立法效應(yīng)
    構(gòu)式“A+NP1+NP2”與“A+NP1+(都)是+NP2”的關(guān)聯(lián)和差異
    論言語(yǔ)行為的得體性與禮貌的差異
    日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久九九热精品免费| 成熟少妇高潮喷水视频| 无限看片的www在线观看| 国产爱豆传媒在线观看 | 久久天堂一区二区三区四区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产亚洲欧美精品永久| 韩国av一区二区三区四区| 妹子高潮喷水视频| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩高清综合在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲最大成人中文| 一区福利在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 黄色片一级片一级黄色片| 黄片播放在线免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 丰满的人妻完整版| 欧美黑人巨大hd| 人妻久久中文字幕网| 黑人操中国人逼视频| 国产99白浆流出| 18禁国产床啪视频网站| 午夜精品在线福利| 精品第一国产精品| 国产一区二区三区视频了| 香蕉av资源在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 夜夜夜夜夜久久久久| 一区二区三区国产精品乱码| av中文乱码字幕在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 麻豆国产av国片精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99国产综合亚洲精品| 午夜激情福利司机影院| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 天堂动漫精品| 日韩有码中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品影院久久| 日本免费a在线| av片东京热男人的天堂| www日本在线高清视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一夜夜www| 久久久国产成人精品二区| 在线观看舔阴道视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线av久久热| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产成人精品久久二区二区91| 在线av久久热| 黄色成人免费大全| 午夜免费观看网址| 1024手机看黄色片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲免费av在线视频| 国产精品亚洲美女久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 嫩草影院精品99| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中文字幕高清在线视频| 欧美又色又爽又黄视频| 极品教师在线免费播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲三区欧美一区| 女性生殖器流出的白浆| 精品久久蜜臀av无| 日本熟妇午夜| 欧美午夜高清在线| 亚洲成av人片免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 午夜福利在线在线| 亚洲七黄色美女视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 婷婷亚洲欧美| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久精品成人免费网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 999久久久国产精品视频| 视频区欧美日本亚洲| aaaaa片日本免费| av电影中文网址| 久久国产乱子伦精品免费另类| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品99久久99久久久不卡| 久热这里只有精品99| 国产成人影院久久av| 九色国产91popny在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品影院6| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 大香蕉久久成人网| 一级毛片高清免费大全| 啦啦啦免费观看视频1| 人成视频在线观看免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜视频精品福利| 一个人免费在线观看的高清视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 在线观看66精品国产| 黄片小视频在线播放| 午夜免费激情av| 成人一区二区视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| a在线观看视频网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 色在线成人网| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 国产精品久久电影中文字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| xxxwww97欧美| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看日韩欧美| 成人国产综合亚洲| 88av欧美| 日本一区二区免费在线视频| 欧美性长视频在线观看| 深夜精品福利| 少妇的丰满在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 久久九九热精品免费| 午夜日韩欧美国产| 黄色女人牲交| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线国产一区二区在线| 黄色女人牲交| xxxwww97欧美| 女同久久另类99精品国产91| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久国产成人精品二区| 婷婷精品国产亚洲av| 免费在线观看完整版高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 激情在线观看视频在线高清| 美女高潮到喷水免费观看| 在线av久久热| 悠悠久久av| 黄色视频,在线免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产99白浆流出| 嫩草影院精品99| 午夜久久久在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲avbb在线观看| 好男人电影高清在线观看| 免费观看人在逋| √禁漫天堂资源中文www| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩精品青青久久久久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 两个人看的免费小视频| 亚洲第一av免费看| 国产真实乱freesex| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美午夜高清在线| 国产单亲对白刺激| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产片内射在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 色播亚洲综合网| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久亚洲精品不卡| 亚洲成a人片在线一区二区| 久热爱精品视频在线9| 哪里可以看免费的av片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 免费看a级黄色片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 天堂影院成人在线观看| 久久久国产欧美日韩av| a在线观看视频网站| 9191精品国产免费久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 特大巨黑吊av在线直播 | xxxwww97欧美| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久亚洲真实| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 12—13女人毛片做爰片一| 日本免费a在线| 我的亚洲天堂| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产真实乱freesex| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费在线观看完整版高清| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久久久久久久免费视频了| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费搜索国产男女视频| 欧美日本视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲专区国产一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲五月天丁香| 9191精品国产免费久久| 哪里可以看免费的av片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品日产1卡2卡| 18禁观看日本| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av熟女| 99精品在免费线老司机午夜| 国产91精品成人一区二区三区| 在线av久久热| 国产精品影院久久| 在线观看日韩欧美| 999久久久精品免费观看国产| 性色av乱码一区二区三区2| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av欧美777| 三级毛片av免费| 亚洲熟女毛片儿| 91av网站免费观看| 色播在线永久视频| 99在线人妻在线中文字幕| www.精华液| 波多野结衣高清无吗| 大香蕉久久成人网| 少妇 在线观看| 国产精品av久久久久免费| 精品一区二区三区av网在线观看| 黄色女人牲交| 午夜久久久在线观看| 精品人妻1区二区| 日韩高清综合在线| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲人成77777在线视频| 男女那种视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 国产视频内射| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| av片东京热男人的天堂| 波多野结衣高清无吗| 久久九九热精品免费| 精品福利观看| 色播亚洲综合网| 美国免费a级毛片| 变态另类丝袜制服| 一级毛片女人18水好多| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av成人av| 国产精品一区二区免费欧美| 一进一出好大好爽视频| www.熟女人妻精品国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 男人操女人黄网站| 久热爱精品视频在线9| 18禁美女被吸乳视频| 中文字幕高清在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 超碰成人久久| 国产精品九九99| 级片在线观看| 免费av毛片视频| 91麻豆av在线| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成人av教育| 欧美亚洲日本最大视频资源| 香蕉国产在线看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲av第一区精品v没综合| 色播在线永久视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 热re99久久国产66热| 波多野结衣高清作品| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 狂野欧美激情性xxxx| 韩国精品一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 精品电影一区二区在线| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美最黄视频在线播放免费| 深夜精品福利| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久久国产成人免费| 国产亚洲av高清不卡| 母亲3免费完整高清在线观看| 无限看片的www在线观看| a级毛片a级免费在线| 看免费av毛片| 99在线人妻在线中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲av美国av| 欧美久久黑人一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 99热只有精品国产| 91老司机精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲男人天堂网一区| 欧美大码av| 欧美午夜高清在线| 久久人妻av系列| 国产私拍福利视频在线观看| xxx96com| 天堂√8在线中文| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 少妇粗大呻吟视频| 一级作爱视频免费观看| 国产爱豆传媒在线观看 | 久久 成人 亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲人成网站高清观看| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜免费鲁丝| 黄色视频不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 黑丝袜美女国产一区| 波多野结衣巨乳人妻| 变态另类丝袜制服| 一级毛片高清免费大全| 听说在线观看完整版免费高清| 热re99久久国产66热| 色综合站精品国产| 中文字幕av电影在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产综合亚洲精品| 欧美乱码精品一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 无限看片的www在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 一级毛片精品| 久久久久久国产a免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲中文av在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲午夜理论影院| 国产精品av久久久久免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美日韩乱码在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 又大又爽又粗| 国产成人欧美| 亚洲人成伊人成综合网2020| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99热这里只有精品一区 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| cao死你这个sao货| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 午夜福利在线观看吧| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久九九热精品免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 18禁观看日本| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲av五月六月丁香网| 夜夜爽天天搞| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利视频1000在线观看| 身体一侧抽搐| 一进一出抽搐动态| 人人妻人人澡欧美一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 黄色丝袜av网址大全| 国产欧美日韩一区二区三| 男女那种视频在线观看| av有码第一页| 亚洲专区字幕在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品二区激情视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久99热这里只有精品18| 久久伊人香网站| 亚洲激情在线av| 黄色a级毛片大全视频| 国产一区二区激情短视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 十八禁人妻一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 女警被强在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产激情久久老熟女| 国产一卡二卡三卡精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美性长视频在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产高清视频在线播放一区| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av成人一区二区三| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 制服诱惑二区| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 88av欧美| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 手机成人av网站| 91国产中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国内精品久久久久久久电影| 啦啦啦免费观看视频1| 在线播放国产精品三级| 欧美激情极品国产一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| www.www免费av| 老汉色∧v一级毛片| 人人妻人人澡人人看| 久久人人精品亚洲av| 99热这里只有精品一区 | 999精品在线视频| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜久久久久精精品| 久久香蕉国产精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费在线观看黄色视频的| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天堂影院成人在线观看| 国产精品九九99| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 香蕉国产在线看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲avbb在线观看| 国产av不卡久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美黑人巨大hd| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99re在线观看精品视频| 午夜免费鲁丝| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 又紧又爽又黄一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成人国产一区最新在线观看| 91麻豆av在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 91在线观看av| 久久精品91无色码中文字幕| 自线自在国产av| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美三级三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 中亚洲国语对白在线视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久国产成人精品二区| 1024香蕉在线观看| 精品国产国语对白av| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲成人久久性| 久久草成人影院| 18禁国产床啪视频网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 最近最新免费中文字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 最近在线观看免费完整版| 91成人精品电影| 级片在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 日本成人三级电影网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日日夜夜操网爽| 51午夜福利影视在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美日本视频| 国产精品久久视频播放| 欧美又色又爽又黄视频| 天堂影院成人在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 日本黄色视频三级网站网址| 性欧美人与动物交配| 久久久久久久久久黄片| 超碰成人久久| 最近在线观看免费完整版| 搡老岳熟女国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产精品合色在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产高清激情床上av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩av在线大香蕉| 大型黄色视频在线免费观看| 成人18禁在线播放| 成在线人永久免费视频| 亚洲电影在线观看av| 国产单亲对白刺激| 天堂√8在线中文| 色老头精品视频在线观看| 久9热在线精品视频| 精华霜和精华液先用哪个| 成人一区二区视频在线观看| 久久亚洲真实| 婷婷精品国产亚洲av在线| 观看免费一级毛片| 欧美激情高清一区二区三区| 999精品在线视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久这里只有精品19| 国产欧美日韩一区二区三| 国产伦在线观看视频一区| 青草久久国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 一级毛片精品| 麻豆av在线久日| 久久人人精品亚洲av| 欧美一级a爱片免费观看看 | svipshipincom国产片| 成在线人永久免费视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 人妻久久中文字幕网| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲三区欧美一区| 99久久综合精品五月天人人| 在线天堂中文资源库| 老司机在亚洲福利影院| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄片小视频在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 黄色女人牲交| 国产伦在线观看视频一区| 麻豆国产av国片精品| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 中文资源天堂在线| 麻豆国产av国片精品| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产免费av片在线观看野外av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产免费av片在线观看野外av| 成人永久免费在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产欧美日韩一区二区三| 超碰成人久久| 无人区码免费观看不卡| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲欧美98|