HPLC-ELSD法測定益肺健脾顆粒中黃芪甲苷含量

張 丹 張紅偉 楊 飛

鄭州市食品藥品檢驗所，河南鄭州 450006

HPLC-ELSD法測定益肺健脾顆粒中黃芪甲苷含量

張 丹 張紅偉 楊 飛

鄭州市食品藥品檢驗所，河南鄭州 450006

目的建立益肺健脾顆粒中黃芪甲苷的含量測定方法。方法采用HPLC-ELSD法進行測定，色譜柱：Agilent C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相：乙腈 - 水（32 : 68），流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，漂移管溫度：100℃，氣體流速：2.0mL/min；增益：1。結(jié)果黃芪甲苷在0.05245～0.4196mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均加樣回收率為95.52%（RSD=1.19%）。結(jié)論該方法簡便﹑準確﹑可靠，可用于益肺健脾顆粒的質(zhì)量評價及控制。

益肺健脾顆粒；黃芪甲苷；HPLC-ELSD

益肺健脾顆粒為黃芪﹑太子參﹑甘草﹑陳皮等組成的中藥復方制劑，其中君藥為黃芪，黃芪甲苷是黃芪的有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)﹑器官保護﹑降糖﹑抗炎抗病毒等多種藥理作用[1-2]。黃芪藥材及含有黃芪的制劑多采用黃芪甲苷作為評價指標[3-16]。黃芪甲苷含量測定方法有薄層掃描法﹑高效液相色譜法等[5-16]。

目前，益肺健脾顆粒的質(zhì)量標準是國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS-11059（ZD-1059）-2002-2011Z，在標準中，黃芪甲苷的含量測定采用薄層掃描法。但薄層掃描法易受薄層板﹑環(huán)境溫濕度及顯色效果等因素的影響，導致測定結(jié)果重現(xiàn)性差。在《中國藥典》2015版一部中，采用HPLC-ELSD法測定了黃芪藥材及其收載多種中藥復方制劑中黃芪甲苷的含量[3-4]，操作簡便，穩(wěn)定可靠。因此，本研究采用HPLC-ELSD法對益肺健脾顆粒中黃芪甲苷的含量測定方法進行考察和優(yōu)化，并進行了方法學驗證，為益肺健脾顆粒質(zhì)量標準的完善及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech公 司）；Agilent ZORBAX SB-C18鍵 合 硅 膠 柱（4.6mm×250mm，5μm）；S205DμalRange型電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）。KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

甲醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），正丁醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），氨水（分析純，洛陽昊華化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，美國Fisher公司），水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）；黃芪甲苷對照品（批號：110781-200613，中國食品藥品檢定研究院）；益肺健脾顆粒（批號：160301，160302，160303，河南信心藥業(yè)有限公司）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（32 :68）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，漂移管溫度：100℃，氣體流速：2.0mL/min；增益：1。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品10.49mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.049mg/mL的對照品儲備溶液。精密量取上述對照品儲備溶液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度并搖勻，制成濃度為0.2098mg/mL的對照品溶液，濾過，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品適量，混勻，研細，取約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30mL，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，分次轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 黃芪陰性對照溶液的制備

根據(jù)該制劑處方中的比例，按照制法制備缺黃芪藥材的陰性對照樣品，按“2.3”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

按“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液﹑供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果陰性對照溶液在黃芪甲苷色譜峰的相應位置上沒有干擾，專屬性強。

圖1 高效液相色譜圖

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項下的對照品儲備溶液 0.5﹑1﹑2﹑3﹑4mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，使其濃度分別 為 0.05245﹑0.1049﹑0.2098﹑0.3147﹑0.4196mL/min。精密吸取上述5個對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量的對數(shù)（X）為橫坐標，以峰面積的對數(shù)（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.4573X+6.2551，r=0.9999。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.05245～0.4196mL/min范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.6.2 精密度試驗 取“2.2”項下同一份對照品溶液，重復進樣6次，每次10μL，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.10%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取同一批益肺健脾顆粒（批號：160301），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，分別進樣10μL，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，黃芪甲苷的平均含量為0.1327mL/min，RSD為1.37%，表明該方法重復性好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑10﹑12h 進樣 10μL，記錄峰面積，計算得黃芪甲苷含量的RSD為0.95%，結(jié)果表明，該供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗 取同一批益肺健脾顆粒（批號：160301），混勻，研細，分別取細粉6份，每份約5g，精密稱定，分別于每份供試品細粉中加入黃芪甲苷對照品0.6294mg（即精密量取濃度為0.2094mL/min的黃芪甲苷對照品溶液3mL），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，分別吸取10μL，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果顯示，平均回收率為95.52%，RSD=1.19%（n=6），符合定量分析的要求，測定結(jié)果見表1。

2.7 供試品含量測定

取益肺健脾顆粒3批（批號：160301，160302，160303），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液5﹑10μL及供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算供試品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果顯示，益肺健脾顆粒（批號：160301，160302，160303）中黃芪甲苷的含量分別為0.1336﹑0.1357和0.1324mL/min。

3 結(jié)論與討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定

分別考察了超聲提取法和回流提取法兩種提取方法及提取溶劑﹑提取時間，結(jié)果確定甲醇超聲提取30min最佳。

3.2 色譜條件的確定

參照《中國藥典》2015年版一部“黃芪”藥材及含有“黃芪”的成方制劑中黃芪甲苷【含量測定】項下的色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗[4-5]，并參考文獻[7-16]中的相關(guān)方法，確定選用HPLC-ELSD法作為供試品的含量測定方法，并對該方法的色譜條件進行考察，根據(jù)供試品色譜中黃芪甲苷的分離效果，調(diào)整流動相中乙腈與水的比例。結(jié)果表明，流動性比例為乙腈-水（32 : 68）時，供試品中黃芪甲苷峰分離度良好，保留時間合適，且陰性對照溶液無干擾。因此，供試品中黃芪甲苷含量測定最優(yōu)的色譜條件：流動相為乙腈-水（32 : 68），流速為1.0mL/min，柱溫為 35℃。

表1 加樣回收試驗的結(jié)果（n=6）

3.3 蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)的確定

為了基線平穩(wěn)，且能達到含量測定的要求，本試驗對ELSD漂移管溫度﹑載氣流速及增益等參數(shù)進行了優(yōu)化。確定最優(yōu)條件：漂移管溫度為100℃，氣體流速為2.0mL/min；增益為1。

綜上所述，本試驗建立的方法簡便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，測定迅速，結(jié)果準確，故可作為益肺健脾顆粒質(zhì)量控制的方法之一，為益肺健脾顆粒質(zhì)量標準的進一步完善提供依據(jù)。

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Determination of astragaloside IV in Yifei Jianpi granules by HPLC-ELSD

ZHANG Dan ZHANG Hongwei YANG Fei
Zhengzhou Institute of Food and Drug Control,Henan 450006,China

ObjectiveTo establish a method for the determination of astragaloside IV in Yifei Jianpi granules.MethodsHPLC-ELSD method was used for the determination with chromatographic column: Agilent C18(4.6mm×250mm,5m),mobile phase:acetonitrile water(32 : 68),flow rate:1.0mL/min,column temperature:35 ℃ ,drift tube temperature:100℃,gas flow rate:2.0mL/min;gain:1.ResultsThe linear relationship of astragaloside IV between 0.05245-0.4196mg/mL range was good (r=0.9999),and the average recovery was 95.52%(RSD=1.19%).ConclusionThe method is simple,accurate and reliable.It can be used for the quality evaluation and control of Yifei Jianpi granules.

Yifei Jianpi granule;Astragaloside IV;HPLC-ELSD

R286

A

2095-0616（2017）19-41-03

2017-07-31）