堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子1對(duì)提高隨意型皮瓣缺氧耐受的實(shí)驗(yàn)研究

陳一衡 王安遠(yuǎn) 薛繼鑫 陳廣軍 褚庭綱 李志杰?

堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子1對(duì)提高隨意型皮瓣缺氧耐受的實(shí)驗(yàn)研究

陳一衡 王安遠(yuǎn) 薛繼鑫 陳廣軍 褚庭綱 李志杰?

目的 探討納米微囊包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）對(duì)提高大鼠隨意型皮瓣缺氧耐受的影響和作用機(jī)制。方法 根據(jù)改良大鼠McFarlane皮瓣制作方法，在28只健康SD大鼠的背部設(shè)計(jì)隨意型皮瓣。在距皮瓣蒂部近、中、遠(yuǎn)三處局部分別注射藥物。根據(jù)注射藥物不同分為4組，納米微囊包裹bFGF聯(lián)合HIF-1組（實(shí)驗(yàn)組）、納米微囊包裹bFGF組（對(duì)照組1）、納米微囊包裹HIF-1組（對(duì)照組2）和納米微囊組（空白對(duì)照組）。術(shù)后第7天處死大鼠，分別測量皮瓣的成活面積、HE染色及目的蛋白免疫組化表達(dá)情況及皮瓣新生微血管密度（MVD）檢測等。結(jié)果 術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組皮瓣存活率（92±5）%，MVD（44±7）個(gè)，均高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中皮瓣組織水腫和炎癥細(xì)胞浸潤情況明顯比其他各對(duì)照組減輕。實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組1和對(duì)照組2中能觀察到目的蛋白的表達(dá)，而空白對(duì)照組中無表達(dá)。結(jié)論 以納米微囊為載體包裹bFGF和HIF-1，能顯著提高大鼠隨意型皮瓣的缺氧耐受，增加皮瓣成活面積，促進(jìn)皮瓣存活。

納米微囊 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 低氧誘導(dǎo)因子 隨意型皮瓣 大鼠 血管生成

隨意型皮瓣是臨床上用于修復(fù)創(chuàng)面、重建功能的一種最常用的手術(shù)方法。但常出現(xiàn)皮瓣部分或完全壞死的并發(fā)癥。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）為一種血管再生的主要影響因子，其促進(jìn)毛細(xì)血管新生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，提高血管的通透性并改善局部血供等一系列生物學(xué)作用已得到廣泛認(rèn)可［1］。而低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，公認(rèn)其可以引起一系列細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)，促進(jìn)紅細(xì)胞生成，加速血管形成［2］。2015年9月至2016年8月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討bFGF聯(lián)合HIF-1對(duì)提高大鼠隨意型皮瓣缺氧耐受的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)試劑及動(dòng)物：鼠抗人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）及低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）抗體購自美國Cell Signaling公司，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）檢測試劑盒購自廣東光華科技生物公司。健康清潔級(jí)SD大鼠28只，雌雄不限，體質(zhì)量260～300g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證：SCXK2016-0041，使用許可證：SYXK2016-0167）提供。（2）納米微囊包裹bFGF和HIF-1的制備：參考相關(guān)文獻(xiàn)資料［3］，前期已成功制備甲殼糖（Chitosan）納米微囊包裹-真核表達(dá)載體PcDNA3/bFGF及PcDNA3/HIF-1，建立復(fù)合型基因轉(zhuǎn)移載體［4］。藥物分為納米微囊包裹bFGF和HIF-1，納米微囊包裹bFGF，納米微囊包裹HIF-1及僅有納米微囊的空白對(duì)照液，藥品制備完成后待用。

1.2 方法 （1）大鼠隨意型皮瓣的制作：5%水合氯醛腹腔注射麻醉，將動(dòng)物俯臥位固定，脫毛，采用改良后的McFarlane皮瓣制作方法［5］，以大鼠尾部兩髂嵴連線為蒂，在背部正中設(shè)計(jì)寬3cm、長9cm矩形隨意型皮瓣。切開皮膚和皮下組織，達(dá)深筋膜淺層，保留真皮下毛細(xì)血管網(wǎng)，于深筋膜淺層表面分離皮下組織，遇重要血管即以絲線結(jié)扎，創(chuàng)面徹底止血。皮瓣制作完成后立即間斷縫合，切口周圍以碘伏消毒后涂抹金霉素軟膏，腹腔注射生理鹽水（50ml/kg）抗休克。用相應(yīng)的試劑于術(shù)后2 h在大鼠皮瓣距蒂部近、中、遠(yuǎn)三處（分別離蒂部3、6、9cm）局部注射，注射量為1.5 ml，連續(xù)注射7d。每只大鼠需肌肉注射青霉素鈉4萬U/d預(yù)防感染。（2）實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)術(shù)后注射藥物不同，將28只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組各7只。A組：納米微囊包裹bFGF聯(lián)合HIF-1組（實(shí)驗(yàn)組）；B組：納米微囊包裹bFGF組（對(duì)照組1）；C組：納米微囊包裹HIF-1組（對(duì)照組2）；D組：僅有納米微囊的空白對(duì)照組。（3）大體觀察：觀察術(shù)后7d內(nèi)皮瓣存活狀況，包括皮瓣顏色、組織彈性、質(zhì)地，壞死面積。皮瓣壞死的形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定為顏色變黑、質(zhì)地變硬、無毛細(xì)血管反應(yīng)、針刺出血試驗(yàn)陰性。通過數(shù)碼相機(jī)拍攝皮瓣照片，并將圖片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，通過Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算皮瓣存活率。采用公式為：皮瓣存活率=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。（4）組織病理切片觀察：術(shù)后第7天將大鼠處死，在皮瓣成活和壞死交界部位及皮瓣近端成活部位切取皮瓣組織，包括皮膚、皮下肉膜層和淺筋膜層，于10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水包埋，制成4μm厚的切片。將標(biāo)本切片平放于二甲苯中脫蠟，然后依次放入不同濃度酒精中脫水，最后蒸餾水小心洗后取出，轉(zhuǎn)入染液。放入提前配置的蘇木精-伊紅染色液中染色，最后完成透明和封固切片的步驟，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄，在低倍鏡下觀察各區(qū)域組織水腫、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤等情況。（5）免疫組化檢測bFGF和HIF-1蛋白表達(dá)：采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測bFGF及HIF-1蛋白表達(dá)。分別切取各組皮瓣制作石蠟切片，加入I抗和生物素標(biāo)記的II抗，用SABC溶液顯色及蘇木素復(fù)染后用中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。（6）微血管密度（Microvessel Density，MVD）測量：先在低倍鏡下找到微血管密集區(qū)，然后在20×10倍光鏡下隨意選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)血管斷面數(shù)目取平均值，計(jì)算出單位面積微血管數(shù)目（個(gè)/ram2）作為評(píng)價(jià)MVD的指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，多個(gè)樣本率的比較采用行×列表卡方檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩組間比較采用卡方分割方法檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣大體形態(tài)觀察 術(shù)后第1天，各組皮瓣均出現(xiàn)不同程度的腫脹，部分皮瓣遠(yuǎn)端呈暗紫色，但各組均無壞死；術(shù)后第3天，部分皮瓣由遠(yuǎn)及近出現(xiàn)局部灶狀、小片狀壞死，壞死部分多呈紅褐色，有瘀血；術(shù)后第7天各組皮瓣壞死部分顏色變黑、質(zhì)地變硬、針刺出血試驗(yàn)陰性，并且界限已穩(wěn)定。所有采集的皮瓣圖像經(jīng)軟件處理后計(jì)算皮瓣存活率，4組分別為（92±5）%、（76±5）%、（69±5）%、（52±5）%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），納米微囊包裹bFGF聯(lián)合HIF-1組（A組）與其他三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 皮瓣病理組織學(xué)觀察 病理切片顯示，在皮瓣交界區(qū)可見急性炎癥細(xì)胞浸潤，皮膚附屬器如毛囊結(jié)構(gòu)破壞，皮下組織水腫，肉膜層表現(xiàn)為肌纖維變性壞死。實(shí)驗(yàn)組與其他三組對(duì)照組相比，組織水腫，血管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤較輕（見圖1）。納米微囊包裹bFGF聯(lián)合HIF-1組（A組）明顯有較高密度的小血管分布，空白對(duì)照組（D組）小血管分布最少。各組在皮瓣近端均無明顯壞死改變，表皮變性不明顯，皮下組織無明顯水腫，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。

2.3 皮瓣組織中bFGF和HIF-1蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，在A、B、C三組中可以觀察到bFGF和HIF-1蛋白的表達(dá)，肉眼比較各組無明顯差異，D組中未見明顯表達(dá)（見圖2）。

2.4 皮瓣組織中MVD比較 在皮瓣交界區(qū)的標(biāo)本中，A 組 MVD（44±7）個(gè)，B組1（35±6）個(gè)，C 組（29±7）個(gè)，D組（21±5）個(gè)，A組與其他三組分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組皮瓣組織學(xué)觀察（HE×100）

圖2 各組皮瓣組織中bFGF和HIF-1蛋白免疫組化染色觀察（×100）

3 討論

皮瓣移植修復(fù)創(chuàng)面手術(shù)失敗的原因常是動(dòng)脈血供障礙或靜脈回流受阻，而目前臨床上尚無公認(rèn)的改善皮瓣存活的最佳方法。對(duì)于臨床上應(yīng)用最為廣泛的隨意型皮瓣的血供保障，除依靠蒂部的血管和皮下筋膜血管網(wǎng)的供養(yǎng)以外，皮瓣基底和周圍組織新生血管及時(shí)長入也是一個(gè)重要的因素。故及早重建皮瓣血運(yùn)，增加皮瓣供氧，調(diào)節(jié)血管增生成為提高隨意型皮瓣缺氧耐受的新策略，也是臨床上提高該類型皮瓣手術(shù)成功率的一個(gè)重要途徑。

已知多種生長因子和細(xì)胞因子具有促進(jìn)血管新生作用，bFGF已被廣泛認(rèn)可為血管再生的主要影響因子［6］。bFGF通過與靶細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，激活酪氨酸蛋白激酶，再經(jīng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號(hào)傳入細(xì)胞核內(nèi)，與靶細(xì)胞特異性受體結(jié)合，促進(jìn)并加快新生毛細(xì)血管形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，提高血管的通透性，從而改善皮瓣的局部血供并提高血氧飽和度，提高皮瓣存活率。

HIF-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其在低氧狀況下誘導(dǎo)產(chǎn)生，是細(xì)胞適應(yīng)低氧的重要蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。隨意型皮瓣在制取過程中產(chǎn)生的局部低氧環(huán)境將上調(diào)HIF-1的表達(dá)，使其活性增高，能調(diào)節(jié)血管收縮，促進(jìn)紅細(xì)胞生成，加速血管形成［7］。Liu等［7］研究表明，HIF-l是通過作用于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）編碼基因和VEGF受體編碼基因調(diào)控區(qū)的低氧反應(yīng)元件結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)VEGF的表達(dá)增加，從而增加局部VEGF含量。目前的研究多是單純通過bFGF或HIF-1的應(yīng)用促進(jìn)血管生成和提高血供，但對(duì)于這兩類具有互補(bǔ)作用的細(xì)胞因子的共同效應(yīng)卻鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)于藥物局部注射在改善隨意型皮瓣微循環(huán)中的作用。在已有的動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)研究中已證實(shí)bFGF與HIF-1聯(lián)合應(yīng)用于成纖維細(xì)胞，可以通過抗氧化，抗炎和激活COX-2和VEGF的蛋白表達(dá)水平促進(jìn)微血管形成［8］。

單獨(dú)使用未經(jīng)包裝的包括bFGF在內(nèi)的大多數(shù)血管源性生長因子，由于其半衰期很短，有的甚至不到1h，直接應(yīng)用較難達(dá)到所需要的含量分布，其生物利用度非常低。通過采用納米微囊（Nanosphere）包裹轉(zhuǎn)移技術(shù)可以較好解決上述問題。該技術(shù)以生物相容性好、可降解的高分子材料為載體，將藥物包裹成微囊，控制被載藥物的釋放，影響藥物代謝或者釋放。該技術(shù)在免疫源性、安全性及定向性方面優(yōu)于病毒載體，而轉(zhuǎn)染率也較裸露質(zhì)粒高［8］。賈寧等［3］應(yīng)用納米微囊-VEGF復(fù)合體轉(zhuǎn)染鼠成纖維細(xì)胞，證實(shí)相對(duì)濃度的納米微囊有較脂質(zhì)體優(yōu)越的基因轉(zhuǎn)移效率，同時(shí)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有發(fā)生基因重組，具有一定的安全性。澎湃等［9］將納米微囊-VEGF復(fù)合體作用于兔耳慢性創(chuàng)面，可以提高創(chuàng)傷組織中受體表達(dá)和微血管形成，從而促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建納米微囊包裹bFGF和HIF-1兩種血管生長因子，作用于大鼠隨意型皮瓣，有效地促進(jìn)血管新生，減少皮瓣壞死，提高皮瓣缺氧耐受。該方法為臨床上應(yīng)用隨意型皮瓣修復(fù)創(chuàng)面手術(shù)中提高皮瓣的存活率提供新的方法。

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Objective To investigate the effect of nano-microcapsules encapsulated basic fibroblast growth factor（bFGF）combined with hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）on increasing the survival area of rat’s ischemia random flaps and its mechanism. Methods McFarlane flap model was established on the rat dorsum. Twenty-eight Sprague Dawley rats were used for this experiment. Local and homogeneous injections were performed in the proximal，middle and distal end of the flaps. The flaps were divided into 4 groups equally according to the different drugs： Nanomicrocapsules encapsulated bFGF combined with HIF-1（experimental group），nano-microcapsules encapsulated bFGF（control group 1），nano-microcapsules encapsulated HIF-1（control group 2）and nano-microcapsules（blank control group）. The measurement of the survival area of the flaps，HE staining，the expression of interest protein and the detection of neoformative microvessel density（MVD）were performed at 7 days. Results On postoperative day 7，the percentage of the flap survival area of the experimental group was（92±5）%，and the MVD was（44±7）. These results were significantly higher than that of control groups（P＜0.05）. Tissue edema and inflammatory cell infiltration observed in the experimental group were obviously reduced than those of the control groups. The expression of interest protein was observed in experimental group，control group 1 and control group 2. Conclusion The nano-microcapsules encapsulated bFGF combined with HIF-1 can obviously increase the survival area of ischemia random flaps.

Nano-microcapsule Basic fibroblast growth factor Hypoxia inducible factor Random flap Rat Angiogenesis

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140167）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2015KYA160）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

*通信作者