Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡在肺氣腫大鼠肺功能下降中的作用研究

顧超 劉元順 呂云 曹林峰 李亞清 李娜

·論著·

Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡在肺氣腫大鼠肺功能下降中的作用研究

顧超 劉元順 呂云 曹林峰 李亞清 李娜

目的 探討Ⅱ型肺泡上皮細胞（AECⅡ）凋亡在被動吸煙肺氣腫大鼠肺功能下降中的相關作用。方法 選取90只清潔級雄性SD大鼠，完全隨機平均分成6組，A組正常對照組，B、C、D、E、F組大鼠被動吸入不同濃度香煙煙霧。采用小動物肺功能儀測定各組大鼠肺功能、肺組織病理學檢測、Real-time PCR測定肺泡表面活性蛋白A（SPA）和SPC mRNA水平、免疫組織化學法檢測SPA和SPC蛋白表達水平，TUNEL與SPC雙重免疫熒光染色分析AECⅡ凋亡情況。結果 當香煙煙霧中一氧化碳（CO）濃度達到（300±10）ppm以上時，大鼠肺功能中氣道阻力（AR）明顯增加、肺動態(tài)順應性（Cdyn）及呼氣峰值流速（PEF）降低（P＜0.05）；大鼠肺組織出現明顯肺氣腫樣表現，肺泡平均內襯間隔（MLI）和平均肺泡面積（MAA）顯著增加（P＜0.05）；肺組織中SPA和SPC mRNA及蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），AECⅡ凋亡百分比顯著增高（P＜0.05）。結論 AECⅡ凋亡在被動吸煙建立的大鼠肺氣腫發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

被動吸煙 肺泡 上皮細胞 凋亡 大鼠

據預計到2020年，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）將是全球死亡原因的第三位因素［1］。肺彈性組織的降解、肺泡結構破壞與丟失、氣腔的擴大是引起肺氣腫或COPD患者氣流受限的重要原因［2］。吸煙是引起肺氣腫和COPD的最主要危險因素。Ⅱ型肺泡上皮細胞（type II alveolar epithelial cells，AECⅡ）作為AECI的祖細胞，具有合成和分泌肺泡表面活性物質（surfactant protein，SPs）、維持肺泡內外液體平衡、免疫調節(jié)等作用［3］，在維持正常肺泡內穩(wěn)態(tài)和肺組織損傷修復中具有十分重要的意義［4］。2016年8月至12月作者采用不同被動吸煙濃度建立肺氣腫大鼠模型，分析其肺功能變化及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 （1）動物：清潔級雄性SD大鼠90只，體重180～200 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（許可證號：SCXK滬2008-0016），飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，飼養(yǎng)及實驗溫度21℃～25℃，相對濕度40%～60%，12h明暗交替。本研究經浙江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。（2）主要試劑： TRIzol（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒（日本TaKaRa公司），兔抗大鼠肺表面活性蛋白（SP）A及SPC抗體、羊抗兔IgG二抗（美國Santa Cruz公司），TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒（江蘇碧云天公司），雄獅牌香煙（浙江中煙工業(yè)有限公司），DAPI（美國Sigma公司）。引物序列由上海Invitrogen公司合成（見表1）。

表1 引物序列

1.2 方法 （1）建立肺氣腫大鼠模型：將90只大鼠完全隨機平均分為6組，參照文獻［5-6］方法，采用被動吸煙建立肺氣腫大鼠模型。每天將B組、C組、D組、E組、F組大鼠分別置于不同的自制吸煙箱（60cm×50cm×40cm）中，每只吸煙箱點燃香煙數不同，保證B組CO濃度維持在（200±11）ppm、C組CO濃度維持在（300±10）ppm、D組CO濃度維持在（400±13）ppm、E組CO濃度維持在（500±15）ppm和F組CO濃度維持在（600±18）ppm，每次被動吸煙時間90 min，7d/周，共12周。同時間段內，將A組大鼠置于相同吸煙箱中吸入空氣。（2）大鼠肺功能測定：各組大鼠被動吸煙12周完成后，采用小動物肺功能儀（上海Alcott Biotech公司）測定各組大鼠肺功能，麻醉消毒后固定，切開頸部皮膚，將氣管倒T型切開，食道插管經口插入食道中部，并連接壓力傳感器記錄食道壓（即胸腔負壓），Y型套管氣管插管后，分別連接至微型壓力傳感器和呼吸流量傳感器記錄氣道壓和呼吸流量。觀察食道壓、氣道壓和呼吸流量，采集信號良好的波形10min，通過MPA肺功能分析系統計算出氣道阻力（AR）、肺動態(tài)順應性（Cdyn）和呼氣峰值流速（PEF）并取平均值。（3）肺組織病理學檢測：各組大鼠完成肺功能檢測后立即用10%水合氯醛腹腔內麻醉處死各組大鼠，對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。取各組大鼠左肺組織，于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，常規(guī)脫蠟至水，行蘇木素-伊紅（HE）染色，肺組織病理半定量分析肺泡平均內襯間隔（MLI，將每個視野正中為中心劃“十”字交叉線，計數經十字交叉線的肺泡間隔數為Ns；測量十字線總長度為L，MLI=L/Ns）及平均肺泡面積（MAA，計數每個視野的肺泡數，測量每個視野面積為TA，HE染色陽性區(qū)域（肺實質）面積為 PA，MAA =（TA-PA）/Na）。（4）Real-time PCR檢測SPA及SPC mRNA水平：收集各組大鼠右肺組織，以TRIzol提取總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA，行Real-time PCR，以GAPDH為內參；根據目的基因分別加入：2×SYBR? Premix Ex TaqⅡ 10μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl，上游引物（10μmol/L）0.8μl，下游引物（10μmol/L）0.8μl，cDNA 2μl，補充無菌去離子水至總體積為20μl，離心混勻，95℃預變性4 min（95℃ 10s，56℃ 30s，72℃ 30s，共 45 個循環(huán)）。以2-ΔΔCt分析目的基因相對表達差異。（5）免疫組化法檢測SPA和SPC蛋白表達：取各組大鼠左肺組織切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內源性氧化酶后高壓抗原修復，山羊血清封閉，加入1∶500稀釋的SPA或SPC抗體孵育，加入1∶100稀釋的生物素標記的抗兔IgG孵育，DAB顯色后蘇木素復染，采用中性樹膠封片，光鏡下觀察拍照，并計算陽性細胞所占百分比。SPA或SPC陽性細胞百分比=SPA或SPC陽性細胞數/400個總細胞×100%。（6）TUNEL和SPC雙重免疫熒光染色：取各組大鼠左肺組織切片，TUNEL法原位標記凋亡細胞，嚴格按試劑盒說明書操作。組織切片常規(guī)脫蠟至水，不含DNase的蛋白酶K消化，滴加1∶500稀釋的SPC抗體孵育，后加入1∶200稀釋的FITC- IgG抗體，室溫孵育，漂洗后加入TUNEL檢測液避光孵育，DAPI復染，IX71熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察拍照。計算TUNEL和SPC雙陽性細胞所占百分比，即AECⅡ凋亡百分比=TUNEL和SPC雙陽性細胞數/DAPI陽性細胞總數×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺功能改變 見表2。

表2 各組大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比較［n=15，（x±s）］

2.2 肺組織病理學變化 各組大鼠肺組織常規(guī)HE染色結果顯示，B組未出現明顯的肺氣腫樣表現；C組、D組、E組和F組大鼠肺組織均出現肺氣腫征象：部分肺泡呈囊狀擴張，肺泡腔不規(guī)則且大小不一，相同視野內肺泡數目減少，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合。肺組織病理半定量分析，見表3。

2.3 SPA和SPC表達水平 見圖1、2。

2.4 AECⅡ凋亡變化 見圖3。

3 討論

圖1 各組大鼠肺組織SPA和SPC mRNA表達水平

圖2 各組大鼠肺組織SPA和SPC陽性細胞百分比

圖3 各組大鼠肺組織AECⅡ凋亡百分比

COPD發(fā)病機制復雜，病理改變累及氣道、肺實質和肺血管等結構，且呈進行性發(fā)展，目前尚無有效藥物阻止COPD患者肺功能長期下降［1］。肺彈性組織的降解、肺泡結構破壞與丟失、氣腔的擴大是引起肺氣腫或COPD患者氣流受限的重要原因。吸煙是肺氣腫和COPD的主要危險因素，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關，被認為是COPD的常見致病因素［7］。本研究中，當香煙煙霧中CO濃度維持在300±10 ppm時，開始出現大鼠肺功能中AR增加、Cdyn及PEF降低；并且，大鼠肺組織出現明顯的肺氣腫樣表現，MLI和MAA明顯增加，其嚴重程度與肺功能下降程度相一致。

哺乳動物的肺泡上皮細胞由I型肺泡上皮細胞（AECI）和AECⅡ組成。AECⅡ不僅可分化為AECI，還可通過有絲分裂補充自身數量；同時AECⅡ還具有合成和分泌肺泡表面活性物質（SPs）、維持肺泡內外液體平衡、免疫調節(jié)等作用［3，8］。肺泡表面活性物質包括SPA、SPB、SPC和SPD，可由肺泡上皮中的AECⅡ合成和分泌。SPA和SPC是特異性地由AECⅡ分泌［9-10］，在減小肺泡表面張力中起重要作用。AECⅡ作為AECI的祖細胞，其嚴重受損或丟失將導致肺泡受損及肺泡修復障礙。本資料中，被動吸煙建立大鼠肺氣腫模型，大鼠肺組織中SPA和SPC mRNA和蛋白水平顯著下降，其下降程度與大鼠肺功能下降及肺組織肺氣腫樣改變程度相一致，提示AECⅡ存在一定程度的受損；進一步采用TUNEL和SPC雙重免疫熒光染色法，結果表明肺氣腫大鼠肺組織存在明顯的AECⅡ凋亡，進而導致大鼠肺功能下降并出現明顯的肺氣腫樣表現，最終出現不可逆肺損傷。但隨著煙霧中CO濃度的持續(xù)升高，大鼠肺功能、病理學改變及SPA和SPC 的表達不再惡化。作者認為可能的原因主要是：在被動吸煙過程中，隨著煙霧中CO濃度的升高，大鼠逐漸出現活動減少、精神狀態(tài)萎靡及呼吸頻率減慢，可能出現呼吸抑制，進而可能導致在高CO濃度時大鼠吸入的總顆粒物等有害物質并未明顯增多，最終出現肺功能不再繼續(xù)下降，病理學改變、SPA和SPC表達及AECⅡ凋亡不再惡化。

［1］ Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease． Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease． Seattle: GOLD,2016．

［2］ Burgel PR． Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease．Presse Med, 2009, 38(3):406-412．

［3］ Funk CJ, Manzer R, Miura TA, et al． Rat respiratory coronavirus infection: replication in airway and alveolar epithelial cells and the innate immune response． J Gen Virol, 2009, 90(Pt 12):2956-2964．

［4］ Hoffman AM, Ingenito EP． Alveolar epithelial stem and progenitor cells: emerging evidence for their role in lung regeneration． Curr Med Chem, 2012, 19(35):6003-6008．

［5］ Zheng H, Liu Y, Huang T, et al． Development and characterization of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)induced by sidestream cigarette smoke． Toxicol Lett, 2009,189(3):225-234．

［6］ Jiang H, Zhu Y, Xu H, et al． Activation of hypoxia-inducible factor-1alpha via nuclear factor-kappa B in rats with chronic obstructive pulmonary disease． Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2010, 42(7):483-488．

［7］ Macnee W． Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease．Clin Chest Med, 2007, 28(3):479-513．

［8］ 顧超, 嚴建平, 許武林, 等． 大鼠羊水間充質干細胞向Ⅱ型肺泡上皮細胞定向分化的體外實驗． 中華醫(yī)學雜志, 2014, 94(26):2050-2054．

［9］ Goldmann T, K?hler D, Schultz H, et al． On the significance of Surfactant Protein-A within the human lungs． Diagn Pathol, 2009,12:4-8．

［10］ Fujino N, Kubo H, Suzuki T, et al． Isolation of alveolar epithelial type II progenitor cells from adult human lungs． Lab Invest, 2011,91(3):363-378．

Objective To study the effects of type II alveolar epithelial cells apoptosis on pulmonary function decline in rats with emphysema.Methods Ninety SPF-grade male Sprague-Dawley rats were randomly sorted into six groups. A group was control group；rats form B，C，D，E and F groups were exposed to different passive smoking concentrations. Small animal lung function instrument was used to analyze the pulmonary function of each rat. Histological changes of rats were analyzed by H&E staining，and surfactant protein A（SPA）and SPC mRNA expressions were detected by Real-time PCR；SPA and SPC protein expressions were measured by immunohistochemical analysis. TUNEL/SPC immunofluorescence staining was used to analyze the apoptosis of type II alveolar epithelial cells（AECⅡ）. Results When the concentration of carbon monoxide（CO）in cigarette smoke was above 300±10 ppm，the airway resistance（AR）from rats was increased significantly，and the pulmonary dynamic compliance and peak expiratory flow were obviously decreased in lung function（P＜0.05）. Enlargement of airspace was observed and the amount of alveoli was decreased in the lung tissues，and the mean linear intercept and mean alveolar airspace from rats were significantly increased（P＜0.05）；SPA and SPC mRNA and protein expressions were markedly decreased（P＜0.05）；and the percentage of AECⅡ apoptosis was significantly increased（P＜0.05）.Conclusions AECⅡ apoptosis plays an important role in the development of emphysema in rats induced by passive smoking.

Passive smoking Pulmonary alveoli Epithelial cells Apoptosis Rats

國家自然科學基金資助項目（81000016）；浙江省嘉興市第一醫(yī)院院級課題資助項目（2016-YA-01）；浙江省嘉興市科技計劃項目（2017AY33010）

314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院（顧超 曹林峰 李娜）310053 浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（劉元順）311261 杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)骨傷科醫(yī)院（呂云）310014 浙江省人民醫(yī)院（李亞清）