基因芯片技術(shù)在結(jié)核性膿胸治療中的應(yīng)用

天津醫(yī)科大學(xué)（300070）韓東 孫大強

中國結(jié)核病年發(fā)病患者高達130萬，為世界第二大結(jié)核病發(fā)病國家，同時也是耐多藥結(jié)核病的高發(fā)病區(qū)[1]。結(jié)核性膿胸作為常見的肺外結(jié)核病，患病者眾多，病因多由結(jié)核性胸膜炎治療不徹底發(fā)展形成，就診時多已發(fā)展至包裹期，單純抗結(jié)核藥物或姑息引流治療效果較差，需要手術(shù)治療[2]。近年來，手術(shù)方式的進步使得患者治療效果顯著。但在臨床工作中，部分患者在術(shù)后規(guī)范抗結(jié)核治療的同時仍出現(xiàn)了復(fù)發(fā)甚至是反復(fù)多次復(fù)發(fā)的情況，林森林等[3]的研究發(fā)現(xiàn)在肺結(jié)核病復(fù)發(fā)患者中耐藥率較高，結(jié)核性膿胸復(fù)發(fā)病例中可能同樣存在較高的耐藥率，但傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)檢測方法結(jié)核菌檢出率低且耗時長，對于結(jié)核菌耐藥性的確定以及抗結(jié)核方案的調(diào)整作用甚微。近年來出現(xiàn)的基因芯片技術(shù)通過直接檢測結(jié)核菌DNA及耐利福平基因rpoB及耐異煙肼基因katG、inhA的突變位點，從而確定結(jié)核分枝桿菌及其耐藥情況，具有準確、靈敏、快速的特點，對于結(jié)核分支桿菌的診斷以及耐藥性的檢測已被廣泛認可[4]，本研究運用基因芯片技術(shù)對結(jié)核性膿胸患者的壞死物標本進行檢測、分析并指導(dǎo)臨床治療，取得了良好的臨床效果。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2015年3月～2016年4月我院收治的結(jié)核性膿胸患者60例，術(shù)前HRZE抗結(jié)核方案治療至少2周，術(shù)中徹底清理膿腔內(nèi)病灶及增厚纖維板，術(shù)后病理證實均為結(jié)核性，并繼續(xù)2HRZE/4HR方案抗結(jié)核治療。其中男性37例，女性23例，年齡最小16歲，最大58歲，平均27歲，其中12例為復(fù)發(fā)病例（單次復(fù)發(fā)8例，多次復(fù)發(fā)4例），術(shù)中留取壞死物標本，使用基因芯片法進行檢測。

1.2 實驗儀器與方法 檢測儀器采用德國Hain GT B48，檢測試劑為GenoType? MTBDRplus，試驗以DNA.STRIP?技術(shù)為基礎(chǔ)，對來自純培養(yǎng)物或病人肺部等結(jié)核菌陽性標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其耐利福平和/或異煙肼耐藥基因進行分子生物學(xué)檢測。通過檢測最有意義的rpoB基因突變（編碼RNA聚合酶β-亞單位）確定對利福平的耐藥性；檢測katG基因（編碼過氧化氫酶）確定對異煙肼的高水平耐藥，而檢測inhA基因的啟動子區(qū)（編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶）確定對異煙肼的低水平耐藥。

2 結(jié)果

2.1 壞死物結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果 60例標本中結(jié)核分枝桿菌陽性49例，陰性7例，結(jié)核分枝桿菌檢出陽性率為81.6%，而其中12例復(fù)發(fā)患者的檢測結(jié)果均為陽性，本組60例標本同時進行了抗酸染色涂片及基因芯片檢測，抗酸染色法陽性9例，陰性51例，結(jié)核分枝桿菌檢出陽性率15%，其中12例復(fù)發(fā)患者中陽性結(jié)果3例，陰性9例，對比結(jié)果見附表1和附表2。

2.2 結(jié)核分枝桿菌耐藥基因結(jié)果 對于結(jié)核分枝桿菌鑒定結(jié)果為陽性的病例，進一步進行耐藥性的分子藥敏檢測，對本組中陽性病例共49例，其中包括復(fù)發(fā)病例12例，進行耐藥基因檢測，結(jié)果顯示共發(fā)現(xiàn)耐藥菌株8例，耐藥率12.7%，而這8例耐藥菌株均來自復(fù)發(fā)病例中，其中5株為對INH及RPF均耐藥的多藥耐藥株，3株為對RFP耐藥株。

附表1 基因芯片法和抗酸染色法檢測結(jié)果比較

2.3 調(diào)整抗結(jié)核治療方案療效 對于耐藥基因檢測陽性的8例復(fù)發(fā)病例，隨機分為觀察組及對照組各4例，觀察組繼續(xù)之前2HRZE/4HR抗結(jié)核方案，治療組根據(jù)其耐藥情況，參照相關(guān)指南[5]調(diào)整抗結(jié)核方案，對于耐INH病例調(diào)整抗結(jié)核方案為2REZ/7RE，對于耐RFP病例調(diào)整抗結(jié)核方案為3HZSE/15EHZ，對于耐INH、RFP病例調(diào)整抗結(jié)核方案為3THOEZAK/18THOE，并進行了6個月～1年的隨訪，隨訪期間觀察組4例病例中，2例再次出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，而治療組4例病例中，未再出現(xiàn)復(fù)發(fā)的情況。

3 討論

近年來結(jié)核病疫情仍呈現(xiàn)上升趨勢，耐藥結(jié)核病也是造成這一結(jié)果的主要原因之一，對于這種耐藥結(jié)核病高發(fā)形勢，我國及世界范圍都在進行著相關(guān)的臨床研究，也提出了多種針對不同耐藥結(jié)核菌的抗結(jié)核方案及指南甚至個體化治療方案，但治療的前提需要細菌學(xué)及藥敏結(jié)果的支持。由于結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)對于培養(yǎng)環(huán)境的要求高，培養(yǎng)十分困難，總體陽性率低，而在各種標本中壞死物的培養(yǎng)陽性率相對更低，比較而言，痰液中的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量要高于壞死物，培養(yǎng)陽性率高于壞死物[6]，故之前相關(guān)研究[7][8]多針對耐多藥肺結(jié)核患者，研究結(jié)果表明治愈率雖然存在一定差異，但總體取得了一定的治療效果，而針對于壞死物的結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)報道較少，無法提供相應(yīng)的細菌學(xué)依據(jù)，所以在結(jié)核性膿胸病例中無法及時確定結(jié)核分支桿菌的耐藥情況，進行抗結(jié)核方案的調(diào)整及療效的觀察。

基因芯片技術(shù)近年來應(yīng)用廣泛，相關(guān)研究[9]通過對傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與基因芯片法進行對比顯示其擁有較高的敏感性以及準確性，而且較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所需時間明顯縮短，結(jié)核分枝桿菌的鑒定需要6～7小時，耐藥基因的檢測需要7～8小時即可完成分析，因此在結(jié)核分枝桿菌的檢測中應(yīng)用越來越廣泛，同時基因芯片方法可廣泛用于多種標本的檢測，包括痰液、膿汁、胸腹水、壞死物甚至尿液，劉申的研究顯示壞死物的結(jié)核分枝桿菌檢出陽性率位于各類標本前列，明顯高于痰液等標本，而本研究中基因芯片法檢測壞死物結(jié)核分枝桿菌陽性率高達86%，甚至高于其之前研究。這對結(jié)核性膿胸的耐藥性分析提供了良好的依據(jù)，具有十分重要的意義。

通過對本研究的結(jié)果進行分析總結(jié)可以發(fā)現(xiàn)，全部60例患者均病理證實為結(jié)核性，基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌陽性率達到88.3%，準確性及靈敏性較高，對比抗酸染色法優(yōu)勢明顯，12例復(fù)發(fā)患者均檢測為陽性，進一步行耐藥基因檢測，共發(fā)現(xiàn)耐藥菌株8例，并全部來源于復(fù)發(fā)病例中，其中3例為耐多藥菌株，進一步通過對照觀察，調(diào)整抗結(jié)核治療方案的治療組未再出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而沿用之前抗結(jié)核方案的觀察組中兩例患者痊愈，而仍有兩例患者再次出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況。

結(jié)核病復(fù)發(fā)與多種因素有關(guān)，對于結(jié)核性膿胸而言，包括感染耐藥結(jié)核分枝桿菌、服藥不規(guī)律甚至手術(shù)清理不徹底等，本研究結(jié)果顯示耐藥基因陽性病例全部來自復(fù)發(fā)患者中，復(fù)發(fā)患者中耐藥病例比例達到66.7%，說明耐藥與復(fù)發(fā)關(guān)系緊密，這也與整體結(jié)核病復(fù)發(fā)患者中高耐藥率情況相符。通過對照實驗發(fā)現(xiàn)對于此類耐藥患者，及時調(diào)整抗結(jié)核方案至關(guān)重要，治療組4例患者根據(jù)結(jié)核藥物耐藥情況，及時根據(jù)指南調(diào)整了抗結(jié)核治療方案，通過隨訪發(fā)現(xiàn)，4例患者恢復(fù)良好，均未在出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況，而觀察組仍出現(xiàn)了部分復(fù)發(fā)情況，可見對于耐藥基因檢測結(jié)果在抗結(jié)核治療中起到了重要的指導(dǎo)意義。

4 總結(jié)

本次研究進一步證實了基因芯片在結(jié)核分枝桿菌檢測中的敏感性及準確性，而耐藥基因檢測的結(jié)果，也表明耐藥結(jié)核分支桿菌對結(jié)核性膿胸復(fù)發(fā)所起的作用，同時通過對復(fù)發(fā)病例調(diào)整抗結(jié)核方案取得的良好臨床效果，在臨床工作中的作用值得肯定。