基于肝素和硫酸軟骨素的兩種納米顆粒改性表面對(duì)生物相容性影響的研究*

曹建軍，劉 濤，王國(guó)棟，湯瀟涵，龐利群，潘長(zhǎng)江

（1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 設(shè)備科，山東 濟(jì)南250031；2.淮陰工學(xué)院 江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安223003；3.淮安第一人民醫(yī)院 普外科，江蘇 淮安223300）

1 引 言

血管支架介入治療作為近年來(lái)一種新興的治療手段，已成為臨床治療冠心病的主要手段。目前，臨床常用的血管支架主要以藥物洗脫金屬支架為主，該支架能有效抑制術(shù)后內(nèi)膜增生和再狹窄的發(fā)生。然而，由于材料表面生物相容性不足，支架植入后可能引發(fā)表面凝血反應(yīng)及內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)晚期血栓及內(nèi)膜增生，危及患者生命［1］。對(duì)此，研究者普遍認(rèn)為通過(guò)材料表面改性，提高表面的抗凝能力并加速內(nèi)皮再生是解決術(shù)后并發(fā)癥的理想途徑。目前，通過(guò)在材料表面引入具有特殊功能的生物分子，構(gòu)建具有選擇性調(diào)控血管內(nèi)細(xì)胞行為的生物涂層已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

肝素是一種臨床常見(jiàn)的抗凝藥物，同時(shí)還能與多種活性蛋白結(jié)合以增強(qiáng)其功能，因此，被廣泛用于心血管材料表面改性研究。Yang等人［2］將肝素分子共價(jià)固定至沉積有聚烯丙胺薄膜的不銹鋼表面，發(fā)現(xiàn)改性后的表面抗凝性能得到顯著改善。Wang等人［3］利用肝素、纖連蛋白及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子之間的相互作用，將三種生物分子共固定至鈦基材料表面，改善材料表面抗凝能力和促內(nèi)皮生長(zhǎng)能力。但也有研究表明，肝素可阻斷細(xì)胞中部分正電性信號(hào)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞的粘附、增殖及遷移行為，當(dāng)材料表面肝素密度過(guò)高時(shí)，將會(huì)抑制表面內(nèi)皮化進(jìn)程［4］。

硫酸軟骨素是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺聚糖，其分子結(jié)構(gòu)與肝素相近，也能與多種基質(zhì)蛋白和細(xì)胞因子相互作用，增強(qiáng)其活性［5］。硫酸軟骨素抗凝活性遠(yuǎn)低于肝素，但具有許多肝素所不具備的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、加速血管損傷修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)等［6］，因此，在心血管材料表面改性領(lǐng)域應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

為了研究?jī)煞N分子改性的表面其生物相容性情況，本研究分別將高電負(fù)性的肝素和硫酸軟骨素與正電性的多聚賴(lài)氨酸發(fā)生反應(yīng)，形成肝素/多聚賴(lài)氨酸和硫酸軟骨素/多聚賴(lài)氨酸納米顆粒。其次，在316 L不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，利用多巴胺自氧化過(guò)程中可與聚賴(lài)氨酸發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的特性，將納米顆粒固定至材料表面。本研究通過(guò)系列體外表征和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩種納米顆粒改性后表面生物相容性的變化情況進(jìn)行了研究分析。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 試劑

多巴胺（DM，sigma），多聚賴(lài)氨酸（PLL，分子量150～300 kDa，sigma），低分子量肝素鈉（分子量～5 kDa，sigma），低分子量硫酸軟骨素 （分子量8～12 kDa，sigma）。

2.2 不銹鋼表面沉積聚多巴胺層

316L不銹鋼片（Φ10 mm）經(jīng)打磨拋光后，依次用丙酮、無(wú)水乙醇及雙蒸水超聲清洗各三次，每次5 min。將樣品浸入2 mg/mL的多巴胺Tris（pH 8.5）溶液中，20℃下靜置反應(yīng)12 h，然后用雙蒸水超聲清洗樣品三次并烘干，標(biāo)記為1層DM層。重復(fù)該步驟，共沉積3層DM層。

2.3 兩種納米顆粒的制備及固定

配置濃度為0.5 mg/mL的PLL和濃度為5 mg/mL的肝素溶液和硫酸軟骨素溶液，溶劑均為PBS（0.067 M，pH 7.0）。在室溫及超聲條件下，將肝素溶液和硫酸軟骨素溶液分別等體積滴加至PLL溶液中，然后持續(xù)超聲3 min，制備出肝素/PLL和硫酸軟骨素/PLL納米顆粒懸液。

將沉積DM層的樣品浸泡入納米顆粒懸液中，20℃振蕩反應(yīng)12 h。樣品取出后用雙蒸水清洗并冷凍干燥。

2.4 納米顆粒及納米顆粒改性表面的表征

通過(guò)Zeta電位儀對(duì)兩種納米顆粒的尺寸、Zeta電位及均勻性進(jìn)行測(cè)定。利用FTIR檢測(cè)兩種顆粒改性后樣品表面化學(xué)成分的變化。通過(guò)視頻接觸角（DSA 100，KRUSS）對(duì)納米顆粒固定前后樣品表面親水性的變化進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 納米顆粒改性表面生物分子的定量表征

通過(guò)酸性橙法檢測(cè)納米顆粒改性后，樣品表面氨基密度。通過(guò)甲苯胺藍(lán)法檢測(cè)樣品表面肝素和硫酸軟骨素密度。具體方法參考文獻(xiàn)［4］。

2.6 血液相容性評(píng)價(jià)

2.6.1 體外血小板粘附實(shí)驗(yàn) 將新鮮人血（離體24 h內(nèi)）以1 500 rpm離心15 min，得上清富血小板血漿（PRP）。向樣品表面滴加 PRP，50μL/樣，37℃條件下孵育2 h后，將樣品浸入2.5%的戊二醛溶液中固定過(guò)夜。樣品固定完成后，用羅丹明123對(duì)粘附的血小板進(jìn)行熒光染色。

2.6.2 活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）檢測(cè) 將新鮮人血以3 000 rpm離心15 min，得上清貧血小板血漿（PPP）。將樣品浸入 PPP中，500μL/樣，37℃孵育30 min。然后將待測(cè)血漿轉(zhuǎn)移入檢測(cè)管，利用全自動(dòng)凝血儀（ACL-200）進(jìn)行APTT檢測(cè)。

2.6.3纖維蛋白原激活檢測(cè) 向樣品表面滴加PPP，50μL/樣，37℃條件下孵育1 h后，用生理鹽水漂洗樣品后將樣品浸入1%BSA溶液中，37℃條件下孵育1 h。然后，向樣品表面滴加鼠抗人纖維蛋白原γ鏈單克隆抗體，50μL/樣，37℃條件下孵育30 min后，向樣品表面滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，50μL/樣，37℃條件下孵育30 min后，通過(guò)TMB試劑對(duì)表面吸附的IgG抗體進(jìn)行顯色，并檢測(cè)顯色液在450 nm下的吸光度值。

2.7 體外內(nèi)皮細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

使用胰蛋白酶將處于融匯狀態(tài)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞消化，并用含10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成密度為1×105的細(xì)胞懸液。將改性后的樣品浸泡在上述細(xì)胞懸液中，1 mL/樣，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)1～3 d。其中，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)前4 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和10%CCK-8試劑的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，一方面吸取細(xì)胞培養(yǎng)液于96孔板內(nèi)，在450 nm下檢測(cè)其吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性；另一方面將樣品用2.5%的戊二醛溶液固定，然后用羅丹明123和DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有檢測(cè)均進(jìn)行至少三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)SPSS11.5軟件，采用最小顯著差法（LSD）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性水平（P）小于0.05為有顯著性差異，標(biāo)記為“*”。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米顆粒尺寸及zeta電位值

表1為兩種納米顆粒的尺寸、Zeta電位和多分散系數(shù)（PDI）檢測(cè)結(jié)果。由結(jié)果可知，肝素納米顆粒尺寸為323±19 nm，Zeta電位為 -27.5±2.2 mV，而硫酸軟骨素納米顆粒則呈現(xiàn)出相對(duì)較低的Zeta電位值（-22.8±1.5 mV）和較高的顆粒尺寸（357±22 nm）。盡管肝素和硫酸軟骨素的反應(yīng)濃度相同，但肝素的電負(fù)性要強(qiáng)于硫酸軟骨素，而兩種納米顆粒的形成主要依賴(lài)于分子間的靜電交互作用，因此，硫酸軟骨素電負(fù)性較弱可能使得顆粒致密性較低，尺寸較大。此外，兩種顆粒PDI值無(wú)顯著差異，且均遠(yuǎn)小于0.2，這表明兩類(lèi)顆粒均具有較好的均勻性。

表1 兩種納米顆粒的粒徑、PDI及Zeta電位值Table 1 Mean size，PDI and Zeta potential of two kinds of nanoparticle

3.2 紅外檢測(cè)結(jié)果（FTIR）

由圖1可見(jiàn)，沉積 DM的樣品表面在1 600 cm-1和1 502 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)的特征吸收峰。與DM相比，兩種納米顆粒改性后，在1 666 cm-1和1 550cm-1處出現(xiàn)了酰胺I帶C＝O伸縮振動(dòng)峰以及酰胺II帶的C-N伸縮振動(dòng)峰和N-H彎曲振動(dòng)峰，這主要來(lái)自于PLL的酰胺鍵。此外，在1 230 cm-1處出現(xiàn)了肝素和硫酸軟骨素分子特有的C-O-S和S＝O振動(dòng)峰，在1 062 cm-1處出現(xiàn)了肝素和硫酸軟骨素分子中的C-O-C伸縮振動(dòng)峰。上述結(jié)果表明，兩種納米顆粒均成功固定到DM表面，但由于肝素和硫酸軟骨素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上高度一致，因此紅外結(jié)果并未存在明顯區(qū)別。

圖1 納米顆粒改性前后樣品表面的紅外光譜（A）聚多巴胺涂層DM；（B）肝素納米顆粒改性表面DM-NPH；（C）硫酸軟骨素納米顆粒改性表面DM-NPCSFig 1 The FTIR spectra of（A）poly-dopamine coating，（B）heparin nanoparticle modified surface and（C）chondroitin sulfate nanoparticle modified surface

3.3 AFM結(jié)果

圖2為納米顆粒固定前后樣品表面AFM形貌檢測(cè)結(jié)果。由圖可看出，沉積DM的樣品表面相對(duì)平滑，而固定NPH和NPCS后，樣品表面明顯出現(xiàn)了大量顆粒狀凸起，其尺寸在300～400 nm，與粒徑檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）接近。這表明兩類(lèi)納米顆粒均成功固定于多巴胺涂層表面，此外，表面的顆粒分散均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象出現(xiàn)。這主要是由于兩類(lèi)顆粒的Zeta電位值較高（見(jiàn)表1），顆粒間存在較強(qiáng)的電荷排斥。

3.4 水接觸角

圖3為兩種納米顆粒在DM涂覆的316L不銹鋼表面固定后，表面親水性的變化情況。由圖可知，與316L-SS和SS-DM相比，固定兩種納米顆粒后，表面水接觸角大幅降低。材料表面的親水性與表面化學(xué)成分密切相關(guān)，納米顆粒中的肝素、硫酸軟骨素及PLL分子中均含有大量的親水性基團(tuán)，如-COOH、-NH2、-SO3等，因此可提高表面親水性。

圖2 納米顆粒改性前后樣品表面的AFM檢測(cè)結(jié)果Fig 2 AFM images of different NPs modified surfaces

圖3 樣品處理前后表面的水接觸角（n＝3，*P＜0.05）Fig 3 The water contact angle data of different sample surfaces（n＝3，*P＜0.05）

3.5 生物分子定量檢測(cè)結(jié)果

圖4為納米顆粒固定前后表面肝素、硫酸軟骨素及胺基定量檢測(cè)結(jié)果，因DM表面不含肝素，因此，將其甲苯胺藍(lán)檢測(cè)的吸光度作為背景扣除，酸性橙結(jié)果顯示，多巴胺表面僅含有少量胺基。肝素納米顆粒修飾的表面胺基暴露密度為7.6±1.3 nmol/cm2，肝素含量為13.3±3.7μg/cm2，而硫酸軟骨素納米顆粒表面胺基密度為9.4±1.7 nmol/cm2，硫酸軟骨素密度為17.2±3.1μg/cm2。兩類(lèi)納米顆粒固定密度有差異的原因認(rèn)為主要與顆粒表面胺基含量有關(guān)，由于顆粒是通過(guò)多巴胺與聚賴(lài)氨酸的氨基反應(yīng)而固定至表面，因此，顆粒表面胺基密度越高，顆粒固定密度就越大。

3.6 體外血小板粘附結(jié)果

圖5為體外血小板粘附結(jié)果。由圖可知，不銹鋼表面出現(xiàn)大量的血小板粘附，且個(gè)別區(qū)域已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)血小板團(tuán)聚現(xiàn)象。當(dāng)表面沉積DM涂層后，血小板團(tuán)聚現(xiàn)象更為明顯。而肝素納米顆粒（NPH）和硫酸軟骨素納米顆粒（NPCS）修飾的表面血小板粘附數(shù)量均顯著降低，且粘附的血小板形態(tài)均勻，未出現(xiàn)團(tuán)聚或激活現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，多巴胺涂層會(huì)加劇血小板的激活，而兩種納米顆粒改性的表面則具有良好的抑制血小板粘附和激活的作用。

圖4 樣品表面生物分子定量檢測(cè)結(jié)果（n＝6）Fig 4 Biomolecules quantitative characterization of different sample surfaces（n＝6）

圖5 血小板在樣品表面粘附2 h后羅丹明熒光染色結(jié)果Fig 5 Rhodamine fluorescence staining of adherent platelets after 2 h incubation

3.7 APTT及纖維蛋白原激活結(jié)果

圖6為接枝兩種納米顆粒的樣品表面對(duì)APTT凝血時(shí)間和纖維蛋白原激活的影響結(jié)果。由圖6A可知，不銹鋼材料和多巴胺涂層并未對(duì)凝血時(shí)間產(chǎn)生明顯影響，而接枝肝素納米顆粒的樣品表面，其凝血時(shí)間顯著上升，而硫酸軟骨素納米顆粒改性的表面，APTT值明顯低于肝素納米顆粒表面。此外，由圖6B可知，與SS和DM相比，肝素納米顆粒和硫酸軟骨素納米顆粒改性的表面纖維蛋白原的激活程度均顯著降低，且兩類(lèi)納米顆粒表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)囊种评w維蛋白原激活的效果。

綜上可知，兩種顆粒對(duì)凝血系統(tǒng)的影響存在差異。肝素主要通過(guò)抑制凝血酶活性來(lái)抑制凝血，而硫酸軟骨素主要是通過(guò)抑制纖維蛋白原激活來(lái)實(shí)現(xiàn)抗凝，但兩種納米顆粒改性表面均表現(xiàn)出較好的抑制血小板粘附和激活的效果。

圖6 不同樣品表面對(duì)（A）APTT凝血時(shí)間和（B）纖維蛋白原激活的影響Fig 6 The influence of different surface on（A）APTT value and（B）fibrinogen conformation change

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞在樣品表面粘附1 d和3 d后羅丹明和DAPI的雙染結(jié)果Fig 7 Rhodamine and DAPI double-fluorescence staining of endothelial cells after 1 and 3 days culture

3.8 體外內(nèi)皮細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖7為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)1 d和3 d后的熒光染色結(jié)果。與SS和DM表面相比，肝素納米顆粒改性的樣品表面細(xì)胞粘附密度明顯下降，且細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮形態(tài)，而硫酸軟骨素納米顆粒改性的樣品表面，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出正常的鋪展形態(tài)，且細(xì)胞粘附數(shù)量和鋪展面積明顯更優(yōu)。圖8進(jìn)一步證明硫酸軟骨素納米顆粒改性表面具有更高的細(xì)胞增殖活性。綜上，肝素納米顆粒改性表面不利于內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，而硫酸軟骨素納米顆粒改性表面內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，這說(shuō)明硫酸軟骨素的內(nèi)皮細(xì)胞相容性?xún)?yōu)于肝素。

圖8 細(xì)胞在不同樣品表面培養(yǎng)1 d和3 d后，細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果Fig 8 Cell proliferation activity assay after 1 and 3 days culture

4 結(jié)論

綜上，肝素和硫酸軟骨素均能與PLL自發(fā)組裝形成納米顆粒，兩種顆粒的尺寸接近，具有良好的穩(wěn)定性和均勻性；材料學(xué)表征結(jié)果表明，兩種納米顆粒均能成功固定在DM涂覆的316L不銹鋼表面，固定后表面理化性質(zhì)特征相似，且顆粒固定密度相近；兩種納米顆粒均能有效抑制血小板的粘附和聚集，但兩者抗凝的機(jī)理存在一定的差異。此外，因肝素分子的高負(fù)電性和特殊的分子構(gòu)象，會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和增殖行為產(chǎn)生一定的阻斷和抑制，而硫酸軟骨素雖然化學(xué)組成與肝素十分相似，但有利于促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。