半互穿網(wǎng)絡(luò)淀粉基止血海綿的制備及性能研究*

郈秀菊，朱愛(ài)臣，王軍，孫淑娜，王曉晨，王傳棟△

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101；2.山東省中醫(yī)院，濟(jì)南 250011）

1 引 言

在外科手術(shù)和處理體表外傷時(shí)，血液的大量流失可能會(huì)直接危及到生命，同時(shí)血液是天然的微生物培養(yǎng)基，創(chuàng)面出血或滲血都會(huì)增加感染的幾率［1-2］。因此，良好的止血技術(shù)和使用快速有效的止血材料成為外科手術(shù)成功的關(guān)鍵。

近年來(lái)，天然高分子多糖因具有良好的生物相容性和可吸收性及凝血作用，被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面止血材料［3-6］。選擇植物來(lái)源的羧甲基淀粉鈉為主原料，能避免動(dòng)物源性材料雜蛋白引起的不良反應(yīng)［7-8］；通過(guò)采用綠色高效的低溫等離子體技術(shù)［9-11］，活性引發(fā)兩親性聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段聚合物接枝淀粉，與線性植物多糖羥乙基纖維素通過(guò)氫鍵作用［12-13］進(jìn)行穿插后，經(jīng)冷凍誘導(dǎo)相分離法制備半互穿網(wǎng)絡(luò)淀粉基止血海綿。制備過(guò)程中有效避免使用環(huán)氧氯丙烷和醛類等毒性交聯(lián)劑［14-15］，具有良好的生物相容性及生物降解性。經(jīng)過(guò)動(dòng)物體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)等生物學(xué)性能測(cè)試，結(jié)果表明該敷料能快速、安全、有效地應(yīng)用于外科手術(shù)止血。

2 材料與方法

2.1 原料試劑

羧甲基淀粉鈉（CMS），醫(yī)用級(jí)，華唯纖維素有限公司；泊洛沙姆188（P188），德國(guó)BASF公司；羥乙基纖維素（HEC），醫(yī)用級(jí)，粘度 6 000 MPa·s，鄭州鼎馳科技有限公司；吐溫60（T60），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙三醇、氫氧化鈉，均為分析純，天津市富宇化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；明膠海綿，南昌市祥恩堂醫(yī)療器械有限公司。

2.2 儀器設(shè)備

真空干燥箱，ZKXF型，上海樹立儀器儀表有限公司；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；等離子處理機(jī)，PLS-CX01，中山市普雷斯等離子科技有限公司；紅外光譜儀，VERTEX70型，德國(guó) Bruker公司；核磁共振波譜儀，AVAHCE III HD型，德國(guó)Bruker公司；掃描電子顯微鏡，SUPRA 55型，德國(guó)蔡司Zeiss。

2.3 半互穿網(wǎng)絡(luò)淀粉基止血敷料的制備

按比例稱取CMS和蒸餾水經(jīng)磁力攪拌，配成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，模具內(nèi)流延后，真空干燥得到CMS膜，進(jìn)行等離子體處理。等離子體處理的條件為：選擇氬（Ar）氣氛，控制 Ar流量為500 L/min，CMS膜和電極之間的距離為7 mm，處理功率60 W，放電頻率10 kHz。經(jīng)Ar等離子體處理15 min后的CMS膜在空氣中暴露15 min，投入盛有一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的P188水溶液中。在4℃冰水浴中，通氮排氧條件下進(jìn)行接枝聚合反應(yīng)，接枝后的CMS膜稱為CMS-P188膜。用蒸餾水沖洗CMS-P188膜除去未反應(yīng)的P188，然后室溫下真空干燥，最后粉碎成粒徑為80～100目的CMS-P188粉末。

稱取CMS-P188粉末8.0 g，置入250 mL燒杯，加去離子水72 mL，磁力攪拌20 min，使其充分溶解，為A液。稱取HEC粉末1.6 g，置入50 mL燒杯，加去離子水18.4 mL，磁力攪拌30 min，使其充分溶解，為B液。

采用超聲輔助制備氫鍵作用半互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物。將上述A、B兩種溶液分別置入裝有回流裝置的250 mL的三口瓶中，再加無(wú)水乙醇50 mL。通氮?dú)獬檎婵蘸螅糜?7℃的空氣振蕩浴中，100 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩14 h，然后用探頭超聲儀100 W功率下超聲1 h。為防止液體在超聲中變熱采用間歇脈沖工作方式，脈沖時(shí)間為3 s，間歇時(shí)間為5 s，整個(gè)超聲操作在室溫中進(jìn)行。用0.4 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為4.5～7.0。用無(wú)水乙醇和去離子水交互洗滌產(chǎn)品3次，旋蒸除去溶劑后真空干燥，得到終產(chǎn)物半互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物CMS-P188-HEC粉末 9.2 g。

取CMS-P188-HEC粉末8.0 g，丙三醇3 g，T60 1 g和蒸餾水88 g，置入燒杯中，混合攪拌0.5～1 h。高速發(fā)泡后，低溫冷凍干燥，制得半互穿網(wǎng)絡(luò)淀粉基止血海綿（semi-interpenetrating networks starch hemostatic dressing，SIN-SHD）。

2.4 紅外光譜儀測(cè)試

將羧甲基淀粉鈉接枝泊洛沙姆P188前后的樣品干燥后，與KBr混合后壓片制樣，用VERTEX70型紅外光譜儀進(jìn)行掃描，掃描范圍為400～4 000 cm-1，繪出紅外光譜圖。

2.5 核磁共振波譜儀測(cè)試

將羧甲基淀粉鈉接枝泊洛沙姆P188前后的樣品在Bruker DRX-400NMR波譜儀上進(jìn)行13CNMR測(cè)試分析，溶劑是D2O（氘代水）。

2.6 吸水率測(cè)試

按照標(biāo)準(zhǔn) YY/T 0471.1-2004［16］進(jìn)行測(cè)試，稱取SIN-SHD 0.8 g，置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，稱重m1，加入適量去離子水，待敷料吸水飽和后，倒出多余水分，稱重m2，根據(jù)公式（1）計(jì)算吸水率（A）：

2.7 膨脹體積測(cè)試

培養(yǎng)皿中加人預(yù)熱至（37±1）℃的去離子水［16］，將 SIN-SHD裁成5 cm×1.5 cm×0.5 cm的塊，放入水中至吸收完全，呈飽和狀態(tài)，用鑷子夾持樣品一角或一端，懸垂30 s后，平鋪于干燥的培養(yǎng)皿中，以游標(biāo)卡尺測(cè)量測(cè)試樣品的尺寸（長(zhǎng)×寬×高），測(cè)試三次取平均值，計(jì)算出膨脹體積V。體積膨脹率E按公式（2）計(jì)算：

2.8 掃描電鏡測(cè)試

取CMS-P188-HEC，混合其他輔料，高速發(fā)泡后，低溫冷凍干燥制備SIN-SHD多孔結(jié)構(gòu)的海綿狀聚合物，原料CMS和HEC采用相應(yīng)的處理過(guò)程制備的海綿表面真空鍍金后，進(jìn)行掃描電鏡測(cè)試，觀察兩者的表面形貌。

2.9 兔肝腎止血實(shí)驗(yàn)

選取20只2 500～3 000 g健康新西蘭兔，由山東省藥學(xué)科學(xué)院生物評(píng)價(jià)中心提供，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，每組10只，分別是SIN-SHD組和明膠海綿組。麻醉后開腹，暴露肝臟和腎臟，分別在左肝外葉劃開2 cm×0.5 cm的切口，在右腎表面劃開1 cm×0.5 cm的切口，迅速覆蓋出血部位，輕壓30 s，并同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄止血時(shí)間，并用濾紙吸取流出的血量，稱量濾紙吸血前后的質(zhì)量，計(jì)算出血量，并觀察敷料與創(chuàng)面的粘合情況。

2.10 大鼠體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16886.6-1997［17］的要求，選取 6只SD大鼠，由山東省藥學(xué)科學(xué)院生物評(píng)價(jià)中心提供，雌雄各半，分成3組，分別植入1周，2周，4周。將本研究制備的SIN-SHD植入大鼠左右臀肌，分別同時(shí)沿肌纖維長(zhǎng)軸平行直接包埋。用低倍放大鏡檢查切下的植入部位組織，記錄觀察到的組織反應(yīng)的特性和程度。并且分別切取臀肌植入部位組織標(biāo)本，包括植入物及其周圍足夠多的未受到影響的組織。組織標(biāo)本經(jīng)中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋、石蠟切片、HE和剛果紅染色后，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與討論

3.1 配方篩選

分別配制質(zhì)量濃度為3%、5%、8%、13%和15%的CMS水溶液，流延真空干燥成膜，經(jīng)低溫等離子體處理，在冰水浴中接枝PEO-PPO-PEO聚合物（P188），P188水溶液的質(zhì)量濃度分別為1%、3%和4%，之后流延真空干燥制成CMS-P188膜。測(cè)試不同溶液濃度制備的CMS-P188膜的吸水率和膨脹率，結(jié)果見(jiàn)表1，最優(yōu)配方為：8%的CMS溶液接枝3%的P188。

3.2 成型工藝研究

在制備SIN-SHD的冷凍干燥工藝中，冷凍誘導(dǎo)相分離溫度分別選擇-18、-35、-55和-60℃，冷凍誘導(dǎo)相分離時(shí)間分別為5、10、15和20 h，觀察SIN-SHD的狀態(tài)和吸水率，結(jié)果見(jiàn)表2，最優(yōu)工藝條件為：溫度為-55℃、時(shí)間為15 h。

表1 CMS-P188膜的吸水率和膨脹率Table 1 The water absorption and expansion rate of the CMS-P188 film

表2 冷凍誘導(dǎo)相分離條件對(duì)SIN-SHD性能的影響Table 2 The effects of the freeze drying conditions on the SIN-SHD

3.3 紅外光譜分析

分別將羧甲基淀粉和羧甲基淀粉接枝P188后的樣品作紅外光譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，圖譜a中，1618 cm-1處的峰為羧甲基淀粉中C＝O雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，而圖譜b中，1618 cm-1處的峰的強(qiáng)度明顯減弱，由此可知，羧甲基淀粉中的C＝O雙鍵已接枝P188，使羧甲基淀粉中C＝O雙鍵的伸縮振動(dòng)減弱，可初步證明羧甲基淀粉已接枝了P188。

3.4 核磁譜圖分析

將羧甲基淀粉鈉接枝泊洛沙姆P188前后的樣品在Bruker DRX-400 NMR波譜儀上進(jìn)行13CNMR表征，溶劑是D2O（氘代水），結(jié)果見(jiàn)圖2。羧甲基淀粉鈉的羧基碳的化學(xué)位移由原來(lái)182.325 ppm向低場(chǎng)移動(dòng)為177.86 ppm，說(shuō)明羧甲基淀粉鈉的羧酸接枝成羧酸酯，羧甲基淀粉鈉接枝上了泊洛沙姆P188。

圖1 羧甲基淀粉（a）和羧甲基淀粉接枝P188（b）的紅外光譜圖Fig 1 The infrared spectrogram of CMS（a）and CMS-P188（b）

圖2 羧甲基淀粉（a）和羧甲基淀粉接枝P188（b）的核磁共振譜圖Fig 2 The13 C-NMR spectrum of CMS（a）and CMS-P188（b）

3.5 掃描電鏡測(cè)試

原料 CMS和 HEC（a）和 SIN-SHD（b）的掃描電鏡照片（放大200倍）見(jiàn)圖3。由圖3可知，本研究制備的SIN-SHD形成了相互貫通的網(wǎng)絡(luò)骨架多孔形貌，進(jìn)一步為SIN-SHD止血海綿快速吸液提供了基礎(chǔ)。

圖3 原料CMS和HEC（a）和SIN-SHD（b）的掃描電鏡照片F(xiàn)ig 3 The SEM test of CMS（a）and SIN-SHD（b）

3.6 兔肝腎止血實(shí)驗(yàn)

在兔肝臟和腎臟手術(shù)部位，用刀片切開后均有大量出血現(xiàn)象，用本研究制備的SIN-SHD和明膠海綿迅速覆蓋住傷口創(chuàng)面，觀察敷料與創(chuàng)面的粘合情況，并記錄止血時(shí)間和出血量，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。由研究結(jié)果可知SIN-SHD可在創(chuàng)面形成一層凝膠狀膜，并且SIN-SHD的止血時(shí)間短，出血量少，可快速有效的止血。由此可知本研究制備的SINSHD是一種快速有效的止血敷料。

表3 兔肝腎止血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of rabbit liver and kidney bleeding experiments

3.7 大鼠體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)

在植入期內(nèi)適當(dāng)?shù)拈g隔觀察每只動(dòng)物，均無(wú)任何異?，F(xiàn)象。試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，采用超劑量麻醉將動(dòng)物無(wú)痛處死，切取植入部位組織標(biāo)本，分別通過(guò)低倍放大鏡和組織病理學(xué)試驗(yàn)評(píng)價(jià)生物學(xué)反應(yīng)。低倍放大鏡觀察結(jié)果為植入部位肌肉包膜全部完好。HE染色結(jié)果顯示：植入部位及周圍肌肉組織肌纖維均排列整齊、核清晰，未見(jiàn)壞死及肉芽腫形成，間質(zhì)無(wú)纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。剛果紅染色結(jié)果顯示4周后植入部位無(wú)殘存材料碎片，4周后的組織切片圖見(jiàn)圖4。

圖4 組織切片圖Fig 4 The figures of the tissue section

4 結(jié)論

本研究采用低溫等離子體技術(shù)和冷凍干燥工藝制備了半互穿網(wǎng)絡(luò)淀粉基止血海綿。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)配方為8%的CMS溶液接枝3%的P188，冷凍干燥工藝為冷凍誘導(dǎo)相分離溫度為-55℃，冷凍誘導(dǎo)相分離時(shí)間為15 h，采用此工藝制備的淀粉基止血海綿具有良好的親水吸水性、快速有效的止血效果和良好的生物降解性。