醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)新方法的研究
——大鼠胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)

范春光，侯麗，展榮凱，許晶，朱福余

（山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250101）

1 引 言

在對醫(yī)療器械進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)的過程中，有很多長期接觸人體的產(chǎn)品須進(jìn)行重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)以評估其產(chǎn)生全身毒性的可能性［1-2］。在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)，首先要選擇一種臨床相關(guān)性最好的接觸途徑［2-3］。在這些產(chǎn)品中，有很多是植入類器械，所以選擇植入途徑是適宜的。然而，有些植入器械由于體積過大等原因很難植入動物體內(nèi)；另外，對有些產(chǎn)品來說，植入途徑也不是臨床相關(guān)性最好的接觸途徑。這時(shí)一般考慮制備試驗(yàn)樣品浸提液進(jìn)行試驗(yàn)［4］。但是，一直以來，由于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對非極性浸提液的試驗(yàn)條件如注射體積、注射頻率等未作明確規(guī)定，導(dǎo)致試驗(yàn)人員無標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)方法可以參考。以往制備浸提液進(jìn)行的重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)一般只檢測了試驗(yàn)樣品生理鹽水浸提液，而未對非極性浸提液進(jìn)行檢測。這樣，對試驗(yàn)樣品重復(fù)接觸全身毒性的評價(jià)就不夠全面。針對以上問題，本研究設(shè)計(jì)了胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法，設(shè)定了相應(yīng)的注射劑量體積及頻率等條件，靜脈注射極性浸提介質(zhì)（生理鹽水）、腹腔注射非極性浸提介質(zhì)（玉米油）于同一只大鼠體內(nèi)，14 d后，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷此方法能否引起大鼠產(chǎn)生不良反應(yīng)，進(jìn)而分析此方法能否應(yīng)用于醫(yī)療器械大鼠重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)。

2 試驗(yàn)材料

2.1 試劑

生理鹽水：山東華魯制藥有限公司，500 mL，批號：0105062207；玉米油：sigma，C8267-2.5L，lot＃MKBV2080V：戊巴比妥鈉：Ruitaibio，批號：2015-04-18。

2.2 器具和儀器設(shè)備

注射器：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，5 mL，批號：1404；采血管：上?？迫A檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，5 mL無添加劑，批號：20150120；2 mL EDTA2K抗凝，批號：20150619；2 mL檸檬酸鈉抗凝，批號：20150616；全自動血液分析儀：SYSMEX，型號：XT-2000i；全自動生化分析儀：BECKMAN，型號：AUA680；自動血凝分析儀：SYSMEX，型號：CA-7000；系統(tǒng)顯微鏡：奧林巴斯，型號：BX51-32H01。

2.3 試驗(yàn)動物

SD大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。60只，雌、雄各半，6～9周，適應(yīng)期7 d。體重范圍：試驗(yàn)開始時(shí)雌性為177～209 g，雄性為219～250 g。標(biāo)記方法：苦味酸涂抹染色法。

3 試驗(yàn)方法

3.1 動物選擇及隨機(jī)分組

從檢疫后SD大鼠中挑選60只。稱重后隨機(jī)分組并染色編號。雌雄各10只為一組，共3組，分別為對照組、試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2。

3.2 試驗(yàn)液接觸

為同時(shí)觀察試驗(yàn)操作對大鼠的影響，對照組不做任何處理；試驗(yàn)組1按照5 mL/kg·BW的劑量于試驗(yàn)開始第1、4、7、10、13 d腹腔注射玉米油；試驗(yàn)組2按照10 mL/kg·BW的劑量連續(xù)14 d尾靜脈注射生理鹽水，同時(shí)按照5 mL/kg·BW的劑量于試驗(yàn)開始第1、4、7、10、13 d腹腔注射玉米油。見表1、表 2。

表1 組別與對應(yīng)的處理方法Table 1 Groups and the treatments

表2 處理?xiàng)l件Table 2 Treatments parameters

3.3 稱量體重

試驗(yàn)期間每周稱重1次。

3.4 臨床觀察

每天對大鼠進(jìn)行臨床觀察。

3.5 血液收集

解剖前一天大鼠稱重并禁食12～18 h。解剖前，按照40 mg/kg·BW的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠。腹主動脈收集血液進(jìn)行臨床病理檢測。檢測指標(biāo)及對應(yīng)英文縮寫見表3。

表3 臨床病理檢測指標(biāo)及對應(yīng)英文縮寫Table 3 parameters of clinical examination and english abbreviations

3.6 大體檢查

大鼠取血后實(shí)施安樂死，隨即對每只大鼠進(jìn)行大體檢查；將所有大鼠的卵巢/睪丸、子宮/附睪、脾、肝、腎上腺、腎、胸腺、心和腦等去除鄰近組織并及時(shí)稱量其濕重；取所有大鼠的卵巢/睪丸、子宮/附睪、脾、胃、腸、胰、肝、腎上腺、腎、胸腺、心、肺、甲狀腺和腦等器官作為樣本及時(shí)固定在10%福爾馬林溶液中以備后續(xù)處理。

3.7 組織病理學(xué)檢查

將固定后的大鼠器官制成切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

3.8 統(tǒng)計(jì)與分析

將試驗(yàn)組和對照組大鼠的以上各項(xiàng)指標(biāo)分別進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（SPSS17.0）。如果P＜0.05則認(rèn)為兩組之間存在顯著性差異。對于試驗(yàn)中出現(xiàn)的差異結(jié)合試驗(yàn)各項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法對大鼠一般狀態(tài)及體重?cái)?shù)據(jù)的影響

在試驗(yàn)過程，各組大鼠均未出現(xiàn)明顯的異常臨床表現(xiàn)。雙途徑組雄性大鼠第2周平均體重顯著性低于對照組雄性大鼠（P＜0.05），但試驗(yàn)組體重均大幅增長，結(jié)合其它觀察指標(biāo)綜合分析認(rèn)為差異沒有體現(xiàn)毒性特征，僅體現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)見表4、表5。

表4 試驗(yàn)期間雌性大鼠各組體重?cái)?shù)據(jù)（±SD）Table 4 Weight data of each female group（±SD）

表4 試驗(yàn)期間雌性大鼠各組體重?cái)?shù)據(jù)（±SD）Table 4 Weight data of each female group（±SD）

體重（g ）周次對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）0 195.6±10.9 194.4±9.2 193.7±9.7 1 210.8±11.7 212.0±11.8 210.8±8.7 2 226.6±16.6 236.3±12.3 237.7±13.4

表5 試驗(yàn)期間雄性大鼠各組體重?cái)?shù)據(jù)（±SD）Table 5 Weight data of each male group（±SD）

表5 試驗(yàn)期間雄性大鼠各組體重?cái)?shù)據(jù)（±SD）Table 5 Weight data of each male group（±SD）

注：與對照組比較，*：P＜0.05。

體重（g ）周次對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）0 234.9±11.3 235.6±11.6 238.0±7.3 1 273.5±15.1 269.4±12.0 268.9±8.1 2 357.0±28.1 342.7±18.9 334.5±14.6*

4.2 胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法對大鼠臨床病理指標(biāo)的影響

與對照組相比，雙途徑組大鼠各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間未見毒性相關(guān)性顯著性差異。個(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但差異幅度小，均非病理性改變，結(jié)合試驗(yàn)組1結(jié)果及雌雄性數(shù)據(jù)綜合分析認(rèn)為差異僅體現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表6～9。

表6 雌性大鼠各組血液學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 6 Hematology data of each female group（±SD）

表6 雌性大鼠各組血液學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 6 Hematology data of each female group（±SD）

注：與對照組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01。

血液學(xué)指標(biāo) 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）4.05±1.64 4.04±1.23 3.73±1.25 RBC（1012/L） 6.82±0.32 6.97±0.22 6.57±0.34 Hgb（g/L） 130.70±4.22 132.20±3.82 127.20±4.78 Hct（%） 37.71±1.23 38.11±0.80 36.98±1.45 PLT（109/L） 1045.90±82.40 1154.50±147.88 1074.70±83.33 NEUT（%） 6.91±3.39 7.60±4.24 14.11±6.77**LYMPH（%） 81.82±3.66 83.10±5.92 75.88±7.11*MONO（%） 9.90±3.60 8.12±2.51 8.75±1.94 EO（%） 1.37±0.69 1.18±0.64 1.26±0.69 BASO（%） 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 PT（s） 8.08±0.29 8.05±0.33 8.16±0.31 APTT（s）WBC（109/L）21.76±2.32 23.34±5.88 21.39±4.63

表7 雄性大鼠各組血液學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 7 Hematology data of each male group（±SD）

表7 雄性大鼠各組血液學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 7 Hematology data of each male group（±SD）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

血液學(xué)指標(biāo) 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）4.65±1.56 4.11±0.91 4.44±1.61 RBC（1012/L） 6.67±0.29 6.92±0.38 6.93±0.30 Hgb（g/L） 129.90±5.74 134.40±6.10 134.70±4.32*Hct（%） 38.58±1.68 39.20±1.39 39.42±1.12 PLT（109/L） 1063.10±102.62 1117.20±175.63 1140.50±108.79 NEUT（%） 8.79±2.76 10.03±2.70 7.83±3.20 LYMPH（%） 80.03±3.24 79.54±4.00 82.10±3.36 MONO（%） 10.64±1.80 9.73±3.13 9.46±1.22 EO（%） 0.54±0.18 0.70±0.50 0.59±0.12 BASO（%） 0.00±0.00 0.00±0.00 0.02±0.06 PT（s） 9.30±0.18 9.12±0.44 8.94±0.61 APTT（s）WBC（109/L）22.51±5.26 20.80±2.85 21.03±3.91

4.3 胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法對大鼠大體及組織病理的影響

大體檢查試驗(yàn)組1、2動物腹腔內(nèi)可見少量未吸收乳白色油類成分，見圖1。圖2為對照組動物腹腔所見。試驗(yàn)組和對照組雌、雄性大鼠各臟器均未觀察到明顯肉眼可見的病理改變。與對照組動物相比，雙途徑組動物各臟器重量未見毒性相關(guān)的顯著性差異，個(gè)別出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異臟器經(jīng)組織病理學(xué)檢查排除病理損傷，其他指標(biāo)如臨床病理等也未見相關(guān)臟器受損而致的相應(yīng)改變。結(jié)合試驗(yàn)組1結(jié)果及雌雄性數(shù)據(jù)綜合分析，認(rèn)為差異僅體現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表10、表11。試驗(yàn)組及對照組雌、雄性大鼠組織病理學(xué)檢查中未觀察到明顯組織病理學(xué)改變。

表8 雌性大鼠各組血液生化學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 8 Clinical chemistry data of each female group（±SD）

表8 雌性大鼠各組血液生化學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 8 Clinical chemistry data of each female group（±SD）

注：與對照組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01。

生化指標(biāo) 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）150.66±89.39 ALT（U/L） 31.49±5.42 34.08±13.69 51.67±49.14 ALP（U/L） 85.44±18.08 96.43±25.64 103.88±21.16 TBIL（μmol/L） 0.50±0.25 0.44±0.30 0.48±0.23 GGT（U/L） 0.60±0.30 0.56±0.41 0.54±0.39 TP（g/L） 59.47±3.46 58.82±4.36 57.00±3.58 ALB（g/L） 37.36±2.66 36.02±2.76 34.61±2.21*TCH（mmol/L） 1.56±0.33 1.45±0.27 1.32±0.22 TG（U/L） 0.29±0.09 0.25±0.04 0.26±0.05 GLU（mmol/L） 7.07±0.44 6.69±0.88 6.59±0.34*CREA（μmol/L） 27.44±3.73 26.45±2.44 25.68±3.09 UREA（mmol/L） 5.11±0.79 5.85±0.83 5.29±0.67 Cl-（mmol/L） 103.32±1.15 102.97±1.97 104.02±1.46 Ca2＋（mmol/L） 2.33±0.04 2.29±0.07 2.26±0.06*IP（mmol/L） 2.44±0.20 2.39±0.13 2.46±0.20 K＋（mmol/L） 3.96±0.18 4.21±0.16** 4.09±0.24 Na＋（mmol/L）AST（U/L） 113.42±18.78 136.50±28.49*139.60±0.76 139.09±1.63 139.58±1.75

表9 雄性大鼠各組血液生化學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 9 Clinical chemistry data of each male group（±SD）

表9 雄性大鼠各組血液生化學(xué)檢測結(jié)果（±SD）Table 9 Clinical chemistry data of each male group（±SD）

注：與對照組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01。

生化指標(biāo) 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）156.98±59.45 150.77±37.57 137.68±24.19 ALT（U/L） 52.95±25.08 48.95±13.86 44.68±11.83 ALP（U/L） 244.68±58.72 218.10±35.28 232.80±37.72 TBIL（μmol/L） 0.25±0.14 0.34±0.10 0.39±0.15*GGT（U/L） 0.84±0.39 1.04±0.18 0.72±0.31 TP（g/L） 50.89±1.69 51.98±1.74 51.46±2.18 ALB（g/L） 28.72±1.02 29.59±1.33 29.45±1.22 TCH（mmol/L） 1.26±0.15 1.65±0.24** 1.50±0.30*TG（U/L） 0.31±0.09 0.32±0.06 0.36±0.15 GLU（mmol/L） 6.04±0.50 6.55±0.78 6.43±0.61 CREA（μmol/L） 24.24±2.66 22.82±1.79 22.80±2.24 UREA（mmol/L） 4.56±0.49 4.47±0.59 4.24±0.45 Cl-（mmol/L） 103.12±1.60 103.20±1.17 104.71±1.34*Ca2＋（mmol/L） 2.17±0.03 2.18±0.05 2.19±0.05 IP（mmol/L） 2.89±0.18 2.69±0.14* 2.77±0.13 K＋（mmol/L） 4.23±0.21 4.31±0.18 4.33±0.18 Na＋（mmol/L） 141.22±0.94 141.15±0.97 142.20±0.83 AST（U/L）*

圖1 試驗(yàn)組腹腔Fig 1 Peritoneal cavity of test group

圖2 對照組腹腔Fig 2 Peritoneal cavity of control group

表10 雌性大鼠臟器重量結(jié)果（±SD）Table 10 Organ weight data of each female group（±SD）

表10 雌性大鼠臟器重量結(jié)果（±SD）Table 10 Organ weight data of each female group（±SD）

注：與對照組比較，**：P＜0.01。

臟器名稱 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）1.809±0.125 1.786±0.080 1.776±0.080胸腺 0.414±0.062 0.463±0.130 0.398±0.042心 0.840±0.104 0.760±0.063 0.730±0.047**肝 6.548±0.494 6.819±0.333 6.740±0.623脾 0.502±0.092 0.498±0.080 0.521±0.064腎上腺 0.060±0.008 0.058±0.006 0.063±0.005腎 1.769±0.196 1.782±0.129 1.830±0.076卵巢 0.120±0.016 0.110±0.019 0.125±0.017子宮腦0.499±0.101 0.536±0.160 0.561±0.217

5 結(jié)論

在該試驗(yàn)條件下，胃腸外雙途徑組按照10 mL/kg·BW/天的劑量尾靜脈注射生理鹽水14 d，同時(shí)按照5 mL/kg·BW的劑量3 d 1次腹腔注射玉米油后，大鼠未出現(xiàn)導(dǎo)致毒性反應(yīng)的特異性變化。結(jié)果表明胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法能夠使大鼠同時(shí)充分接觸極性及非極性浸提介質(zhì)又不引起大鼠產(chǎn)生不良病理反應(yīng)。

表11 雄性大鼠臟器重量結(jié)果（±SD）Table 11 Organ weight data of each male group（±SD）

表11 雄性大鼠臟器重量結(jié)果（±SD）Table 11 Organ weight data of each male group（±SD）

注：與對照組比較，**：P＜0.01。

臟器名稱 對照組（n＝10） 試驗(yàn)組1（n＝10） 試驗(yàn)組2（n＝10）1.996±0.093 1.979±0.058 1.957±0.121胸腺 0.631±0.105 0.511±0.104** 0.613±0.128心 1.077±0.131 1.145±0.130 1.118±0.105肝 10.272±0.974 9.667±0.389 9.140±0.732**脾 0.766±0.092 0.710±0.150 0.643±0.083腎上腺 0.045±0.006 0.041±0.010 0.049±0.012腎 2.617±0.249 2.483±0.218 2.474±0.174睪丸 2.943±0.250 2.850±0.199 2.997±0.188附睪腦0.660±0.068 0.678±0.062 0.756±0.155

6 討論

由于人體的體液內(nèi)環(huán)境兼具極性和非極性的性質(zhì)，所以當(dāng)某些醫(yī)療器械長期接觸人體時(shí)，其潛在的極性及非極性有害物質(zhì)會同時(shí)釋放到人體內(nèi)，從而對人體產(chǎn)生毒性作用。本研究設(shè)計(jì)的雙途徑接觸試驗(yàn)法具有更好的臨床相關(guān)性，能檢測樣品極性及非極性可瀝慮物的綜合作用，更加全面的評價(jià)醫(yī)療器械的重復(fù)接觸全身毒性。

研究中兩種接觸途徑的注射體積及頻率是比較關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)。研究表明，非水溶液按照5～10 mL/kg·BW的接觸體積腹腔注射大鼠3 d后，可基本吸收完全，且過于頻繁的腹腔注射，可能會增加如腹腔臟器損傷及注射至腸管內(nèi)或膀胱內(nèi)等不良反應(yīng)的可能性［5］。研究認(rèn)為，對于靜脈途徑重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)，為避免引起大鼠過度應(yīng)激可按照10 mL/kg·BW的接觸體積［6］進(jìn)行試驗(yàn)。該研究的結(jié)果中，雙途徑組動物在本試驗(yàn)條件下，臨床觀察未見明顯不良反應(yīng)。剖檢時(shí)，腹腔內(nèi)玉米油大部分已被吸收。體重?cái)?shù)據(jù)、血液學(xué)血生化數(shù)據(jù)、大體及組織病理學(xué)檢查均未見明顯毒性或病理性改變。該研究結(jié)果表明，胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法，既可使大鼠同時(shí)持續(xù)暴露于極性及非極性浸提介質(zhì)中又不引起大鼠產(chǎn)生明顯毒性或病理性不良反應(yīng)，即本研究體系本身不會干擾浸提液中潛在有害物質(zhì)毒性反應(yīng)的判斷。

本研究結(jié)果表明，大鼠胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)法可檢測醫(yī)療器械極性及非極性可瀝慮物的綜合作用，從而更加全面的評價(jià)其重復(fù)接觸全身毒性。此方法的建立可以進(jìn)一步完善醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)體系進(jìn)而提升醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)水平。