以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等干預(yù)視神經(jīng)損傷大鼠視神經(jīng)拉伸力學(xué)的特性分析*

王玲，呂雪漫，姜琦

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033）

1 引 言

目前視神經(jīng)損傷的治療方法存在著較大的爭議［1］。近年來，以干細(xì)胞干預(yù)治療視神經(jīng)損傷已在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中取得了一定的療效［2］。關(guān)于人臍血干細(xì)胞（human umbilical cord blood stem cells，hUCBSC）對于視神經(jīng)損傷的干預(yù)治療，周丹［3］對外傷性視神經(jīng)部分損傷模型大鼠以人臍血干細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療效果進(jìn)行了研究，得出了人臍血干細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子具有促進(jìn)恢復(fù)外傷性視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型視神經(jīng)傳導(dǎo)功能的結(jié)論。尹成玉等［4］對臍血間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)治療視神經(jīng)損傷的療效進(jìn)行了觀察，得出了臍血間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)治療視神經(jīng)損傷患者后視力均有改善的結(jié)論。關(guān)于人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，劉勇等［5］以人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，得出了人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子移植視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型后hBDNF—GFP—NSCs可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元外，少數(shù)可分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞；移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs存活的結(jié)論。Lv等［6］對以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細(xì)胞干預(yù)視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型家兔視神經(jīng)的應(yīng)力松弛、蠕變特性進(jìn)行了研究，得出了hUCBSC和BDNF具有恢復(fù)視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型應(yīng)力松弛、蠕變特性的作用和干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型效果明顯的結(jié)論。

本研究以鉗夾法制備視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，分別以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和人臍血干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)治療，以拉伸力學(xué)性能指標(biāo)判斷以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細(xì)胞干預(yù)治療視神經(jīng)損傷模型動(dòng)物的效果，旨在為視神經(jīng)損傷的治療提供生物力學(xué)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康7月齡，體質(zhì)量330～340 g雌性SD大鼠60只，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。在籠中飼養(yǎng)各組大鼠，大鼠飼養(yǎng)室溫度23～25℃，室內(nèi)保持空氣流通，自然光照，室內(nèi)相對濕度60～72%，實(shí)驗(yàn)前對大鼠眼底和外眼進(jìn)行檢查，對無病變大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組

60只SD大鼠隨機(jī)分為視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組20只，視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以BDNF干預(yù)組20只，視神經(jīng)損傷模型以人hUCBSC干預(yù)組20只，在60只大鼠中隨機(jī)取20只正常眼（左眼）設(shè)為正常對照組。.

2.3 視神經(jīng)損傷大鼠模型的制備

按文獻(xiàn)［7］的方法建立視神經(jīng)損傷大鼠模型，大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上，向大鼠腹腔內(nèi)注射0.1%的烏拉坦（5 mg/kg）水合氯醛，麻醉大鼠后將大鼠右眼頂側(cè)眶上皮膚切開，露出眶壁和眶上緣切跡，在眶上緣切跡處將視神經(jīng)管方向兩側(cè)部分眶壁骨板（寬5 mm，深6～7 mm）切除，將后部眼球筋膜剪開，沿上直肌向球后分離，使眼球后視神經(jīng)暴露。在離后極部約3 mm游離視神經(jīng)約4 mm，以上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的W40160恒定壓力反向血管夾（相當(dāng)于98 g）鉗夾同一部位的視神經(jīng)10 s。用慶大霉素液沖洗術(shù)野10次后，以青島耐克醫(yī)材有限公司生產(chǎn)的10～0號尼龍線分層縫合。術(shù)后在大鼠眼結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。

2.4 視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)

視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型造模后立即觀察，將大鼠視網(wǎng)膜血管無出血或梗塞，傷眼瞳孔散大間接對光反射存在，直接對光反射消失作為造模成功的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

2.5 藥物干預(yù)

對視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以BDNF干預(yù)組大鼠于造模7 d后［7］，以瑞士哈美頓公司生產(chǎn)的微量注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 50 ng。對視神經(jīng)損傷大鼠以hUCBSC干預(yù)組大鼠于造模7 d后，用以瑞士哈美頓公司生產(chǎn)的微量注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射深圳北科生物公司生產(chǎn)的hUCBSC 106個(gè)［7］。

2.6 視神經(jīng)試樣取樣方法

建模30 d后處死各組大鼠，在YZ6F直接檢眼鏡下，以手術(shù)刀切取大鼠眶內(nèi)段同一部位視神經(jīng)各16個(gè)，將視神經(jīng)試樣置于裝有生理鹽水的器皿內(nèi)，置于4℃冰箱內(nèi)保存。

2.7 電子顯微鏡觀察大鼠視神經(jīng)組織形態(tài)方法

按文獻(xiàn)［8］的方法取各組大鼠眶內(nèi)同一部位視神經(jīng)各一條，長為5 mm，先以戊二醛（4%）前固定，之后以鋨酸（1%）后固定，以丙酮梯度進(jìn)行脫水，然后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，之后進(jìn)行真空噴金鍍膜，以德國卡爾蔡司公司生產(chǎn)的MERLIN Compact型場發(fā)射掃描電鏡觀察各組視神經(jīng)的組織形態(tài)。

2.8 各組大鼠視神經(jīng)試樣一維拉伸實(shí)驗(yàn)方法

以長春試驗(yàn)機(jī)研究所集團(tuán)生產(chǎn)的MODEL55100型電子拉力試驗(yàn)機(jī)對各組大鼠視神經(jīng)試樣進(jìn)行一維拉伸實(shí)驗(yàn)，以讀數(shù)顯微鏡測量各組大鼠視神經(jīng)試樣的長度和直徑，各組試樣長度均為10 mm，直徑為0.82～0.88 mm。按文獻(xiàn)［7］的方法分別對每個(gè)大鼠視神經(jīng)試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)處理。各組大鼠視神經(jīng)試樣拉伸實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為36.5±1.0℃，分別將各組大鼠視神經(jīng)試樣裝夾于試驗(yàn)機(jī)的軟組織夾頭內(nèi)，以1 mm/min的載荷增加速度對視神經(jīng)試樣進(jìn)行拉伸，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出視神經(jīng)試樣的拉伸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和曲線。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

以美國SPSS16.0軟件包（SPSS，Chicago，IL，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以mean±SD表示，組間數(shù)據(jù)差異的比較采用單因素方差分析法和Sceffe法，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 掃描電鏡觀察各組視神經(jīng)的組織形態(tài)結(jié)果

各組視神經(jīng)的組織形態(tài)掃描電鏡觀察結(jié)果見圖1。

圖1 正常對照組、視神經(jīng)損動(dòng)物模型組、視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以hUCBSC治療組、視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以DBNF治療組視神經(jīng)電子顯微鏡照片（×100）。Fig 1 The normal control group，the optic nerve injury model group，the optic nerve injury animal model group treated with hUCBSC，the optic nerve injury animal model treated with DBNF（×100）.

掃描電鏡觀察結(jié)果表明，正常對照組視神經(jīng)軸突等內(nèi)容物形態(tài)清晰，細(xì)胞核均勻，無增大、無明顯水腫，無炎癥細(xì)胞，見圖1a。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組視神經(jīng)結(jié)構(gòu)模糊，纖維排列稀疏，軸突、核碎裂軸突等的組織形態(tài)發(fā)生了改變，見圖1b。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以BDNF治療組視神經(jīng)部分膠質(zhì)細(xì)胞核排列不規(guī)則，有少量細(xì)胞空泡，部分神經(jīng)纖維排列較整齊，軸突形態(tài)有一定的恢復(fù)，神經(jīng)纖維迂曲、偶見胞核碎片，視神經(jīng)無明顯變細(xì)，見圖1c。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以hUCBSC治療組視神經(jīng)纖維排列較密集，膠質(zhì)細(xì)胞核增多，多數(shù)軸突形態(tài)正常，見圖1d。

3.2 各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝15）Table 1 Tensile test results of optic nerve in rats of each group（n＝15）

結(jié)果用mean±SD表示，每組15個(gè)樣本，aP＜0.05，vs.正常對照組；bP＜0.05，vs.視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組；cP＜0.05，vs.視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以BDNF治療組；dP＜0.05，vs.視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以hUCBSC治療組。

各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，視神經(jīng)損傷模型以BDNF干預(yù)組動(dòng)物視神經(jīng)的最大載荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度載荷、彈性限度應(yīng)力小于視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預(yù)組，差異顯著（P＜0.05）。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組視神經(jīng)的拉伸最大載荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度載荷、彈性限度應(yīng)力小于視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC、以BDNF干預(yù)組差異顯著（P＜0.05）。

3.3 各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線

各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線見圖2。

圖2 各組大鼠視神經(jīng)一維拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig 2 The stress-strain curves of optic nerve in rats of each group

3.4 各組大鼠視神經(jīng)應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式的建立

由各組視神經(jīng)拉伸實(shí)驗(yàn)得出的應(yīng)力、應(yīng)變數(shù)據(jù)，分別建立各組大鼠試樣的應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式如下：

正常對照組：σ（ε）＝26054e5-73.00e4＋67.75 e3-13.07＋1.632

視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組：σ（ε）＝35.29e5-76.28e4＋54.03e3-4.64e2＋0.83

以hUCBSC干預(yù)治療組：σ（ε）＝46.89e5-117.18e4＋95.54e3-18.84e2＋2.23

以BDNF干預(yù)治療組：σ（ε）＝61.46e5-137.36e4＋100.72e3-17.99e2＋2.00

4 討論

各組大鼠視神經(jīng)組織形態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組視神經(jīng)結(jié)構(gòu)模糊，纖維排列稀疏，軸突、核碎裂軸突等的組織形態(tài)發(fā)生了改變。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型以BDNF干預(yù)治療組視神經(jīng)部分膠質(zhì)細(xì)胞核排列不規(guī)則，有少量細(xì)胞空泡，部分神經(jīng)纖維排列較整齊，神經(jīng)纖維迂曲、偶見胞核碎片，視神經(jīng)無明顯變細(xì)。視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預(yù)治療組視神經(jīng)大面積神經(jīng)纖維排列較密集，膠質(zhì)細(xì)胞核增多，軸突形態(tài)多數(shù)正常。說明BDNF、hUCBSC對恢復(fù)損傷視神經(jīng)的組織形態(tài)具有一定的作用，hUCBSC恢復(fù)損傷視神經(jīng)組織形態(tài)的作用好于BDNF。

各組大鼠視神經(jīng)拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型組大鼠視神經(jīng)的拉伸力學(xué)性能發(fā)生了改變，視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型通過以hUCBSC和以BDNF干預(yù)治療后，提高了視神經(jīng)損傷模型大鼠視神經(jīng)的拉伸力學(xué)性能指標(biāo)，視神經(jīng)的生理功能要求其神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)保持完整；具有完整結(jié)構(gòu)的視神經(jīng)才具有一定的承受變形和載荷的能力；如果神經(jīng)纖維局部受到損傷或被切斷，會使視神經(jīng)部分或全部喪失承受變形和載荷的能力［7］。分析認(rèn)為，視神經(jīng)損傷模型大鼠視神經(jīng)損傷后，正常視神經(jīng)纖維排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，組織形態(tài)發(fā)生了改變，使其力學(xué)性能發(fā)生了改變。

李云琴等［9］研究了以hUCBSC干預(yù)視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型后的效果，得出了視神經(jīng)損傷模型大鼠玻璃體腔注射hUCBSC可減緩視網(wǎng)膜中RGC的凋亡，對RGC具有保護(hù)作用的結(jié)論。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可向其它組織分化，具有移植后免疫排斥反應(yīng)低的特點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞已廣泛的應(yīng)用于生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［10］。

BDNF對神經(jīng)活動(dòng)起著重要作用，視神經(jīng)損傷后其節(jié)細(xì)胞損傷及死亡的一個(gè)很重要的原因是切斷了遠(yuǎn)端長期供應(yīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子，使RGCS營養(yǎng)不良而死亡，如果及時(shí)補(bǔ)充外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，損傷的RGCS仍能較好地生長［11］，研究證實(shí)，損傷后的神經(jīng)系統(tǒng)，補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)因子后可以促進(jìn)軸突再生和神經(jīng)元存活［12］。本研究通過以hUCBS對視神經(jīng)損傷動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)治療后，分泌了多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，增加了神經(jīng)損傷區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞，對破壞的視神經(jīng)組織形態(tài)有所改變，力學(xué)性能指標(biāo)也有一定的提高。

本研究發(fā)現(xiàn)，損傷的視神經(jīng)的組織形態(tài)恢復(fù)的越好，力學(xué)性能指標(biāo)恢復(fù)的越好，本研究得出的視神經(jīng)的組織形態(tài)觀察結(jié)果、拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC、以BDNF干預(yù)治療后對視神經(jīng)損傷模型動(dòng)物的視神經(jīng)組織形態(tài)、力學(xué)性能指標(biāo)具有提高的作用，說明hUCBSC、BDNF干預(yù)治療對視神經(jīng)損傷模型大鼠均具有一定的療效，但hUCBSC的干預(yù)治療效果更好。