黃芪甲苷和三七總皂苷配伍抗大鼠腦缺血再灌注損傷及其藥動(dòng)學(xué)的研究

李靜嫻+楊筱倩+唐標(biāo)+劉曉丹+唐映紅+鄧常清+黃小平

[摘要] 研究黃芪甲苷（AST Ⅳ）和三七總皂苷（PNS）配伍對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，并從4種主要有效成分AST Ⅳ、人參皂苷Rg1（Rg1）、人參皂苷Rb1（Rb1）、三七皂苷R1（R1）在腦缺血再灌注大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為探討二者協(xié)同增強(qiáng)抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制。采用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦缺血/再灌注模型，以神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積、病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)AST Ⅳ和PNS配伍抗腦缺血再灌注損傷的藥理效應(yīng)；采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定給藥后不同時(shí)間大鼠血漿中AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的含量，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析AST Ⅳ和PNS配伍后主要有效成分藥代動(dòng)力學(xué)行為的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AST Ⅳ，PNS單用及其配伍可以縮小大鼠腦梗死面積，降低神經(jīng)功能缺失行為學(xué)評(píng)分，改善腦缺血后病理形態(tài)變化，AST Ⅳ和PNS配伍的效應(yīng)強(qiáng)于二者單用。藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果，AST Ⅳ和PNS配伍后，AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的曲線下面積（AUC）顯著增加，平均駐留時(shí)間MRT0-t延長(zhǎng)，達(dá)峰濃度（Cmax）顯著增加，表觀分布容積（Vz/F）減少，且體內(nèi)清除速率顯著減慢。表明AST Ⅳ和PNS配伍具有協(xié)同增強(qiáng)抗腦缺血再灌注損傷的作用，且二者配伍可使主要有效成分的藥動(dòng)學(xué)行為發(fā)生改變，提示其機(jī)制可能是AST Ⅳ和PNS配伍后，可在腦缺血狀態(tài)下延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)滯留時(shí)間，使生物利用度增加，達(dá)到增強(qiáng)藥效、延長(zhǎng)藥效、發(fā)揮協(xié)同增效的目的。

[關(guān)鍵詞] 黃芪甲苷； 三七總皂苷； 配伍； 腦缺血再灌注； 藥動(dòng)學(xué)

[Abstract] The aim is to study the effect of astragaloside Ⅳ （AST Ⅳ） combined with Panax notoginseng saponins （PNS） on cerebral ischemia-reperfusion injury， and to probe the synergistic mechanism through the pharmacokinetics of the four major components such as AST Ⅳ， ginsenoside Rg1 （Rg1）， ginsenoside Rb1 （Rb1）， notoginsenoside R1 （R1） in cerebral ischemia-reperfusion rats. Following the establishment of cerebral ischemia/reperfusion model in rats by modified suture method， neurological function score， cerebral infarction area and pathomorphology were used to evaluate the pharmacological effect that the combination of AST Ⅳ and PNS antagonized cerebral ischemia-reperfusion injury； the contents of AST Ⅳ， Rg1， Rb1， R1 in rat plasma of different time points were determined with ultra performance liquid chromatography tandem massspectrometry （UPLC-MS/MS）， pharmacokinetic parameters were calculated and pharmacokinetics changes of the main effective components were analyzed. The results showed that AST Ⅳ， PNS alone and their combination could reduce the cerebral infarction area of rats， relieve the behavioral scores of neurologic deficit， improve the pathological changes after cerebral ischemia， the effects of the combination were better. Among AST Ⅳ， Rg1， Rb1， R1， the area under the curve （AUC） was significantly increased， the mean residence time of （MRT0-t） was delayed， the peak concentration （Cmax） was significantly raised， the apparent volume of distribution （Vz/F） was reduced， and the clearance rate in vivo was significantly slowed. It suggested that AST Ⅳ combined with PNS has synergistic enhancement on anti-cerebral ischemia/reperfusion injury， moreover， make the pharmacokinetic behavior of the main effective components change， the mechanism may be associated with prolonging the retention time of the effective components in cerebral ischemia condition， elevating the bioavailability.

[Key words] astragaloside Ⅳ； Panax notoginseng saponins； combination； cerebral ischemia/reperfusion； pharmacokinetics

腦血管疾病屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)^[1]，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾患之一。其中缺血性中風(fēng)是腦血管疾病的主要類型，發(fā)病率約占中風(fēng)的80%?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床研究表明，腦缺血的基本病機(jī)是虛、火、風(fēng)、痰、氣、血，而氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的主要病理機(jī)制。因此，以益氣活血為基本治法治療常可收到良好的療效。

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用有效中藥，黃芪具有補(bǔ)氣升陽等作用，三七具有活血散瘀、消腫止痛等功效，二者配伍，符合益氣活血的治療原則^[2-3]。中藥藥物化學(xué)研究表明，黃芪中具有抗腦缺血作用的主要有效組分為黃芪總苷（astragaloside，AST），黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ）是其主要有效成分^[4]；三七中具有抗腦缺血作用的主要有效組分是三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS），主要含人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，Rb1）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，Rg1）和三七皂苷R1（notoginsenoside R1，R1）^[5-6]。前期研究表明，黃芪與三七的有效組（成）分配伍具有協(xié)同抗腦缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)、改善腦組織能量代謝、以及抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞自噬性損傷等有關(guān)^[7-10]。雖然以往已經(jīng)初步揭示了黃芪和三七有效組（成）分配伍可以通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)協(xié)同增強(qiáng)抗腦缺血的作用，但黃芪和三七配伍協(xié)同增效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用原理還不是很清楚。推測(cè)黃芪和三七配伍可能通過影響中藥成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為，從而促進(jìn)藥物的吸收并延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的駐留時(shí)間，發(fā)揮對(duì)腦缺血的協(xié)同增效作用。因此本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型，研究AST Ⅳ和PNS配伍后抗腦缺血再灌注的藥理作用，并測(cè)定配伍前后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中主要成分AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化，探討AST Ⅳ和PNS配伍協(xié)同增效抗缺血性腦損傷的作用和藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)性。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)飼養(yǎng)5～7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 試藥

AST Ⅳ（純度≥98.05%，批號(hào)MUST-14102910），PNS（純度≥98%，批號(hào)MUST-14122912），Rg1（純度≥98.06%，批號(hào)MUST-14120407），Rb1（純度≥98.74%，批號(hào)MUST-15032211），R1（純度≥98.67%，批號(hào)MUST-14123111）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美國(guó)Sigma，批號(hào)BCBP3272V），水合氯醛（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)8MQ20-CC），甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)Merck），水為超純水，其他試劑均為分析純。AST Ⅳ，PNS用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配置成相應(yīng)濃度混懸液。

2 方法

2.1 抗腦缺血再灌注損傷藥效實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組及給藥 清潔級(jí)SD大鼠72只，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、AST Ⅳ組、PNS組、AST Ⅳ、PNS配伍組（高、低劑量）。每組8只，采用灌胃給藥的方法（10 mL·kg-1）。劑量按前期實(shí)驗(yàn)換算成大鼠用量：AST Ⅳ（28 mg·kg-1）組、PNS（80 mg·kg-1）組、AST Ⅳ和PNS高劑量配伍組（AST Ⅳ 56 mg·kg-1+PNS 160 mg·kg-1），AST Ⅳ和PNS低劑量配伍組（AST Ⅳ 28 mg·kg-1+PNS 80 mg·kg-1）。每日1次，連續(xù)灌胃2 d，于末次給藥1 h后制作腦缺血再灌注模型，再灌注期間同時(shí)給藥。假手術(shù)組及模型組大鼠給予等量生理鹽水。

2.1.2 腦缺血模型的制作 采用改良Longa法^[11-12]制作局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛（300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠頸前正中皮膚切開，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid arteries，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），用5-0手術(shù)線分別結(jié)扎ECA的遠(yuǎn)端并于結(jié)扎點(diǎn)近側(cè)凝斷ECA及其分支，并對(duì)ICA遠(yuǎn)側(cè)部進(jìn)行活結(jié)結(jié)扎，動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)側(cè)部與CCA。以直徑0.28 mm的尼龍線線栓自ECA經(jīng)CCA分叉部插入ICA，松開ICA上的動(dòng)脈夾，并將線栓插入ICA顱內(nèi)段，插入長(zhǎng)度約為（18±2） mm，活結(jié)扎住ICA內(nèi)的線栓以防止出血和線栓的移動(dòng)，縫合頸部皮膚。阻斷血流2 h后，拔出線栓進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅將CCA，ECA，ICA游離出來，不做插線處理，其他操作同模型組一致。

2.1.3 測(cè)定指標(biāo)與分析 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分：大鼠再灌注24 h后，按Longa法對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下^[12]：①0分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常，未觀察到神經(jīng)功能缺失癥狀；②1分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能完全伸展腦缺血對(duì)側(cè)前爪（輕度）；③2分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物向腦缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈（中度）；④3分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物爬行時(shí)向腦缺血對(duì)側(cè)傾倒（重度）；⑤4分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分作為腦缺血成功樣本入選。腦梗死面積：采用TTC染色法。再灌注24 h后，大鼠斷頭處死，迅速取腦，置于-20 ℃冰箱冰凍15 min，去除小腦、腦干等，將大腦均勻地切成5片2 mm連續(xù)冠狀切片。然后迅速將腦片置于2% TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫水浴箱避光染色30 min，每5 min將腦片輕輕翻動(dòng)1次。染色后，用4%多聚甲醛將腦片固定24 h。非缺血區(qū)組織為玫瑰紅色，梗死區(qū)組織為白色。 腦組織病理形態(tài)：采用HE染色法。再灌注24 h后，大鼠斷頭處死迅速取腦，放入4%多聚甲醛中固定2～3 d。經(jīng)視交叉平面冠狀切取2 mm厚腦組織，經(jīng)梯度酒精上行脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切成3 μm薄的切片，用于HE染色。HE染色切片在顯微鏡（10×40）下隨機(jī)取缺血皮質(zhì)區(qū)5個(gè)非重疊的視野對(duì)損傷細(xì)胞進(jìn)行觀察，損傷細(xì)胞表現(xiàn)為空泡樣變性、嗜酸性樣變性、核固縮、核溶解等改變。分別計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中的細(xì)胞總數(shù)及損傷細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞損傷率=（損傷細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。各組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，配伍低劑量組和兩成分單用組的組間比較（因配伍低劑量組藥物劑量與兩成分單用組的藥物劑量相同）采用LSD法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 腦缺血再灌注模型下ASTⅣ和PNS配伍給藥后藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組、給藥與樣品采集 SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，給藥前12 h禁食，自由飲水。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用配伍低劑量組進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)的研究，將動(dòng)物分為AST Ⅳ（28 mg·kg-1）組、PNS（80 mg·kg-1）組、AST Ⅳ+PNS配伍組（AST Ⅳ 28 mg·kg-1+PNS 80 mg·kg-1），每組3只。各組分別進(jìn)行腦缺血再灌注模型的制作，并于造模后2 h分別灌胃給藥，給藥體積10 mL·kg-1；在給藥后0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，12，24 h于大鼠心臟采血0.5 mL（為保證有足夠血量的抽取和防止低血容量引起動(dòng)物死亡，在給藥前20 min于大鼠腹腔注射2 mL生理鹽水）。血樣置EDTA-K2抗凝試管中，4 ℃下3 500 r·min-1離心5 min，取上清液即得含藥血漿樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取100 μL血漿樣品置于具塞離心管中，加入480 μL無水乙醇沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜（濾膜首先用甲醇沖過后空氣揮干）后待測(cè)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取AST Ⅳ，Rb1，Rg1，R1對(duì)照品，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為519，511，520，504 mg·L-1的對(duì)照品溶液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量3 μL；梯度洗脫程序：0～1 min，25% B；1～4.5 min，25%～35% B；4.5～7 min，35%～55% B；7～8 min，55%～95% B；8～15 min，95% B；15～15.1 min，95%～25% B；15.1～20 min，25% B。

2.2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為m/z 829.5→783.4，845.5→637.4，1 107.6→179.1，931.5→799.4，毛細(xì)管電壓4.0 kV，干燥氣溫度為335 ℃，流速為11 L·min-1，霧化氣壓力為40 psi。4種被測(cè)定成分質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果

3.1 AST Ⅳ和PNS配伍對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響

3.1.1 對(duì)神經(jīng)功能缺失評(píng)分的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)行為功能正常，行為學(xué)評(píng)分為0分。模型組大鼠出現(xiàn)了對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展，或向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或者傾倒的神經(jīng)功能障礙，其神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，AST Ⅳ單用組、PNS單用組、AST Ⅳ+PNS配伍低劑量組和高劑量組的神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著降低（P<0.01）。與AST Ⅳ單用組和PNS單用組比較，AST Ⅳ+PNS配伍低劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著降低（P<0.01），見表2。

3.1.2 對(duì)腦梗死面積的影響 假手術(shù)組腦組織TTC染色示均勻紅色，未見有蒼白梗死區(qū)域。模型組出現(xiàn)較大范圍的蒼白梗死灶。與模型組比較，各用藥組的腦梗死面積縮小，且AST Ⅳ+PNS配伍的不同劑量組腦梗死面積縮小更為顯著，見圖1。

3.1.3 對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下可見，假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，連接緊密，核仁清晰可見，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)纖維密集，排列緊密，偶見細(xì)胞損傷改變。模型組大鼠腦組織細(xì)胞周圍間隙增大，胞核不規(guī)整，毛細(xì)血管萎縮，間質(zhì)水腫明顯，排列紊亂，細(xì)胞核深染固縮或出現(xiàn)嗜酸性樣變性，損傷細(xì)胞增多，損傷細(xì)胞顯著多于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞間隙增大有所減輕，核固縮與嗜酸性樣變性細(xì)胞減少，細(xì)胞損傷程度減輕。與模型組比較，AST Ⅳ單用組、PNS單用組、AST Ⅳ+PNS配伍低劑量組和高劑量組損傷細(xì)胞數(shù)和損傷細(xì)胞率顯著低于模型組（P<0.01）。與AST Ⅳ和PNS單用組比較，AST Ⅳ+PNS配伍低劑量組損傷細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞損傷率顯著減少（P<0.01），見表3，圖2。

3.2 AST Ⅳ和PNS配伍對(duì)腦缺血再灌注狀態(tài)下藥動(dòng)學(xué)的影響

3.2.1 專屬性考察 空白血漿、空白血漿加AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1對(duì)照品和AST Ⅳ與PNS配伍給藥后血漿的色譜圖同，見圖3。由圖3可見，AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的保留時(shí)間分別為 6.7，3.4，6.0，3.1 min，空白血漿在相同保留時(shí)間處無吸收峰，方法專屬性良好。

3.2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取一定量的5種對(duì)照品儲(chǔ)備液于離心管中，用大鼠空白血漿分別稀釋成質(zhì)量濃度為5，2，1，0.2，0.1，0.04，0.02，0.01 mg·L-1的系列血漿樣品，按2.2.2項(xiàng)處理，并按照2.2.4項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1線性回歸方程y=20.711 6x+3.182 9（r=0.998 7），y=104.308 4x-41.339 0（r=0.997 1），y=9.807 5x-1.179 4（r=0.999 1），y=26.797 7x-11.034 6（r=0.997 2）。在0.01～5 mg·L-1線性關(guān)系良好，按信噪比S/N≥3計(jì)，最低檢測(cè)限為0.01 mg·L-1。

3.2.3 精密度試驗(yàn) 取9份100 μL空白血漿分別置具塞試管中，加入3種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液適量，用大鼠空白血漿配制成質(zhì)量濃度分別為0.01，0.1，0.5 mg·L-1的低、中、高3種質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品3份，按2.2.2項(xiàng)方法處理，并按照2.2.4項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，同一質(zhì)量濃度樣品每1 h測(cè)定1次，共測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）；每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6 d，計(jì)算日間精密度RSD。AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的日內(nèi)精密度RSD分別為3.6%，3.9%，2.1%，3.3%，日間精密度RSD分別為3.3%，4.5%，2.2%，4.3%，均<10%（n=3），表明所建立的檢測(cè)方法精密度符合藥動(dòng)學(xué)分析要求。

3.2.4 加樣回收率及基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取空白血漿配制上述各成分低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品血漿，同時(shí)以相同濃度的對(duì)照品進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份，按相同的預(yù)處理方法和色譜條件進(jìn)行處理和測(cè)定。得到血漿中AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1的平均加樣回收率分別為100.4%，95.77%，99.05%，98.13%；RSD分別為0.83%，5.5%，1.2%，2.0%（n=3），表示回收率良好，滿足樣品測(cè)定要求，見表4。另取空白血漿，按2.2.2項(xiàng)處理獲得的上清液中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)得峰面積A；相應(yīng)質(zhì)量的對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣測(cè)得峰面積B，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)=A/B×100%?；|(zhì)效應(yīng)分別為（99.31±2.61）%，（96.91±4.61）%，（95.05±2.32）%，（96.86±2.67）%，RSD均較小，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求。

3.2.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定和分析 藥物單用和配伍給藥后各有效成分在腦缺血再灌注大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖4。所得大鼠血藥濃度數(shù)據(jù)采用藥動(dòng)學(xué)計(jì)算程序DAS 3.1.6 藥動(dòng)學(xué)程序軟件進(jìn)行擬合，采用非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)以±s表示，得到的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用SPSS 17.0進(jìn)行分析，兩組間的比較，方差齊者采用成組t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

與單用PNS相比，AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，R1的曲線下面積（AUC）增大（P<0.01），平均駐留時(shí)間MRT0-t延長(zhǎng)（P<0.05），半衰期（t1/2z）縮短（P<0.01），表觀分布容積（Vz/F）減少（P<0.01），清除率（CLz）減?。≒<0.01），藥峰濃度（Cmax）顯著增加（P<0.01）。顯示配伍給藥后，R1在體內(nèi)吸收量顯著增加，分布減少，藥物停留時(shí)間延長(zhǎng)，清除速度減慢。

與單用PNS相比，AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，Rg1的曲線下面積AUC增大（P<0.01），平均駐留時(shí)間MRT0-t延長(zhǎng)（P<0.01），表觀分布容積Vz/F減少（P<0.01），清除率CLz減?。≒<0.01），藥峰濃度（Cmax）顯著增加（P<0.01）。顯示AST Ⅳ和PNS配伍可使Rg1在體內(nèi)的吸收量增加，分布減少，清除速率減慢，在體內(nèi)的駐留時(shí)間延長(zhǎng)。

與單用PNS相比，AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，Rb1的曲線下面積AUC增加（P<0.01），平均駐留時(shí)間 MRT0-t顯著延長(zhǎng)（P<0.01），半衰期t1/2z縮短（P<0.01），表觀分布容積Vz/F減少（P<0.01），清除率CLz減?。≒<0.01），藥峰濃度（Cmax）顯著增加（P<0.01）。顯示AST Ⅳ和PNS配伍可使Rb1在體內(nèi)的吸收程度增加，分布減少，清除速度減慢，駐留時(shí)間延長(zhǎng)。

與單用AST Ⅳ相比，AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，AST Ⅳ的曲線下面積AUC明顯增加（P<0.01），清除率CLz減小（P<0.01），藥峰濃度（Cmax）顯著增加（P<0.01）。提示AST Ⅳ和PNS配伍后可使AST Ⅳ吸收量顯著增加，體內(nèi)清除減慢。

由此可見，AST Ⅳ和PNS 單用時(shí)4個(gè)有效成分的達(dá)峰濃度較低，曲線下面積較小，清除速率較快。AST Ⅳ和PNS配伍后，可使有效成分達(dá)峰濃度和曲線下面積增加。

4 討論

中醫(yī)歷來重視藥物的配伍應(yīng)用，但中藥配伍并不是單個(gè)成分的簡(jiǎn)單相加，更多地是通過配伍影響了中藥成分在體內(nèi)的吸收和代謝，使藥物成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為等發(fā)生變化，從而促進(jìn)藥物的吸收和進(jìn)入病變部位，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，使血藥濃度升高，發(fā)揮協(xié)同增強(qiáng)藥物效應(yīng)的作用。黃芪和三七配伍符合益氣活血的治療原則，已有的臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究證明二者配伍具有協(xié)同增效抗腦缺血損傷的作用^[13-16]，而且以往的研究也證明二者有效組（成）分配伍可作用于腦缺血的病理生理多環(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用，但配伍后是否影響各成分的藥動(dòng)學(xué)還不清楚?；谥兴帍?fù)方的整體性^[17-19]，本實(shí)驗(yàn)建立了腦缺血大鼠血漿中AST Ⅳ，Rg1，Rb1，R1同時(shí)測(cè)定的LC-MS/MS方法，通過專屬性、線性關(guān)系、精密度、回收率實(shí)驗(yàn)充分驗(yàn)證此分析方法的可靠性，并運(yùn)用此方法對(duì)腦缺血大鼠血漿中的黃芪和三七主要有效成分進(jìn)行定量分析，獲得被測(cè)成分在腦缺血大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化，以闡明AST Ⅳ和PNS配伍協(xié)同增效抗缺血性腦損傷的作用機(jī)制。

局灶性腦缺血再灌注大鼠模型是評(píng)價(jià)藥物對(duì)腦缺血再灌注損傷常用的模型，與人類腦梗死發(fā)病情況類似^[20]。腦缺血后由于腦組織缺血缺氧，細(xì)胞損傷壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的形態(tài)損傷和功能異常，因此，用神經(jīng)功能評(píng)分和病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)可評(píng)價(jià)其抗腦缺血的效應(yīng)。研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注后，大鼠神經(jīng)功能障礙明顯，神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著增高。與模型組比較，AST Ⅳ組、PNS組、AST Ⅳ和PNS配伍低、高劑量組神經(jīng)功能障礙減輕，神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著降低，且配伍低劑量組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著低于藥物單用組。表明AST Ⅳ和PNS配伍能協(xié)同改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺失，改善腦組織功能。TTC染色和HE染色結(jié)果表明，局灶性腦缺血再灌注后，大鼠腦組織出現(xiàn)梗死灶，細(xì)胞損傷明顯。與模型組相比，各用藥組腦梗死面積縮小，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變均得到一定的改善，細(xì)胞損傷數(shù)量減少。AST Ⅳ和PNS配伍低劑量組較單用組比較，腦梗死面積縮小明顯，細(xì)胞損傷顯著減輕。提示AST Ⅳ和PNS配伍能協(xié)同延緩并減輕腦細(xì)胞的死亡，改善神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。從而從藥效學(xué)角度證明，AST Ⅳ和PNS配伍可以縮少腦梗死體積，減輕腦缺血后的病理形態(tài)學(xué)改變，減輕神經(jīng)功能缺失癥狀。AST Ⅳ和PNS配伍可增強(qiáng)抗大鼠腦缺血再灌注損傷的作用。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，AST Ⅳ的Cmax顯著增加，CLz減小，AUC顯著增大。由此可見，配伍顯著影響了AST Ⅳ在腦缺血再灌注大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，使其吸收程度增加，體內(nèi)的清除減慢，從而使其在血液中的濃度升高，生物利用度增加。AST Ⅳ和PNS配伍給藥后，3個(gè)皂苷類成分的AUC均顯著升高，MRT0-t增大，CLz減小，Vz/F減少，且Cmax顯著升高。表明配伍給藥后，3個(gè)皂苷類成分在體內(nèi)的吸收程度增加，停留時(shí)間變長(zhǎng)，清除速度減慢，生物利用度顯著增加。提示AST Ⅳ和PNS配伍后能夠增加有效成分的吸收程度，增加藥物在腦缺血大鼠體內(nèi)的含量，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，提高生物利用度，從而達(dá)到增效的目的。

綜上所述，AST Ⅳ和PNS配伍具有增強(qiáng)抗腦缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與二者配伍后，促進(jìn)有效成分在體內(nèi)的吸收，延長(zhǎng)藥物的滯留時(shí)間，增加生物利用度，增強(qiáng)和延長(zhǎng)藥效有關(guān)。從藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)角度揭示了黃芪和三七有效組（成）分配伍治療腦缺血的合理性。

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[責(zé)任編輯 張燕]