紫外光譜法快速測定醒腦靜注射液一次提取過程中9種成分

黃凱毅+魏丹妮+方金陽+李晞瑗+嚴斌俊

[摘要] 該研究建立了一種基于紫外光譜的醒腦靜注射液一次提取過程分析方法，用于快速測定蒸餾提取液中異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、莪術醇、吉馬酮9種成分含量。在醒腦靜注射液一次提取過程中收集郁金-梔子水蒸氣蒸餾液樣品166份，掃描紫外光譜，并用高效液相色譜測定9種成分含量，使用最小二乘支持向量機和徑向基人工神經網絡等方法建立紫外光譜與各成分含量之間的多元校正模型。實驗結果表明，該研究建立的紫外光譜分析方法能較準確地測定蒸餾提取液中9種成分含量，預測誤差均方根分別為0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1。該方法具有快速、簡便、低成本的優(yōu)點，有助于醒腦靜注射液提取過程監(jiān)測和提取終點判斷，減少產品質量缺陷和質量差異。

[關鍵詞] 醒腦靜注射液； 紫外光譜； 過程分析； 郁金； 梔子； 水蒸氣蒸餾； 支持向量機； 人工神經網絡

[Abstract] In this study， an analytical method based on ultraviolet spectroscopy was established for the rapid determination of nine components including isophorone， 4-methylene-isophorone， curcumenone， curcumenol， curdione， curzerenone， furanodienone， curcumol and germacrone in the first extraction process of Xingnaojing injection. 166 distillate samples of Gardeniae Fructus and Radix Curcumae were collected in the first extraction process of Xingnaojing injection. The ultraviolet spectra of these samples were collected， and the contents of the nine components in these samples were determined by high performance liquid chromatography. Least squares support vector machine and radial basis function artificial neural network were used to establish the multivariate calibration models between the ultraviolet spectra and the contents of the nine components. The results showed that the established ultraviolet spectrum analysis method can determine the contents of the nine components in the distillates accurately， with root mean square error of prediction of 0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1， respectively. This proposed method is a rapid， simple and low-cost tool for the monitoring and endpoint determination of the extraction process of Xingnaojing injection to reduce quality defects and variations.

[Key words] Xingnaojing injection； ultraviolet spectroscopy； process analysis； Curcumae Radix； Gardeniae Fructus； hydrodistillation； least squares support vector machine； radial basis function artificial neural network

醒腦靜注射液是由麝香、郁金、梔子、冰片4味中藥制成的注射劑，具有清熱瀉火、涼血解毒、開竅醒腦的功效，臨床上主要用于中風、腦缺血、意識障礙、急性酒精中毒等病癥^[1-2]，是年銷售額超20億元的中藥大品種。該注射液生產中采用水蒸氣蒸餾法對藥材中揮發(fā)性成分進行提取。首先將郁金、梔子加水進行第一次蒸餾提取，收集蒸餾液，然后將麝香加入蒸餾液中，并加水進行第二次蒸餾提取。以水蒸氣蒸餾法提取這些藥材中的揮發(fā)性成分具有雜質提取量少的優(yōu)點，但生產中存在提取時間長、能耗高、提取物批次間質量差異大等問題。

目前對醒腦靜注射液的分析方法研究主要集中于成品質量檢測^[3-5]，測定麝香酮、龍腦以及源于郁金的倍半萜類生物活性成分^[6]，如莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮等^[4]。此外，本課題組前期研究發(fā)現醒腦靜注射液中源于梔子的2種主要成分為異佛爾酮和4-亞甲基-異佛爾酮，并建立了高效液相色譜（HPLC）分析方法用于測定一次提取過程中間體（即郁金-梔子蒸餾液）中源于梔子的這2種成分及源于郁金的7種倍半萜類成分（莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、莪術醇、吉馬酮）^[7]。

對于醒腦靜注射液生產過程分析方法目前尚無文獻報道，而為了合理判斷提取過程終點，提升生產過程質量監(jiān)控水平，需要研究并建立提取過程分析方法。紫外光譜（UV）是一種快速、無損的分析方法，與近紅外光譜、拉曼光譜等相比，具有靈敏度高、儀器價格便宜的優(yōu)點^[8]，已被用于多種中藥的生產過程分析^[8-10]。由于郁金-梔子蒸餾液中待測成分濃度較低，因此本研究選擇紫外光譜分析技術，建立蒸餾提取液中各成分含量與紫外光譜間的定量校正模型，以快速測定異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、莪術醇、吉馬酮9種成分的含量。在建立校正模型時，對偏最小二乘（PLS）、最小二乘支持向量機（LS-SVM）和徑向基人工神經網絡（RBF-ANN）3種建模方法進行比較并優(yōu)選校正模型。本研究建立的分析方法具有快速、簡便、低成本的優(yōu)點，可用于提取過程監(jiān)測和提取終點判斷，以提高生產效率、減少產品質量缺陷和質量差異。

1 材料

梔子（產地浙江，批號151201）、郁金（產地浙江，批號160301）購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，并經浙江中醫(yī)藥大學楊波副教授鑒定為Gardenia jasminoides Ellis果實和溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling塊根。色譜純乙腈、甲醇購自美國Tedia公司。色譜純磷酸購自天津賽孚瑞科技有限公司。超純水由UPH-III-5T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）產生。莪術二酮對照品（批號150610）購自成都植標化純生物技術有限公司。

2 方法

2.1 水蒸氣蒸餾提取與樣品收集 郁金、梔子藥材分別粉碎、過篩至20～80目，各取30 g粉末，加蒸餾水1 500 mL，浸泡12 h，以水蒸氣蒸餾法進行提取^[11]。待藥液沸騰，開始計時，在第15，30 min分別在冷凝管出口處接取5 mL蒸餾液樣品，之后每隔30 min取樣5 mL，至蒸餾液總體積（包含取樣體積）為1 000 mL時停止取樣。按上述條件開展10個正常批次提取實驗。

為了擴大樣品中各成分含量變化范圍，同時為了考察所建立的分析方法在異常提取條件下是否適用，開展6個異常批次提取實驗，對提取條件進行的改變見表1。批次11藥材顆粒大小異常（10～20目），批次12藥材提取前未浸泡，批次13，14提取溶劑異常，批次15藥材投入量錯誤，批次16加熱功率異常。共開展16個批次實驗，取樣166份。

2.2 高效液相色譜分析 采用本課題組建立的一測多評方法^[7]，以莪術二酮為內參物對照品，測定樣品中9種成分含量。儀器為Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）。使用迪馬鉆石C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）。以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸-水溶液為流動相B。梯度洗脫（0～10 min，30%～55% A；10～24 min，55% A；24～35 min，55%～70% A；35～40 min，70%～100% A）。流速0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量50 μL。使用二極管陣列檢測器采集200～400 nm光譜，用于各成分定量的波長為：異佛爾酮238 nm，4-亞甲基-異佛爾酮275 nm，莪術雙環(huán)烯酮256 nm，莪術烯醇261 nm，莪術二酮220 nm，莪術酮274 nm，莪術呋喃二烯酮274 nm，莪術醇210 nm，吉馬酮210 nm。

上述HPLC分析方法在方法學考察中顯示了良好的線性（線性相關系數r均大于0.999 9）、精密度（RSD均小于1.8%）、重復性（RSD均小于2.0%）、準確性（各成分加樣回收率在95.30%～105.4%），且樣品在12 h內穩(wěn)定，表明該HPLC方法能準確地測定9種成分含量^[7]。

2.3 紫外光譜分析 使用UV-2600紫外光譜儀（上海尤尼科儀器有限公司）測定樣品的紫外光譜。以蒸餾水為參比，波長范圍為200～400 nm，波長間隔1 nm，共201個波長點。石英比色皿光程為2 mm，該光程能使大部分樣品的吸光度最大值在0.3～1.0，因此不需要對樣品進行稀釋。由于紫外光譜測定重復性很好，每個樣品只掃描一次紫外光譜。

2.4 校正模型的建立及其參數優(yōu)化 以9種成分的HPLC測定值作為參考值Y，各波長下的吸光度作為自變量X，采用文獻[12]中SPXY算法將全部樣本劃分為訓練集（111個樣本）和預測集（55個樣本）。分別采用PLS，LS-SVM和RBF-ANN方法對訓練集樣本數據建立多元校正模型，并用預測集評價模型預測能力。建模時使用7-fold交叉驗證，并以交叉驗證誤差均方根（RMSECV）為指標對各模型參數進行優(yōu)化。考察的光譜預處理方法包括無預處理、標準化預處理（即通過預處理使各變量均值為0、標準差為1）、Savitsky-Golay平滑一階導和平滑二階導（窗口大小為7，3階多項式）。PLS建模使用自編的Matlab程序，并對模型中的主成分數進行優(yōu)化。LS-SVM建模使用LS-SVMlab 1.8工具箱^[13]，采用徑向基核函數，以單純形法對參數σ2和正則化參數γ進行優(yōu)化。RBF-ANN建模使用Matlab自帶的神經網絡工具箱，將擬合誤差均方根（RMSEC）的目標設為0，隱含層神經元個數最大值設為30，對徑向基核函數擴展系數（spread）進行優(yōu)化。以擬合相關系數（Rcal）、RMSEC、交叉驗證相關系數（Rval）和RMSECV為指標評價建模效果。以預測相關系數（Rpred）和預測誤差均方根（RMSEP）為指標評價模型預測能力。以樣本標準差與RMSEP的比值，即剩余預測偏差（residual predictive deviation，RPD），評價模型預測誤差的相對大小。全部數據處理均在Matlab 7.9軟件（美國Mathworks公司）中進行。

3 結果與討論

3.1 樣品的紫外光譜 測得全部樣品的紫外光譜見圖1，郁金-梔子蒸餾液在200～300 nm紫外吸收較強，在380 nm以上吸光度趨于0。

3.2 多元校正模型的建立與評價 采用PLS，LS-SVM，RBF-ANN分別對9種成分進行建模，當RMSECV達到最小時，最佳的光譜預處理方法和模型參數見表2～4。各模型的Rcal和Rval基本都在0.9以上，且各成分濃度變化范圍遠大于RMSEC和RMSECV，表明建模效果良好。此外，雖然有文獻報道通過剔除異常樣本或剔除無效的光譜信息變量（即建模波段選擇）可進一步改善建模效果，但本研究中并未發(fā)現明顯異常的樣本，且對紫外波段進行初步優(yōu)選后建模效果并未得到明顯改善，所以本研究使用200～400 nm全波段進行建模，且沒有剔除異常樣本。

根據RMSECV確定的9種成分最佳校正模型及其參數見表5。除了4-亞甲基-異佛爾酮和莪術雙環(huán)烯酮的最優(yōu)模型為RBF-ANN外，其余成分的最優(yōu)模型均為LS-SVM。各成分的RMSEP均小于RMSECV，表明模型具有較好的預測能力，未出現過擬合現象。除吉馬酮以外，其他成分的Rpred都在0.875以上。而吉馬酮的Rpred偏低的原因在于，預測集中吉馬酮含量變化范圍相對訓練集小了很多，雖然RMSEP只有0.610 mg·L-1，但相對該含量變化范圍顯得略大，對于訓練集中吉馬酮的含量變化范圍，該預測誤差已足夠小。另外，由表5可見，除莪術呋喃二烯酮的RPD略小于3以外，其余8個成分的RPD均大于3，表明模型的預測誤差相對于濃度變化范圍足夠小，模型準確度較好，可用于實際分析。

本研究建立的UV分析方法測定值與HPLC測定值之間的相關性，見圖2，圖中訓練集樣本的縱坐標為交叉驗證值，預測集樣本的縱坐標為預測值。2種分析方法間相關性良好，說明本研究建立的方法可在一定程度上代替HPLC分析，在生產過程中快速測定各成分含量。

3.3 快速分析方法在提取過程中的應用 采用本研究建立的UV快速分析方法對不同工藝條件下各成分提取情況進行監(jiān)測。以批次1（正常批次）與批次11（藥材顆粒偏大批次）為例進行了比較，見圖3，當藥材顆粒偏大時，提取液中莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、吉馬酮的含量明顯偏低，原因可能是這些成分親水性相對較弱，從藥材內部擴散到表面是其提取過程中的限速步驟，大顆粒藥材中這些成分擴散相對較慢。本研究建立的分析方法能有效地區(qū)分正常和異常操作批次，可用于提取過程監(jiān)測。

4 結論

醒腦靜注射液提取過程分析方法的建立有助于解決其提取時間長、提取物批次間質量差異大等問題。本研究基于紫外光譜建立了醒腦靜注射液一次提取過程分析方法，能快速、準確地對蒸餾液中異佛爾酮、4-亞甲基-異佛爾酮、莪術雙環(huán)烯酮、莪術烯醇、莪術二酮、莪術酮、莪術呋喃二烯酮、莪術醇、吉馬酮9種成分進行含量測定。該方法與傳統(tǒng)色譜分析方法相比，具有操作簡便、不破壞樣品、無需樣品預處理、不消耗化學試劑、分析成本低的優(yōu)勢，可用于醒腦靜注射液的工業(yè)生產過程，有助于實現提取過程的可視化。

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[責任編輯 孔晶晶]