密銀花對(duì)照藥材標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)的研究

楊健+蔣超+金艷+趙玉洋+袁媛+黃璐琦

[摘要] 建立道地藥材密銀花對(duì)照藥材標(biāo)定技術(shù)規(guī)范，作為密銀花對(duì)照藥材內(nèi)在質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的理論依據(jù)及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為道地藥材現(xiàn)代研究及其特征辨識(shí)提供支撐。收集10批密銀花，根據(jù)2015年版《中國藥典》一部方法進(jìn)行檢驗(yàn)，10批樣品均符合規(guī)定；建立LC-MS指紋圖譜檢測(cè)方法，確定了23 個(gè)共有峰，并根據(jù)對(duì)照品和參考文獻(xiàn)指認(rèn)了8個(gè)共有峰，對(duì)10批密銀花藥材相似度進(jìn)行了考察，其相似度在0.95以上。使用7對(duì)金銀花種質(zhì)鑒定核心引物進(jìn)行SSR指紋圖譜構(gòu)建，10批密銀花指紋圖譜均與河南尖山大毛花種質(zhì)SSR參照?qǐng)D譜差異位點(diǎn)數(shù)為1或0個(gè)，符合密銀花種質(zhì)分子特征。通過結(jié)合DNA指紋圖譜和LC-MS化學(xué)指紋圖譜，建立了首個(gè)中藥道地藥材的標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)的制定為加快中藥標(biāo)準(zhǔn)藥材尤其是道地藥材的評(píng)價(jià)體系的建設(shè)提供了理論依據(jù)及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞] 金銀花； 密銀花； 道地藥材； 指紋圖譜

[Abstract] The calibration technical specification for reference drug of Lonicera japonica cultivated in Xinmi （Mi Yin Hua） established in this study can be used as the theoretical basis and technical standard for internal quality control and evaluation of reference drug of Mi Yin Hua and for modern research and characteristics identification of Dao-di herbs. Based on the quality standard of L. japonica in Chinese Pharmacopoeia （version 2015）， 10 batches samples of Mi Yin Hua also conformed to the stipulation. The LC-MS fingerprint common mode of Mi Yin Hua was obtained， and a total of 23 characteristic peaks were selected as the common fingerprint peaks， and eight common chromatographic peaks in the fingerprint was identified based on standard substances and references. The similarities of 10 batches samples were greater than 0.95. Seven core primers were used to construct SSR fingerprint and the ten batches samples were only 0 or 1 site disaccord with the standard diagram of Jianshan Damaohua germplasm from Xinmi. This paper constructed the first calibration standard of Dao-di herbals by combination of macroscopical identification， SSR fingerprint and LC-MS fingerprint， and the calibration standard provide theoretical basis and technical standard for evaluation system of Dao-di herbals.

[Key words] Lonicera japonica； Mi Yin Hua； Dao-di herbs； fingerprint

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效^[1]。金銀花是常用大品種中藥材，主產(chǎn)于河南、山東、河北等省，其中河南“密銀花”是被廣泛認(rèn)可的道地藥材。早在南宋，《曲洧舊聞》中就明確記載金銀花產(chǎn)于“鄭許田野間”^[2]，鄭許即南宋時(shí)期的鄭州和許州，其與現(xiàn)今河南省鄭州市、許昌市位置大致相當(dāng)。而《救荒本草》記載金銀花生于“輝縣山野中”^[3]，明代輝縣與今之河南省輝縣市位置也大致相當(dāng)?！吨参锩麑?shí)圖考》記載金銀花“皆中州產(chǎn)也”，這里的中州即指今河南省。由此可見，宋、明、清三代均有文獻(xiàn)明確記載河南產(chǎn)金銀花，且《植物名實(shí)圖考》中提到“茶肆以新販到金銀花為貴，皆中州產(chǎn)也”^[4]，可依此判斷當(dāng)時(shí)已經(jīng)認(rèn)為河南的金銀花是質(zhì)優(yōu)效佳之品。密銀花的明確記載已從南宋延續(xù)至今，古代本草中比較明確的產(chǎn)地有河南省的鄭州市、許昌市和輝縣市，位于東經(jīng)115°北緯35°左右的區(qū)域。

道地藥材是中醫(yī)藥偉大寶庫中重要的組成部分，在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求的基礎(chǔ)上，建立對(duì)照道地藥材是實(shí)現(xiàn)道地藥材特征辨識(shí)的必要前提。對(duì)道地藥材的評(píng)價(jià)應(yīng)是在符合《中國藥典》要求的基礎(chǔ)上，對(duì)優(yōu)質(zhì)藥材進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，但現(xiàn)有的化學(xué)對(duì)照品、對(duì)照藥材等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已不能滿足道地藥材評(píng)價(jià)的需求，因此需要建立更高要求的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本研究采集來自金銀花傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)——河南省新密市的10批密銀花，分析研究各批次樣品的特征特性，建立密銀花的DNA指紋圖譜和LC-MS化學(xué)指紋圖譜，制定了密銀花對(duì)照藥材標(biāo)定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，作為密銀花對(duì)照藥材內(nèi)在質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的理論依據(jù)及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為道地藥材現(xiàn)代研究及其特征辨識(shí)提供支撐。endprint

1 材料

ACQUITY UPLCTM I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站），Xevo G2-XS QTOF四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters公司，ESI電噴霧離子源），SB-800 DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），New Classic MS-S電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]，Eppendorf 5810R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

ABI 9700 PCR儀（ABI公司），DYY-12電泳系統(tǒng)（北京市六一儀器廠），GBOXHR紫外凝膠成像分析儀（英國Syngene公司），MM400混合型球磨儀（德國Retsch公司），Eppendorf微量移液器（德國Eppendorf公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），CSIOI-1D電熱鼓風(fēng)干燥箱（中國重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），AMFI-5-P實(shí)驗(yàn)室級(jí)專用純化水機(jī)（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），Bio-rad電泳儀（美國Bio-Rad公司），MDF-192低溫冰箱（日本 SANYO公司）。

色譜甲醇和色譜乙腈（美國Fisher Scientific公司）；甲酸（LC-MS分析用，美國Fisher Scientific公司），15 mL離心管（NEST），0.22 μm PTFE濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-201505）、木犀草苷（批號(hào)111720-201609）及對(duì)照藥材金銀花（批號(hào)121060-201608）均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)B213963-201507）、四乙酰開聯(lián)番木鱉苷（批號(hào)B25441-201503）、馬錢苷（批號(hào)B20822-201503）、獐牙菜苷（B21643-201507）、斷氧化馬錢子苷（B30116-201503）、異槲皮苷（B21529-201509）、異綠原酸 A（B21539-201503）均購自上海源葉生物科技有限公司。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、聚乙烯比咯烷酮-40 （PVP-40）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）均購自Amersco公司、硝酸銀購自中國醫(yī)藥集團(tuán)。

瓊脂糖（Promega公司），溴化乙錠（Fluka公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），500 bp DNA Markar（Takara公司），引物（生工（北京）有限公司合成），溴酚藍(lán)（上海生物工程公司），TEMED，β-巰基乙醇，三氯甲烷（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），甲醛（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），異戊醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）均為國產(chǎn)分析純等。

本實(shí)驗(yàn)所用密銀花藥材（10批）于2014年5月采自河南省鄭州市新密市尖山鄉(xiāng)，生長(zhǎng)環(huán)境為山地，陽坡，土壤為砂壤土，自然降水（圖1）。GPS信息為，緯度34° 36′ 30.3″，經(jīng)度113° 17′ 12.2″，高度 551 m，符合古代本草明確記載密銀花產(chǎn)地；由河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒別，符合傳統(tǒng)密銀花性狀特征。

2 方法與結(jié)果

2.1 《中國藥典》2015年版一部金銀花項(xiàng)下的項(xiàng)目的檢驗(yàn)

性狀鑒定、顯微和薄層色譜鑒別、水分、總灰分及酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、綠原酸和木犀草苷的含量測(cè)定按《中國藥典》2015年版一部金銀花項(xiàng)下的規(guī)定檢驗(yàn)^[5]，10批次樣品均符合規(guī)定。

2.2 道地藥材性狀特征

花蕾呈棒狀，無開朵，表綠白色，密被短柔 毛，質(zhì)稍硬，用手均勻撒下，花與花可搭成十字架；氣清香，味淡，微苦，具有明顯的傳統(tǒng)密銀花性狀特征^[6-7]。

2.3 DNA指紋圖譜研究

2.3.1 總DNA提取

用硅膠干燥材料，用改良CTAB 法提取總DNA^[8]。測(cè)量總DNA的吸光度A并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 DNA身份證

利用 7 對(duì)金銀花種質(zhì)鑒定核心引物（A，B，C，D，E，F(xiàn)，G），進(jìn)行PCR擴(kuò)增^[9]（表1）。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：19.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，2.5 U rTaq DNA聚合酶[寶生物工程（大連）有限公司]0.2 μL，1 μL 50～100 mg·L-1DNA模板。反應(yīng)在ABI公司的9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，46～51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)多態(tài)性條帶（圖2）。

通過與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，獲得DNA身份證：A11010000B00000100110C0001010D010011E10111011110F000000110G00010101。采用引物對(duì)16擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（450±5），250，230，（160±5） bp；采用引物對(duì)17擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為220，150，140，（130±5） bp；采用引物對(duì)18擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為230，200，160 bp；采用引物對(duì)23擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（600±10），280，270，170，（160±5） bp；采用引物對(duì)24擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為（550±5），350，300，（280±5），250，240，220，190 bp；采用引物對(duì)29擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為200，（170±5），（150±5） bp；采用引物對(duì)30擴(kuò)增得到的電泳圖譜中的特異性條帶為280，260，（235±5），（220±5） bp；所測(cè)樣品SSR指紋圖譜與河南尖山大毛花種質(zhì)SSR參照?qǐng)D譜差異位點(diǎn)數(shù)為1或0個(gè)，符合密銀花種質(zhì)分子特征。endprint

2.4 LC-MS特征圖譜的研究

2.4.1 對(duì)照品溶液制備

分別取綠原酸、新綠原酸、裂馬錢苷、馬錢苷、獐牙菜苷、斷氧化馬錢子苷、異槲皮苷和異綠原酸 A適量，精密稱定，加甲醇分別制成約100 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備

稱取密銀花樣品粉末（過4號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，超聲處理（功率 140 W，頻率 42 kHz）30 min；放冷，再稱重，70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，以1萬 r·min-1離心15 min，取上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters，USA），流動(dòng)相0.1%甲酸-水溶液（A） - 0.1%甲酸-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5%～10% B； 3～13 min，10%～40% B； 13～18 min，40%～80% B），流速0.50 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

2.4.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500；干燥氣體：氮?dú)猓髁? L·min-1；干燥氣溫度220 ℃；毛細(xì)管電壓（capillary voltage） 4.0/5.5 kv （+/-）；錐孔電壓（sampling cone） 35/50 eV （+/-）；萃取錐孔（extraction cone） 3 eV；離子源溫度（source temperature） 100 ℃；脫溶劑氣溫度（desolvation temperation） 350 ℃；反向錐孔氣流（cone gas flow） 50 L·h-1；脫溶劑氣（desolvation gas flow） 650 L·h-1；低質(zhì)量區(qū)分辨率（LM resolution） 4.7 eV；高質(zhì)量區(qū)分辨率（HM resolution） 15 eV；碰撞氣體氬氣，碰撞能量10 eV；碰撞池入口（collision cell entrance） 2 eV；碰撞池出口（collision cell exit） -10 eV；碰撞氣流速（collision gas flow） 0.5 mL·min-1；碰撞能量：低能量6 V，高能量20～60 V。

2.4.5 方法學(xué)考察

2.4.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一S1樣品供試品溶液，上述色譜和質(zhì)譜條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.69%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD<2.1%，表明進(jìn)樣和儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一S1樣品供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 h按上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.1%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD<2.4%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品粉末 6 份，按2.4.2項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，再按上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.4%，共有峰相對(duì)峰面積RSD<2.9%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.6 指紋圖譜的建立與共有峰的確定

按2.4.2項(xiàng)下方法制備10批次的密銀花供試品溶液，2.4.3項(xiàng)色譜條件及2.4.4項(xiàng)質(zhì)譜條件下測(cè)得密銀花UPLC-MS指紋圖譜。比較10批供試品的色譜圖，確定了 23 個(gè)共有峰（圖2）。通過UPLC-MS/MS離子掃描獲得的指紋圖譜結(jié)構(gòu)信息并結(jié)合對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，確定其中8個(gè)指紋成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為1（新綠原酸）、3（綠原酸）、4（四乙酰開聯(lián)番木鱉苷）、5（馬錢苷）、7（獐牙菜苷）、9（斷氧化馬錢子苷）、10（異槲皮苷）和12（異綠原酸 A）。

以3號(hào)峰（綠原酸）作為參照峰，計(jì)算各指紋峰面積與同一圖譜中參照峰的峰面積比值，得到相對(duì)峰面積；將所得10批密銀花藥材的上述信息數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版），產(chǎn)生對(duì)照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正及色譜峰匹配得出不同密銀花藥材的相似度（表2）。10批密銀花藥材的相似度結(jié)果均大于0.95，說明10批密銀花藥材的代謝輪廓比較接近，區(qū)域內(nèi)藥材質(zhì)量差異較小，化學(xué)成分比較穩(wěn)定。

3 討論

本研究在《中國藥典》2015年版一部金銀花標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了DNA指紋圖譜和LC-MS化學(xué)指紋圖譜，按擬定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)10批密銀花藥材，結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)適宜作為道地藥材密銀花對(duì)照藥材的標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)。作為首個(gè)中藥道地藥材的標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)的制定為加快中藥標(biāo)準(zhǔn)藥材尤其是道地藥材的評(píng)價(jià)體系的建設(shè)提供了理論依據(jù)及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為道地藥材現(xiàn)代研究及其特征辨識(shí)提供技術(shù)支撐。

雙分子標(biāo)記是基于 DNA分子標(biāo)記和代謝標(biāo)識(shí)物相結(jié)合的分析方法，在分子水平同時(shí)研究中藥的種類、區(qū)別和質(zhì)量差異的一種分子標(biāo)記方法^[10]。雙分子標(biāo)記技術(shù)利用DNA分子標(biāo)記分析中藥物種的遺傳信息分析，代謝標(biāo)識(shí)物的定性及定量進(jìn)行中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)，從而達(dá)到中藥“真?zhèn)巍?yōu)劣”二維分子評(píng)價(jià)的目的。本研究使用雙分子標(biāo)記的方法同時(shí)從遺傳指紋和代謝標(biāo)識(shí)指紋圖譜2個(gè)方面對(duì)道地藥材密銀花進(jìn)行標(biāo)定，從而確定其標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)。

本研究通過采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了道地密銀花藥材的總離子流色譜指紋圖譜，選擇質(zhì)譜（MS）作為樣品測(cè)定的檢測(cè)器，可以有效的克服紫外檢測(cè)器（UV）的局限性以及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）的不穩(wěn)定性，并且其具有更加準(zhǔn)確的定性能力，能夠最大限度的反應(yīng)藥材的化學(xué)指紋特性。

通過使用SSR指紋圖譜作為DNA分子身份證，使用7對(duì)核心引物標(biāo)定10批密銀花藥材，其SSR指紋圖譜結(jié)果均與河南尖山野生金銀花種質(zhì)SSR參照?qǐng)D譜差異位點(diǎn)≤1個(gè)，表明通過SSR指紋圖譜技術(shù)能準(zhǔn)確標(biāo)定道地藥材密銀花的DNA特征，結(jié)合化學(xué)指紋圖譜形成的雙分子標(biāo)記可準(zhǔn)確標(biāo)定中藥材，建立道地藥材標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint