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    河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病菌的分子鑒定與致病力

    2017-10-27 12:10:33婁喜艷向文華劉冬梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年16期
    關(guān)鍵詞:分子鑒定病害防治

    婁喜艷 向文華 劉冬梅

    摘要:以河南省民權(quán)縣花園鎮(zhèn)棉花枯萎病病株為材料,采用連續(xù)稀釋法和單孢分離法得到枯萎菌單孢菌株,對該菌株進行形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析。采用真菌通用引物對所分離的菌株rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)PCR擴增得到 544 bp 大小的片段(GenBank登錄號為FJ715505),BLASTn分析結(jié)果顯示,該序列與其他枯萎菌的ITS序列具有很高的同源性,將該ITS序列與GenBank中搜索到的同源性序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,確定商丘地區(qū)棉花枯萎菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),對該分離棉花枯萎菌菌株進一步進行致病力生物學鑒定。

    關(guān)鍵詞:棉花枯萎菌;單孢分離;ITS序列;致病力;分子鑒定;生物學鑒定;病害防治

    中圖分類號: S4356212+4文獻標志碼:

    文章編號:1002-1302(2017)16-0086-03

    收稿日期:2016-08-04

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31571997);河南省高等學校重點科研項目(編號:16A210036)。

    作者簡介:婁喜艷(1984—),女,河南商丘人,碩士,講師,從事植物生理學教學與研究。E-mail:lounan2005@163com。

    棉花枯萎菌學名尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),屬半知菌亞門鐮刀菌屬,它是棉花上的重要病害,過去曾作為國內(nèi)重要植物檢疫對象,至今在有些?。ㄊ小^(qū))仍作為植物檢疫對象。枯萎菌引起的枯萎病在棉花苗期和現(xiàn)蕾期前后常引起大量死苗,殘存的病株結(jié)鈴明顯減少,鈴質(zhì)量減輕直接影響棉花生產(chǎn)和棉農(nóng)收入。此病最早于1892年在美國發(fā)現(xiàn),以后隨棉種調(diào)運而迅速擴散蔓延,目前在世界各主要產(chǎn)棉國均有發(fā)生。我國于1934年在江蘇南通和上海川沙等縣(市)最早發(fā)現(xiàn)此病,20世紀七八十年代初期,遍布全國各主要產(chǎn)棉區(qū),并形成嚴重危害。20世紀80年代中期以后,隨大量抗病品種的推廣,枯萎病在我國南北棉區(qū)基本得到控制,但局部棉區(qū)發(fā)生仍然較重,其中特別是新疆棉區(qū)常造成大片死亡,目前仍是棉花生產(chǎn)上的一個重要問題。本試驗采集河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病病株,分離棉花枯萎菌單孢菌株,進行菌落形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析,并采用分子生物學的方法對該菌株核糖體DNA ITS序列進行鑒定,為進一步的棉花枯萎病的鑒定及防治提供科學的理論依據(jù)。

    1材料與方法

    11材料

    河南省民權(quán)縣采集的棉花枯萎病病株。棉花感病品種為冀棉11,由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。

    12方法

    121棉花枯萎菌的分離和純化

    制備PDA培養(yǎng)基,倒平板;棉花病枝經(jīng)自來水沖洗,將棉花莖剝皮,在超凈工作臺上,將其切成長度為10~15 cm的圓柱體,用75%乙醇消毒 30 s 左右,無菌水沖洗,然后用01%氯化汞進行滅菌1 min,用無菌水沖洗2~3次;圓柱體切成4個切片或小薄片,每塊組織均應為病健相間變色的維管束組織;放入培養(yǎng)基平板上,輕輕按壓,每皿4塊,排放均勻;28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7~8 d。采用連續(xù)稀釋法[3]和單孢分離法[4],純化分離菌株。

    122棉花枯萎病菌形態(tài)學鑒定

    肉眼觀察棉花枯萎菌菌株的菌落形態(tài)、生長狀況;制備水裝片,顯微觀察棉花枯萎菌菌絲、分生孢子、分生孢子梗等特征。

    123棉花枯萎菌分子生物學鑒定

    采用改良的CTAB的方法[5-6]提取枯萎菌DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整度;采用真菌核糖體ITS區(qū)段的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),對枯萎菌菌株進行PCR擴增。PCR擴增反應液25 μL,05 U/μL Taq聚合酶02 μL,dNTP的濃度為2 mmol/L;引物濃度為2 μmol/L,模板DNA 25 ng。反應條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性45 s,50 ℃退火45 s,72 ℃ 延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳分離,膠回收試劑盒回收產(chǎn)物,T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

    124數(shù)據(jù)分析

    通過軟件DNAMAN進行序列同源性分析。用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://wwwncbinlmnihgov/)進行BLAST分析,從GeneBank中查找所需物種的不同地區(qū)枯萎菌ITS基因序列,通過MEGA 40以最大似然法構(gòu)建進化樹。

    125分離棉花枯萎菌菌株致病性分析

    棉花枯萎菌接種于查氏液體培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫搖床培養(yǎng)14 d左右;4層滅菌紗布進行過濾枯萎菌培養(yǎng)液。血球計數(shù)板測量枯萎菌的小孢子密度,稀釋至100萬個/mL;當棉花幼苗生長到1葉1心時,將培養(yǎng)幼苗的塑料杯從托盤上拔起,進行斷根,放在枯萎菌菌液中進行侵染,感染后10~20 d開始觀察記錄。

    2結(jié)果與分析

    21枯萎菌菌落形態(tài)檢測結(jié)果

    分離培養(yǎng)的枯萎菌,菌絲白色,菌落蓬松,長勢迅速??菸【牟≡鸀榧怄哏牭毒?,萎蔫專化型,屬于半知菌亞門鐮刀屬。病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長時,菌絲體呈絨毛狀或棉絮狀,菌落初為白色,后變淡紫色至紫色(圖1)。

    22枯萎菌顯微形態(tài)學鑒定

    挑去分離的棉花枯萎菌菌絲制作水裝片于顯微下觀察,該菌株產(chǎn)生大型分生孢子,呈鐮刀形彎曲,具有3~5個分隔;產(chǎn)生的小型分生孢子多數(shù)為單孢,卵圓形。與鐮刀分類系統(tǒng)比較,確定為尖孢鐮刀菌。

    23枯萎菌分子生物學鑒定

    231ITS通用引物對菌株的PCR擴增

    從圖2可以看出,以ITS1、ITS4為引物的PCR擴增產(chǎn)物條帶在500~750 bp之間,擴增條帶清晰、整齊。

    232鐮刀菌rDNA ITS區(qū)序列比對

    商丘的棉花枯萎菌菌株ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物測序得到544 bp的片段,GenBank序列登記號為FJ715505。將該棉花鐮刀菌序列和來自世界各地(包括中國在內(nèi))的20個具有代表性的鐮刀菌屬ITS序列進行比較,構(gòu)建棉花鐮刀菌的系統(tǒng)進化樹(圖3)。從圖4可以看出,在全世界范圍內(nèi),河南商丘棉花鐮刀與印度、馬來西亞、希臘鐮刀菌聚在一起,親緣很近,而與美國北卡州、法國、墨西哥、澳大利亞菌株親緣關(guān)系稍遠,與南韓、哥倫比亞和意大利的親緣關(guān)系最遠;在中國范圍內(nèi),與海南、南寧、貴陽、北京聚在一起,而與臺灣、廣州、杭州、雅安相距較遠,和最近的泰安菌株相距最遠。綜上結(jié)果分析,棉花鐮刀菌屬親緣關(guān)系遠近和地緣遠近無密切相關(guān)性。

    24棉花枯萎菌致病力分析

    分離的商丘枯萎菌接種棉花幼苗,對其致病力進行觀察分析。幼苗發(fā)病時葉片最先表現(xiàn)出癥狀,葉片邊緣或主脈呈現(xiàn)淡黃色不規(guī)則斑塊,隨后病斑逐漸擴大,變成褐色干枯并逐漸向上發(fā)展,最終侵染入植株的維管束系統(tǒng),使整株植株發(fā)病死亡(圖4)[8],與田間發(fā)病結(jié)果一致(圖1-a),均為青枯型。

    3討論與結(jié)論

    核糖體DNA(rDNA)ITS序列的保守性作為植物病原菌的分子鑒定檢測手段,已經(jīng)在植物病害鑒定的研究中得到廣泛[CM(25]應用。ITS是介于 18S、58S、28S rDNA 之間的區(qū)域, 該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快,在真菌種間存在豐富的變異,在種內(nèi)不同菌株間又高度保守,該區(qū)域DNA核苷酸序列的比較有助于相似種的鑒定。ITS序列已成為系統(tǒng)與進化生物學研究中的重要分子標記,并被廣泛應用于親緣關(guān)系較近分類群的系統(tǒng)發(fā)育研究[9]。因此,在對棉花枯萎菌形態(tài)學研究的基礎上進行ITS序列測定可以作為棉花枯萎菌鑒定的輔助手段,為其檢測提供快速有效的途徑。而進一步利用ITS序列設計種的特異性PCR引物可對棉花枯萎菌進行快速鑒定。

    本試驗采集河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病病株,分離出1株棉花枯萎菌單孢菌株進行菌落形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析,并采用分子生物學的方法對該菌株核糖體DNA ITS序列進行鑒定,結(jié)果表明該菌株為尖孢鐮刀菌(F oxysporum),該試驗將為進一步的棉花枯萎病的鑒定及防治提供科學的理論依據(jù)。

    參考文獻:

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    [4]謝寶貴 倒置顯微鏡單孢分離法[J] 中國食用菌,1996(1):15-16

    [5]莊彩云,李潞濱,胡陶,等 適用于rDNA ITS分析的蘭屬茵根真菌培養(yǎng)及DNA提取方法[J] 北京農(nóng)學院學報,2007,22(3):4-6[HJ17mm]

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    [8]劉澤輝,武剛,陸進善,等 海陸雜交所選育的長絨棉抗枯萎病研究[J] 新疆農(nóng)業(yè)科學,2007,44(4):445-449

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