木本植物組織培養(yǎng)過程中褐變現(xiàn)象及控制措施的研究進展

肖小君　羅潼　王芳

摘要：褐變是組織培養(yǎng)過程中的一大難題，與草本植物相比，木本植物更易發(fā)生褐變。本文結(jié)合近年來的相關(guān)研究成果，對木本植物組培過程中褐變發(fā)生的機制、影響因素以及調(diào)控措施等問題進行綜述，以期為今后木本植物組織培養(yǎng)方面的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：木本植物；組織培養(yǎng)；褐變；影響因素；控制措施

中圖分類號： S184文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0020-04

收稿日期：2017-02-24

基金項目：四川省教育廳科研創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（編號：14TD0025）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：201510640005）；內(nèi)江師范學(xué)院植物學(xué)重點學(xué)科。

作者簡介：肖小君（1982—），女，四川岳池人，碩士，助理研究員，主要從事植物生理學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究。Tel：（0826）2343020；E-mail：qianqianxxj@126com。

通信作者：王芳，碩士，高級實驗師，主要從事生物試驗技能研究。Tel：（0826）2343020；E-mail：mmxxwangfang@sinacom。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物組培技術(shù)的應(yīng)用也日漸成熟，尤其在快速繁殖優(yōu)良品種、種質(zhì)資源保存及基因工程等領(lǐng)域取得了較高成就，推動了社會經(jīng)濟的快速發(fā)展。盡管植物組培技術(shù)的研究已相當(dāng)成熟，但在試驗和生產(chǎn)過程中仍然存在三大難題，其中褐變問題尤為突出。木本植物具有生長周期長、經(jīng)濟效益好、遺傳雜合率高等特點，利用木本植物進行組織培養(yǎng)，不但促進了觀賞苗木和果樹等的脫毒及快速繁殖，同時在保護生態(tài)平衡、改良沙荒土壤及城市綠化等方面都起著重要作用。但在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，對木本植物進行組織培養(yǎng)時褐變現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，導(dǎo)致其產(chǎn)業(yè)化推廣難度較大。本文結(jié)合近年來的相關(guān)研究成果，對木本植物組織培養(yǎng)過程中褐變發(fā)生的機制、影響因素及調(diào)控措施等研究進展進行綜述。

1褐變機制

接種材料被切割后，切口附近細(xì)胞受損，組織間的分隔效應(yīng)消失，使酚類化合物、酚氧化酶釋放溢出。在適宜的條件下，酚氧化酶、酚類物質(zhì)（底物）和氧氣聚合，發(fā)生氧化反應(yīng)，生成褐色物質(zhì)和水，褐色物質(zhì)逐漸擴散至培養(yǎng)基，同時抑制其他酶的活性，使外植體組織被毒害并導(dǎo)致外植體發(fā)生死亡的現(xiàn)象即為褐變[3-4]。褐變可分為非酶促褐變、酶促褐變，其中酶促褐變?yōu)橹饕绞健?/p>

非酶促褐變。即沒有酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，主要是由于植物體細(xì)胞在遇到失水、鹽分過高、低溫、衰老等不利條件的脅迫時，使細(xì)胞程序化死亡或自然死亡[5]。如采摘后的荔枝果皮因失水使其pH值升高，引起果皮迅速褪色而導(dǎo)致的褐變。

酶促褐變。酶促褐變主要是由酶的催化導(dǎo)致的，酶、底物和氧是酶促褐變的3個要素，酚類物質(zhì)是其反應(yīng)底物。褐變的關(guān)鍵酶有多酚氧化物酶（PPO）、過氧化物酶（POD）或苯丙氨酸解氨酶（PLA）。其中以PPO為主，可催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)而引發(fā)褐變。酶促褐變的3種假說[8]認(rèn)為：沒有任何損傷的完好植物組織，酚類物質(zhì)存在于液泡內(nèi)，PPO存在于各質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，PPO區(qū)域性的存在將底物和PPO由質(zhì)膜分隔開。當(dāng)植物體受到機械損傷時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，打破了區(qū)域性的限制，酚酶和酚類物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成醌類物質(zhì)和水，經(jīng)非酶促反應(yīng)發(fā)生聚合，再形成黑褐色物質(zhì)，使得外植體發(fā)生褐變。

2影響褐變的因素

木本植物組織培養(yǎng)過程中，導(dǎo)致褐變發(fā)生的因素較多：外植體的取材部位和采集時間、基因型、材料大小、生理狀態(tài)、酚類物質(zhì)的含量、培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式、條件，以及材料的預(yù)處理、外加激素配比差異等均會不同程度地導(dǎo)致褐變的發(fā)生[8]。

21植物材料

211外植體的種類或基因型植物的不同品種、同一植物的不同部位在組織培養(yǎng)過程中會發(fā)生不同程度的褐變。由周俊輝等對園藝植物褐變現(xiàn)象的研究可知，存在褐變現(xiàn)象的木本植物有阿月渾子、東北紅豆杉、軟棗獼猴挑、牡丹、核桃、荔枝、蘋果、無花果、銀杏等[3]。

木本植物較易發(fā)生褐變，是因它們含有較高含量的木質(zhì)素、單寧等物質(zhì)。酚類的糖苷化合物的合成是以木質(zhì)素、單寧或色素等物質(zhì)為前體的，因木本植物含有較高含量酚類化合物，容易導(dǎo)致褐變發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，對核桃外植體進行組織培養(yǎng)時，不僅在初代培養(yǎng)會發(fā)生褐變，在愈傷組織形成后也會發(fā)生褐變，嚴(yán)重時導(dǎo)致培養(yǎng)材料死亡[4]，究其原因，在于單寧含量較多。對柑橘胚性愈傷組織褐變的研究發(fā)現(xiàn)，寬皮橘類褐變嚴(yán)重，甜橙類次之，葡萄柚、橘橙介于兩者之間，說明褐變發(fā)生與品種、基因型有一定關(guān)系；而對9種柑橘胚性愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的柑橘總酚含量不同，同一種類不同品種間也有差異，因而褐變程度也有差異[9]。

212外植體大小及受傷害程度總體來說，外植體較小的材料相對較大的材料更易發(fā)生褐變。同時切口的大小也會影響褐變的程度，原因在于切口的大小決定酚類物質(zhì)的被氧化面大小。金冠蘋果莖尖在05 mm以下時發(fā)生嚴(yán)重的褐變，而長度達到5～15 mm時不易褐變，褐變死亡率低于15%[10]。愈傷組織繼代時培養(yǎng)材料過大或過小都易發(fā)生褐變，但以07～08 cm3大小效果最佳[11]。巨桉葉片切割時損傷面積大，所產(chǎn)生的酚類較莖節(jié)多，褐變較重[3]。

外植體組織受損害程度會直接影響褐變，處理時將傷口切割平整并減小受損面積可有效減輕褐變。除物理損傷會引起褐變外，在滅菌消毒處理時各種化學(xué)劑的使用也會引發(fā)外植體褐變。不同類別消毒劑對褐變發(fā)生的程度影響不一。氯化汞對外植體傷害比較輕，褐變率顯著低于次氯酸鈉處理的[11-12]。乙醇消毒滅菌效果較好，但對外植體傷害較大。此外，褐變與消毒時間有關(guān)，消毒時間越長，外植體材料越易發(fā)生褐變，因此控制好消毒時間，才能降低褐變發(fā)生的概率，保證外植體的存活率。

213外植體的生理狀態(tài)及取材時期酚類物質(zhì)的含量及PPO的活性因外植體的生理狀態(tài)有所差異[14]。一般情況下，褐變隨植物材料的年齡增加或木質(zhì)化程度加大而加重。幼齡外植體材料褐變程度較輕，莖尖、葉片等高度分化的組織與成齡材料容易褐變。這在桉樹[15]、山核桃[16]、黃連木[17]等植物研究中得到了進一步證實。此外，取材時期會影響褐變。夏季的溫度較高，植株代謝活動旺盛，PPO的活性高，褐變率隨之升高，秋冬季反之，褐變不易發(fā)生[18]。因此梨[19]、紫枝玫瑰[20]、阿月渾子[21]等木本植物的取材以溫度低的冬春季較好，褐變率相對較低。endprint

22植物材料的預(yù)處理方式

如果在材料的生長季節(jié)取材，可經(jīng)水培處理，隨著培養(yǎng)時間的增加，褐變率呈下降態(tài)勢[22]。也可用清水流動沖洗外植體，再經(jīng)5 ℃處理12～24 h，消毒后將外植體接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，再取出外植體，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆绞教幚砗螅D(zhuǎn)入適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，可以降低褐變率。在外植體接入培養(yǎng)基之前，進行適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砜梢种粕n溪梨組織培養(yǎng)褐變的發(fā)生[19]。

23培養(yǎng)基

不同培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不同，同種外植體或不同外植體在同一培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)也有所差異。因此，培養(yǎng)基的種類、成分等選擇對褐變的發(fā)生有一定影響。

231培養(yǎng)基的成分用于組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類各不相同，如MS、WPM、DKW、B5、N6因成分等特點各有所異，引起的組織褐變程度也有差異。當(dāng)無機鹽濃度過高時，會使酚類物質(zhì)溢出，引起褐變的發(fā)生，乃至加劇褐變發(fā)生程度。通過降低離子濃度，尤其是Mn2+、Fe2+、Cu2+濃度，同時降低酶的活性、減少底物的溢出，可抑制酚類物質(zhì)的氧化，降低褐變概率[23-24]。核桃[3]、蘋果[22]、櫻花[25]、桑樹[26]等木本植物以1/2MS或1/2DKW培養(yǎng)基控制褐變最佳，但紅豆杉[27-28]、銀杏[29]等植物選擇高鹽的MS培養(yǎng)基較好。可見，抑制褐變可通過選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或鹽濃度來控制。

232培養(yǎng)基的狀態(tài)就防褐變的效果來說，紙橋培養(yǎng)基的效果優(yōu)于液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)又比半固體培養(yǎng)基好，固體培養(yǎng)基效果最差[22]。液體培養(yǎng)基能夠高速擴散褐變產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，及時減緩有毒物質(zhì)對培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基的毒害，因而減輕褐變。紙橋培養(yǎng)基表面的濾紙可在一定程度上隔離外溢的毒害物質(zhì)，從而達到清潔培養(yǎng)基、減輕褐變的目的[30]。半固體培養(yǎng)基中則是使用低濃度瓊脂，使愈傷組織位于培養(yǎng)基表面，通過這種培養(yǎng)系統(tǒng)使褐變產(chǎn)生的毒害物質(zhì)得到擴散，從而減輕毒害作用。用低氧的半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)酚類化合物含量較高的核桃外植體，發(fā)現(xiàn)核桃外植體的褐變得到有效的抑制。

233培養(yǎng)基的硬度培養(yǎng)基硬度隨瓊脂用量的加大而增加，而適當(dāng)?shù)挠捕瓤山档秃肿兟省Ｔ谏?、華蓋木的組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基硬度大，褐變率顯著偏低；隨著培養(yǎng)基硬度的減小，組織褐變現(xiàn)象加重[26，31-32]。因此可知，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值降低PPO的活性以及對底物的利用率來減輕褐變。

234激素各種激素的種類、濃度也會使外植體發(fā)生一定程度的褐變。細(xì)胞分裂素KT、BA等不僅可以促進酚類化合物的合成，還會激發(fā)多酚氧化酶的活性，加劇褐變[33]。在茶樹的組織培養(yǎng)[34]、薄殼核桃的莖尖培養(yǎng)[35]中，用高濃度的細(xì)胞分裂素接種外植體的褐變率較低濃度的高，差異極顯著。而生長素類如NAA、2，4-D等可阻礙多酚的合成，延遲褐變的出現(xiàn)。生長調(diào)節(jié)劑的適當(dāng)配比或不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對外植體褐變有不同程度的減輕或抑制作用，如10 mg/L BA、05 mg/L IAA配比的生長調(diào)節(jié)劑可有效控制沙棘組織培養(yǎng)過程中的褐變[36]。

24培養(yǎng)條件

241溫度對玫瑰的研究顯示，經(jīng)過低溫處理后，在外植體的啟動率不受影響的基礎(chǔ)上，褐變可得到有效的抑制[20]。此外，溫度變化可調(diào)控酶的活性，溫度較低時褐變現(xiàn)象顯著減輕，例如板栗的愈傷組織在19 ℃下培養(yǎng)時褐變較輕[37]，無花果在10 ℃培養(yǎng)條件下外植體褐變率最低[38]?？赡苁且驗榈蜏卦谝欢ǔ潭壬辖档土薖PO的活性，同時控制了酚類物質(zhì)的氧化。

242光照將桉樹的外植體通過全光照、全暗培養(yǎng)處理10 d，結(jié)果表明，全光照處理下褐變率較高，暗培養(yǎng)處理效果較好[15]。研究發(fā)現(xiàn)，麻櫟經(jīng)過7 d遮光培養(yǎng)后截取的莖段外植體褐變率最低，萌發(fā)率最高[39]。而不經(jīng)光照處理的情況下，黃連木莖段培養(yǎng)第2天即有褐變現(xiàn)象發(fā)生，但經(jīng)過暗處理3 d后，再進行光照培養(yǎng)，褐變則在第6天出現(xiàn)[17]，說明暗處理的方式對外植體褐變起到了有效的抑制作用。暗處理之所以能控制外植體褐變，其原因可能是光照使PPO的活性提高，促進多酚物質(zhì)的氧化，而暗處理在一定程度上降低PPO活性，使褐變現(xiàn)象的出現(xiàn)得到推遲或減輕。

3褐變的控制措施

植物組織培養(yǎng)過程中的褐變現(xiàn)象是普遍的，而木本植物組織培養(yǎng)中的褐變問題最嚴(yán)重。因而可見，控制或消除褐變是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。從理論上講，酶促褐變是外植體發(fā)生褐變的主要類型，可通過除去氧、減少中間產(chǎn)物、抑制相關(guān)酶活性等措施來控制酶促褐變的發(fā)生。在培養(yǎng)過程中，也可向培養(yǎng)基中加入一些化學(xué)添加劑來抑制褐變，但不同種類或基因型植物的PPO具有或多或少的差異，因此應(yīng)用于植物材料的抗褐變劑種類不同。在實際的操作中，可從以下幾個方面進行考慮。

31選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w

引起褐變的因素很復(fù)雜，植物類別、外植體的生長部位、取材季節(jié)及生理狀態(tài)的不同，褐變程度也會有所區(qū)別。4年生的元寶楓外植體存活率為480%，而20年生的存活率為477%；10月采集的當(dāng)年生的已木質(zhì)化枝條接種后的褐變率為100%，而在4月枝條生長旺季取材的褐變率相對較低，6月次之[40]。酚類物質(zhì)含量因外植體類型的不同而有所差別，樹齡越小、越嫩的組織酚類物質(zhì)含量越少，培養(yǎng)時越不易褐變。莖段褐變率最高，嫩芽的褐變率最低，嫩葉幾乎不存在褐變現(xiàn)象[41]。材料的生理狀態(tài)不同，接種后的褐變程度也不同，應(yīng)盡量避免高溫季節(jié)取材[20]，以春季具有較強分裂能力的外植體較為適宜，這與多酚氧化酶的活性有關(guān)。取材時，還應(yīng)注意外植體的基因型，在平陰玫瑰的組織培養(yǎng)中，不同品種或同一品種不同部位的褐變程度也有顯著差別[42]，因此選擇較難發(fā)生褐變的植物種類作為外植體較好。

32對外植體材料進行預(yù)處理

通過預(yù)處理可減輕酚類對外植體的毒害[31]，如采用低溫培養(yǎng)或處理[20，39]。還有利用抗氧化劑進行預(yù)處理也可減輕酚類的毒害：山茶花用1%維生素C（VC）浸泡后，無論是莖段還是莖尖均比對照褐變程度輕[43]；白玉蘭用1 000 mg/L檸檬酸處理的褐變率為10%，用1 000 mg/L Na2S2O3處理的褐變率為30%[18]。此外，還可對外植體進行適時的水培處理[22]，也可根據(jù)不同的材料，選擇不同的消毒處理時間[34，44]，但消毒時間過長，會使細(xì)胞死亡而發(fā)生褐變[45]。不同的消毒劑對外植體褐變程度也會有影響，具有氧化性的H2O2、NaClO引起的褐變程度較重，非氧化性的AgNO3、HgCl2引起的褐變程度較輕[46]。在常規(guī)的滅菌消毒過程中，褐變的發(fā)生程度隨著HgCl2處理時間的延長而加重，濃度升高，褐變率也增大[15，47]，而對于不同時期的外植體，消毒處理時間也不同[48]。endprint

33選擇適宜的培養(yǎng)基和條件

通過使用適當(dāng)?shù)臒o機鹽和蔗糖濃度、生長調(diào)節(jié)劑的合理配比等，選出適合組織培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基，調(diào)控培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法及繼代周期等防控褐變。

對漆樹外植體進行組織培養(yǎng)，在低鹽的White培養(yǎng)基中添加100 mg/L半胱氨酸，可使其褐變率降到115%[49]。在無花果的組織培養(yǎng)中，不論是高鹽的MS培養(yǎng)基還是相對低鹽的WPM培養(yǎng)基，褐變率及其褐變程度均較高，而通過提高瓊脂含量，會使褐變程度減輕，褐變率為5%[38]。有研究表明，B5培養(yǎng)基也較適宜木本植物的組織培養(yǎng)[50]，通過在DKW培養(yǎng)基中加入激素組合，核桃莖尖生長良好，褐變程度減輕[16]。對于同種外植體，采用不同的激素組合或濃度配比，對外植體的褐變影響程度也不同[45]。無論在何種培養(yǎng)基上，外植體為幼嫩組織的褐變死亡率高于成熟組織，愈傷組織出現(xiàn)也較晚[51]。此時可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件[37-38]、培養(yǎng)方式[22]來控制褐變的發(fā)生。相對于正常光照條件，暗處理更適合防止褐變的發(fā)生，其原因是一些酶系統(tǒng)受光誘導(dǎo)。低溫、高溫都可影響褐變的程度，低溫影響程度較輕，高溫影響較嚴(yán)重。

[HTK]34培養(yǎng)基中的添加物[HT]

當(dāng)以上措施達不到消除或控制褐變的效果時，可向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目购肿儎﹣磉M一步防止褐變的發(fā)生。常用的抗褐變劑有吸附劑、抗氧化劑等。

341抗氧化劑在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，可以抑制酚類氧化，達到防止褐變的目的。目前，應(yīng)用于培養(yǎng)基的抗氧化劑有維生素C、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、檸檬酸（CA）、二硫蘇糖醇（DTT）、植酸（PA）、半胱氨酸（CYS）、硝酸銀（AgNO3），螯合劑有乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等[52]，不同的抗氧化劑及同種氧化劑的不同濃度對植物材料的褐變抑制作用均不同。在葡萄的愈傷組織繼代培養(yǎng)[53]過程中，抗褐變效果依次為甘露醇（200 g/L）>AgNO3（002 g/L）>VC（0006 g/L）>檸檬酸（06 g/L），而Na2S2O3不僅不能防止褐變，反而會促進褐變的發(fā)生。在外植體莖段的處理中，VC抗褐變效果最佳，其次為聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、AgNO3，而Na2S2O3沒能達到預(yù)期效果[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)，20 mg/L AgNO3對牡丹的褐變控制較佳[54]。

在實際生產(chǎn)中，對外植體的培養(yǎng)可結(jié)合多種抗氧化劑來減輕培養(yǎng)過程中的褐變，如白玉蘭的芽接種前用相同濃度的檸檬酸、Na2S2O3浸泡后，褐變率均低于30%[18]。

342吸附劑活性炭（AC）和PVP可通過氫鍵和分子間的作用力將培養(yǎng)材料周圍的酚類化合物吸附。但是活性炭缺乏吸附選擇性，除了吸附培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)以減輕褐變以外，還能夠吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)從而給植物生長造成競爭性抑制。研究表明，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加15 g/L活性炭時，茶樹外植體褐變率較對照降低22%[34]。還有研究表明，03%活性炭對紅葉楊外植體的褐變起到較好的抑制作用，當(dāng)活性炭含量達到05%時，植株生長緩慢[55]。因此，在培養(yǎng)基中添加活性炭時，可適當(dāng)提高激素配比，也可進行階段培養(yǎng)，以保證植株的正常生長。PVP可耐受高溫，且是酚類物質(zhì)的專一吸附劑[14]，從理論上講作為防褐變劑是可行的。研究表明，麻櫟[39]、阿月渾子[56]的外植體培養(yǎng)中PVP為最佳褐變抑制劑。在銀杏的愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件下PVP的抑制褐變效果為25%，而黑暗條件下抑制褐變率則為0[57]。

35培養(yǎng)方式

可通過選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式來降低褐變發(fā)生的概率。在黃連木莖段接種的3種方式，即平放、斜插、直插中，平放接種可以減輕褐變的發(fā)生[58]。此外，通過連續(xù)多次轉(zhuǎn)瓶或縮短轉(zhuǎn)瓶周期可減輕褐變。另外，對植物材料進行莖尖培養(yǎng)時，接種后24 h便將其轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中，之后每天轉(zhuǎn)1次，持續(xù) 7 d，褐變基本不發(fā)生[59]。還可采用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基交替使用的方法防止褐變的發(fā)生，因為液體培養(yǎng)基可有效沖洗外植體內(nèi)溢出的毒害物質(zhì)。

4結(jié)語

植物組織培養(yǎng)過程中褐變現(xiàn)象已有較長的研究歷史并積累了大量的數(shù)據(jù)資料。通過對褐變的了解與剖析，可知PPO是褐變發(fā)生的重要促進物質(zhì)。導(dǎo)致褐變的內(nèi)因有取材時期的選擇、基因類型、同品種外植體的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)材料的大小及部位等；外因有培養(yǎng)基種類及狀態(tài)、化學(xué)添加物的含量和比例等。不同植物間基因型的差異與外植體酚類物質(zhì)的產(chǎn)生量、相關(guān)酶含量、基因表達均有關(guān)系[54，56，60]，因此褐變是由多種因素共同作用而產(chǎn)生的。對褐變現(xiàn)象進行更深一步的研究并防控木本植物發(fā)生褐變，能大大提高組培效率，減少經(jīng)濟損失。在實際生產(chǎn)過程中，可綜合運用多種防褐變的控制措施，減輕或消除褐變，提高生產(chǎn)效益。

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