基于抑郁模型大鼠miR-665表達(dá)及靶基因功能分析探討開(kāi)心解郁方抗抑郁療效機(jī)制＊

王聯(lián)生，黃世敬，潘菊華，王彥云，張 穎，陳宇霞

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

基于抑郁模型大鼠miR-665表達(dá)及靶基因功能分析探討開(kāi)心解郁方抗抑郁療效機(jī)制＊

王聯(lián)生，黃世敬＊＊，潘菊華，王彥云，張 穎，陳宇霞

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

目的：通過(guò)考察中藥開(kāi)心解郁方干預(yù)抑郁癥模型大鼠海馬miR-665表達(dá)變化并對(duì)miR-665的靶基因進(jìn)行生物信息分析，探討miR-665在抑郁癥的發(fā)病及開(kāi)心解郁方抗抑郁機(jī)制中的作用。方法：建立慢性應(yīng)激抑郁癥大鼠模型并用開(kāi)心解郁方干預(yù)42天，取海馬組織提取總RNA，采用RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠海馬miR-665相對(duì)表達(dá)量，并采用TargetScan和microRNAorg數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-665進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行GO功能富集分類(lèi)及KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組及西藥組大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-665靶基因的生物學(xué)功能主要富集于有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)等；信號(hào)通路主要富集于N-糖鏈的合成等。結(jié)論：miR-665可能參與了抑郁癥病理機(jī)制過(guò)程調(diào)控，通過(guò)改善其表達(dá)異?？赡転殚_(kāi)心解郁方的抗抑郁機(jī)制之一，通過(guò)對(duì)其靶基因的功能預(yù)測(cè)分析對(duì)于后期繼續(xù)研究開(kāi)心解郁方干預(yù)miR-665的具體作用機(jī)制提供了方向和理論基礎(chǔ)。

抑郁癥 miR-665 生物信息分析 開(kāi)心解郁方

抑郁癥是一種以顯著而持久的抑郁狀態(tài)為特征的常見(jiàn)的情感障礙性疾病，該病具有高治病率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，對(duì)患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2012年統(tǒng)計(jì)目前全世界抑郁癥患者約有3.5億，每年因該病自殺者近百萬(wàn)人[1]。抑郁癥為多因素共同致病，其形成的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制至今了解有限。一般認(rèn)為與神經(jīng)遞質(zhì)改變、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能失調(diào)、神經(jīng)元可塑性及神經(jīng)再生障礙有關(guān)。中醫(yī)藥在抑郁癥的防治過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，開(kāi)心解郁方為臨床上治療抑郁癥的有效方劑。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)開(kāi)心解郁方具有明顯抗抑郁臨床療效，其作用機(jī)制與改善神經(jīng)元損傷、保護(hù)血腦屏障、調(diào)節(jié)情感調(diào)節(jié)因子5-羥色胺（5-HT）及其受體亞型的表達(dá)等有關(guān)[2-4]。

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與疾病密切相關(guān)的小分子RNA[5]，可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元的生成、神經(jīng)可塑性及信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵性元件的基因表達(dá)等參與抑郁癥的病理過(guò)程[6,7]。miR-665是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)的miRNA分子，在海馬神經(jīng)元的凋亡及神經(jīng)保護(hù)過(guò)程中具有調(diào)控作用[8]。本研究旨在探討中藥開(kāi)心解郁方對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬miR-665表達(dá)影響，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-665的靶基因進(jìn)行功能分析，為抑郁癥的防治以及中醫(yī)藥治療抑郁癥提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇成年健康雄性SD大鼠，體重220±20 g，（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

開(kāi)心解郁丸由人參、柴胡、赤芍、茯苓、遠(yuǎn)志等組成（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院大興制劑室，批號(hào)：20140418）。

1.3 主要試劑

水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150508）；miScript II RT Kit試劑盒（p/n 218160），由德國(guó)QIAGEN公司提供；miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司，p/n 218073；鹽酸氟西?。绹?guó)禮來(lái)公司，批號(hào)：4139A）。

1.4 主要儀器

定量 PCR儀（p/n 7900HT），由美國(guó) Applied Biosystems公司提供；PCR儀（p/n 9700），由美國(guó)ABI公司提供；離心機(jī)（p/n 5418），由德國(guó)eppendorf公司提供；振蕩器-1（p/n GL-88B），由中國(guó)其林貝爾公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（CUMS）抑郁癥大鼠模型建立：參照Willner等[9]方法改進(jìn)將大鼠予以禁水、禁食、夾尾、潮濕墊料、水平振蕩、電擊足底、冰水游泳、明暗顛倒等刺激。這些刺激每天隨機(jī)采取一種,使動(dòng)物不能預(yù)料刺激發(fā)生。孤養(yǎng)，CUMS的同時(shí)單籠隔離飼養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

實(shí)驗(yàn)前大鼠每組5只正常飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，選行為學(xué)得分相近者隨機(jī)分為：正常組（常規(guī)飼養(yǎng)）；模型組（CUMS+孤養(yǎng)42天）；中藥組（模型基礎(chǔ)上給予開(kāi)心解郁方，灌胃給藥劑量為0.90 g·kg-1·d-1，治療42天）；西藥組（模型基礎(chǔ)上給予鹽酸氟西汀，灌胃給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，治療42天）。

2.3 行為學(xué)觀察

于造模42天后所有大鼠單籠飼養(yǎng)，配制1%蔗糖溶液，第1天每籠放置2瓶糖水；第2天每籠左右分別放置1瓶糖水，1瓶純水；第3天禁水24 h；第4天給每籠左右分別放置1%蔗糖水和純水各1瓶并稱(chēng)重，120 min后，取2瓶水再次稱(chēng)重。記錄每只大鼠的糖水消耗量、純水消耗量，以及糖水消耗百分率。

2.4 海馬組織提取

所有大鼠用水合氯醛深度麻醉，腹腔取血后用4℃生理鹽水灌流（心尖進(jìn)針插入右心室，剪開(kāi)左心耳），灌流結(jié)束后，斷頭取腦，剝離海馬組織，標(biāo)號(hào)，入液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱儲(chǔ)層待測(cè)。

2.5 miR-665表達(dá)測(cè)定

選取正常組、模型組、中藥組及西藥組大鼠整個(gè)海馬組織標(biāo)本各10例，通過(guò)分離、沉淀、洗滌及溶解來(lái)提取海馬組織中總RNA。然后通過(guò)設(shè)計(jì)miR-665特異性頸環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系于PCR儀中，37℃下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1 h，反應(yīng)完全后95℃下5 min終止反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為94℃下15 s，55℃下30 s，70℃下30 s，40個(gè)循環(huán)。表達(dá)結(jié)果采用2-△△Ct法分析miR-665相對(duì)表達(dá)量。

2.6 miR-665靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

使用GeneSpring1 3.1軟件，分別通過(guò)TargetScan（http：//www.targetscan.org/）和 microRNAorg（http：//www.microrna.org/microrna/home.do/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) miR-665 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。為增加預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的靶基因取交集。再采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行功能富集分析，應(yīng)用Gene Ontology（GO）進(jìn)行功能富集分類(lèi)，應(yīng)用KEGG進(jìn)行信號(hào)通路分析。通過(guò)Fisher Exact Test計(jì)算基因功能的顯著性水平。

2.7 數(shù)據(jù)分析

所測(cè)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，釆用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。服從正態(tài)分布且方差齊者采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD或T檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布者，釆用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 行為學(xué)結(jié)果

各組大鼠于造模前糖水消耗百分率組間無(wú)明顯差異，基線良好。42天后糖水消耗百分率模型組低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；開(kāi)心解郁方中藥組糖水消耗百分率高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鹽酸氟西汀西藥組糖水消耗百分率高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明造模后模型大鼠的糖水消耗百分率明顯降低，開(kāi)心解郁方及鹽酸氟西汀可明顯增加模型大鼠的糖水消耗百分率。

圖1 糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 miR-665 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

3.2 各組大鼠海馬miR-665相對(duì)表達(dá)量結(jié)果

RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠海馬miR-665相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），西藥組大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3.3 miR-665靶基因的功能富集分析結(jié)果

采用TargetScan和microRNAorg兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miR-665的靶基因，結(jié)果取二者交集共得到327個(gè)靶基因。將預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果顯示miR-665靶基因的生物學(xué)功能主要富集于有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、內(nèi)源性刺激反應(yīng)、激素刺激反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)信號(hào)通路、無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、神經(jīng)沖動(dòng)傳遞、細(xì)胞增殖調(diào)控和程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)；信號(hào)通路主要富集于N-糖鏈的合成、急性髓系白血病、堿基切除修復(fù)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和癌癥通路。見(jiàn)表1，2。

4 討論

抑郁癥屬于中醫(yī)的“郁證”、“癲證”、“臟躁”、“百合病”等范疇。理氣開(kāi)郁為郁病基本治則。開(kāi)心解郁方是在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中總結(jié)用于治療抑郁癥的有效方劑，由古方開(kāi)心散與四逆散合方加減而成，方中人參大補(bǔ)元?dú)?，開(kāi)郁化滯，柴胡疏肝解郁，二藥合用培元開(kāi)郁，共為君藥；巴戟天補(bǔ)腎助陽(yáng)，茯苓健脾安神，二藥助人參培元固本；枳實(shí)行氣通滯，赤芍養(yǎng)血活血，二藥助柴胡開(kāi)郁行滯，共為臣藥；遠(yuǎn)志化痰解毒，甘草調(diào)和諸藥，共為佐使藥。全方合用，共湊益氣開(kāi)郁之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)開(kāi)心解郁方治療抑郁癥臨床療效顯著，增加額葉及頂葉腦血流值，改善腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平，促進(jìn)BDNF及其受體表達(dá)，有效保護(hù)海馬神經(jīng)元及神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)[2-4]。

表1 miR-665靶基因的GO富集分析結(jié)果

表2 miR-665靶基因信號(hào)通路富集分析結(jié)果

miRNA是一種內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈RNA，由大約22個(gè)核糖核苷酸組成，主要通過(guò)與其靶基因結(jié)合調(diào)控其表達(dá)和下游蛋白翻譯過(guò)程，在細(xì)胞增殖與凋亡以及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9]。通過(guò)對(duì)抑郁癥自殺人群的腦組織miRNA表達(dá)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者前額皮質(zhì)中存在miRNA表達(dá)顯著性異常[10]。Belzeaux等[11]通過(guò)檢測(cè)16名重度抑郁癥患者外周單核細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個(gè)miRNA（miR-148a，miR-381，miR-1243，hasmiR-107，miR-200c，miR-494，miR-579，miR-133a，miR-517b，miR-589，miR-636，miR-652，miR-941，miR-425-3p）表達(dá)出現(xiàn)顯著異常，且這些異常變化的miRNA隨抗抑郁藥物治療后臨床癥狀的改善而發(fā)生相應(yīng)的變化?？梢?jiàn)miRNA參與了抑郁癥的病理以及抗抑郁藥物的作用機(jī)制過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA主要參與了抑郁癥海馬神經(jīng)元的生成、突觸可塑性以及BDNF的表達(dá)等方面病理生理機(jī)制的調(diào)控。如miR-124a可通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路決定神經(jīng)干細(xì)胞的分化參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元生成[12]。miR-134和BDNF間存在一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，過(guò)表達(dá)miR-134可通過(guò)抑制cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）損傷突觸的可塑性，抑制BDNF的表達(dá)[13]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，miR-665參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)控，Sun等[14,15]發(fā)現(xiàn)miR-665可通過(guò)靶向抑制Bcl-2樣蛋白1（BCL2L1）的表達(dá)參與調(diào)控海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡、再生。Lu等[16]通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究探討miR-665在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-665表達(dá)水平對(duì)于學(xué)習(xí)記憶功能具有明顯的影響，其機(jī)制可能與調(diào)控海馬神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，胰島素樣生長(zhǎng)因子2（Insulinlike Growth Factor 2，IGF 2）可能為其下游靶標(biāo)。

本研究在前期臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察在中藥開(kāi)心解郁方干預(yù)慢性應(yīng)激抑郁癥模型大鼠的過(guò)程中海馬miR-665表達(dá)水平的變化。對(duì)miR-665可能參與抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及開(kāi)心解郁方的作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步研究。研究表明慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬miR-665表達(dá)水平顯著增高，開(kāi)心解郁方及鹽酸氟西汀可顯著降低其表達(dá)水平，提示miR-665可能參與了抑郁癥病理機(jī)制過(guò)程調(diào)控，通過(guò)改善其表達(dá)異常可能為開(kāi)心解郁方的抗抑郁機(jī)制之一，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

另外對(duì)miR-665的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首先采用TargetScan、microRNAorg兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步采用GO分析和KEGG通路分析探討其可能參與的生物學(xué)功能。結(jié)果提示：miR-665靶基因主要與有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、內(nèi)源性刺激反應(yīng)、激素刺激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，主要參與了N-糖鏈的合成、急性髓系白血病及堿基切除修復(fù)等信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)其靶基因的功能預(yù)測(cè)分析將為我們后期繼續(xù)研究開(kāi)心解郁方干預(yù)miR-665的具體作用機(jī)制提供一定的方向和理論基礎(chǔ)。

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Expression of miR-665 and BioinformaticAnalysis on Its Target Genes of Kai-Xin Jie-Yu Decoction Based on Depression Model Rats

Wang Liansheng,Huang Shijing,Pan Juhua,Wang Yanyun,Zhang Yin,Chen Yuxia
(Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

This study was aimed to detect the expression of miR-665 in the hippocampal of depression rat model treated withKai-Xin Jie-Yu(KXJY)decoction and bioinformatic analysis of target genes of miR-665,in order to investigate the role of miR-665 in the pathogenesis of depression and the antidepressant mechanism of KXJY decoction.The rat model of chronic stress depression was established and then treated with KXJY decoction for 42 days.The total RNA from hippocampus tissues was extracted.And the relative expression of miR-665 in hippocampus of rats in each group was detected by RT-qPCR.TargetScan and microRNAorg databases were used to predict target genes for miR-665.DAVID database was used to classify GO function and to analyze KEGG signaling pathway of target genes.The results showed that compared with the normal group,the expression level of miR-665 in hippocampus of the model group was significantly higher with significant difference(P＜0.01).Compared with the model group,the expression level of miR-665 in hippocampus of Chinese medicine group and western medicine group decreased significantly with significant difference(P＜0.01).The biological functions of miR-665 target genes were mainly concentrated in the response to organic substance.The signal pathway was mainly concentrated in N-Glycan biosynthesis.It was concluded that miR-665 may be involved in the pathological process of depression,by correcting the abnormal expression of miR-665,which may be one of the antidepressant mechanisms of KXJY decoction.Through the analysis and prediction of the target genes,it provided a certain direction and theoretical basis for further study on the specific mechanism of KXJY decoction intervention on miR-665.

Depression,miR-665,biological information analysis,Kai-Xin Jie-Yudecoction

10.11842/wst.2017.08.014

R965

A

2017-06-13

修回日期：2017-07-12

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金（81573790）：基于lncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)調(diào)控探討益氣開(kāi)郁中藥抗抑郁機(jī)制，負(fù)責(zé)人：黃世敬；北京市科技計(jì)劃（No.Z161100001816013）：開(kāi)心解郁丸治療血管性抑郁的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究，負(fù)責(zé)人：黃世敬

＊＊ 黃世敬，博士生導(dǎo)師，研究員，主任醫(yī)師。主要從事中醫(yī)腦病、抑郁癥及中藥研發(fā)。

（責(zé)任編輯：陳 寧，責(zé)任譯審：王 晶）