潮州老香黃的HPLC指紋圖譜研究及指標(biāo)成分測定＊

劉志聰，張振霞，賴 宣，楊啟財，陸玉婷，黃秋轉(zhuǎn)，鄭玉忠＊＊

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 廣東潮州 521041；2.廣東濟(jì)公保健食品有限公司 廣東潮安 515638）

潮州老香黃的HPLC指紋圖譜研究及指標(biāo)成分測定＊

劉志聰1，張振霞1，賴 宣2，楊啟財2，陸玉婷1，黃秋轉(zhuǎn)1，鄭玉忠1＊＊

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 廣東潮州 521041；2.廣東濟(jì)公保健食品有限公司 廣東潮安 515638）

目的：潮州老香黃是佛手的炮制品，本文以不同產(chǎn)地的老香黃為研究對象，建立了老香黃的HPLC指紋圖譜，并測定了橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，為建立潮州老香黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。方法：色譜條件為Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫。流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20μL；檢測波長為283 nm。結(jié)果：得到分離度、重現(xiàn)性均較好的老香黃HPLC指紋圖譜，對27批老香黃樣品進(jìn)行了相似度評價，結(jié)果顯示老香黃的指紋圖譜有一定的相似性，但整體有一定的差異。同步測定了老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。結(jié)論：本文建立的老香黃指紋圖譜及橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量測定的方法針對性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，為潮州老香黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

老香黃 佛手 HPLC指紋圖譜 橙皮苷 5,7-二甲氧基香豆素

潮州老香黃(也稱老香櫞、佛手香黃)是潮汕特有的保健和藥用制品，由蕓香科植物佛手(Citrus medicaL.VarSarcodactylis(Noot)Swingle)的果實(shí)炮制而成的。佛手具有理氣、化痰、治療胃痛、腹脹、嘔吐、祛痰鎮(zhèn)咳及解酒等功效，是我國傳統(tǒng)的中藥材，也是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“藥食兩用”中藥之一，但本身味道苦辛，不宜直接食用[1-2]，為此，潮汕人以佛手柑為原料，經(jīng)過鹽腌、曬干、炊熟、浸中藥粉液等步驟，經(jīng)歷九蒸九曬制成了色黑如漆、綿軟的老香黃[3]。制好的老香黃具有去積祛風(fēng)、開胃理氣、化痰生津等功效，而且久藏不壞，貯藏時間越長藥效越佳，身價也就越高。因此，老香黃是潮汕家庭必備的藥用涼果，具備良好的開發(fā)潛力。

潮州老香黃的主要原料是廣佛手和金華佛手，這兩種佛手的生長環(huán)境和化學(xué)成分各不同[4-5]。佛手中含有多種揮發(fā)性成分，主要包括橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素等[6]。其中橙皮苷具有抗氧化、抗炎、止痛、降壓降血脂等活性，還有抑制水腫、出血、抗癌等效果[7-8]；香豆素則有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、平喘及抗菌等多方面生物學(xué)活性，具有潛在的藥用價值[9-10]。同時，目前老香黃多以作坊制作為主，沒有標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，導(dǎo)致老香黃成品在化學(xué)成分組成及含量上差異很大，因而直接影響到老香黃的質(zhì)量。因此，建立老香黃的質(zhì)量評價體系，控制其質(zhì)量，對于老香黃臨床合理、安全應(yīng)用具有重要意義。本研究利用HPLC法對潮州地區(qū)不同的老香黃進(jìn)行系統(tǒng)研究，首次建立了老香黃的色譜指紋圖譜，并對老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素兩個活性成分進(jìn)行含量測定，為老香黃藥材全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

美國Aglient 1200高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、自動脫氣機(jī)、DAD檢測器、Aglient1200色譜工作站)；DP-01真空泵（天津東康科技有限公司）；FA2004電子天平 (上海精科)；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗儀（昆明市超聲儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光光度計(jì)（龍尼科上海儀器有限公司）；GenPure超純水系統(tǒng)純水器（德國TKA公司）。

1.2 試劑

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）、甲醇（分析純，西隴化工股份有限公司）、磷酸（西隴化工股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 藥品

對照品橙皮苷（購自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，批號為05-1009，純度＞98%）和5,7-二甲氧基香豆素（購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號為11-1207，純度＞98%）。

2012年5月至8月，27批老香黃樣品包含分別購自廣東省潮州市等不同產(chǎn)地，所有樣品均為佛手的加工品，樣品編號為1號～27號。所有樣品均保存于韓山師范學(xué)院生物學(xué)系。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取取橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素對照品各2.5 mg，精密稱定，用甲醇溶解后，并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得濃度為100 mg·L-1的橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備

將27批老香黃樣品分別進(jìn)行干燥和粉碎，分別精密稱取1 g的老香黃樣品，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，玻璃棒研磨，稱定重量，45℃超聲處理30 min（500 W），用甲醇補(bǔ)足重量，0.45 μm濾膜濾過備用。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 mm)；流動相：0.1%磷酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫（0～15 min，20%B；15～30 min，20%～75%B；30～50 min，75%～100%B；50～60 min，100%B)；流速：1mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：20 mL。

2.1.4 老香黃色譜指紋圖譜方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)

取1號老香黃供試液，各連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1%，表明精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號老香黃供試液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1%，表明穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)

取1號老香黃，精密稱量6份，按2.1.2描述的方法制備供試品溶液，記錄色譜圖進(jìn)行分析。結(jié)果測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1%，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.1.5 老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量測定方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取2.1.2項(xiàng)對照品儲備液，制備橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素混合溶液，濃度分別為5、10、15、20、25 mg·L-1。按2.1.3的色譜條件，自動進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)Y，對照品濃度為橫坐標(biāo)X，得到回歸方程：橙皮苷：Y=17.896X-3.3562，R=0.9992；5,7-二甲氧基香豆素：Y=19.171X-2.607，R=0.9997；表明橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素在5～25 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗(yàn)

取供試對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素峰面積RSD分別為1.28%和0.63%，它們的相對保留時間的RSD分別為1.21%和0.89%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號老香黃供試液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的峰面積，結(jié)果RSD別為1.32%和1.17%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的加樣回收率(n=6)

圖1 對照品和供試品的HPLC圖

（4）重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1號老香黃樣品各6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，其RSD分別為1.56%和0.36%，它們的相對保留時間的RSD分別為0.68%和0.89%，表明此方法的重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)

取供試27號老香黃樣品各6份，精密稱定每份1.00 g，加入對照品溶液。按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試液，測定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。

3 結(jié)果

3.1 老香黃HPLC指紋圖譜的測定與分析

3.1.1 樣品指紋圖譜測定

對所有老香黃樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)藥材所有成分能在60 min內(nèi)被洗脫出來，對照品和老香黃的色譜圖見圖1。比較27批老香黃樣本的色譜圖，它們的共有成分基本相同，但24～27號與其他批次的指紋圖譜差異較大。雖然不同產(chǎn)地的樣品都含5,7-二甲氧基香豆素，含量有較大差異（見圖2）。

3.1.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算

圖2 老香黃27批樣品的疊加圖譜

本實(shí)驗(yàn)采用中國藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版對27批老香黃的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析[11]。首先將各批次樣品的測試數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似性評價系統(tǒng)軟件中，選定上述的特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過中位數(shù)矢量計(jì)算得出其共有圖譜標(biāo)準(zhǔn)模板，結(jié)果如圖2所示；然后進(jìn)行各樣品的相似度評價，27批老香黃的相似度評價結(jié)果見表3。通過相似度分析，發(fā)現(xiàn)不同批次老香黃的圖譜的差異變化很大，其中相似度大于0.9的17批，相似度低于0.9的有10批。特別是24號-27號的相似度均低于0.9，說明這四批老香黃的差異性很顯著。

3.2 老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量測定

對27批老香黃樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在為283 nm下測定橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。結(jié)果顯示，27批不同產(chǎn)地的老香黃中橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量分別介于35.15-145.77 mg·kg-1和35.13-395.15 mg·kg-1，兩者的平均含量分別為73.29 mg·kg-1和139.76 mg·kg-1（表3）?！吨袊幍洹芬?guī)定佛手橙皮苷≥0.03%[1]，老香黃的橙皮苷含量遠(yuǎn)低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明經(jīng)過炮制之后，橙皮苷含量大大降低了。此外，橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素含量的變異系數(shù)分別達(dá)到49.49%和58.70%，說明27批老香黃的成分含量差異明顯。

4 討論

（1）中國藥典中佛手的指標(biāo)成分是橙皮苷，但5,7-二甲氧基香豆素也是佛手的主要成分[12-13]。為了真實(shí)反應(yīng)老香黃的主要活性成分，本文將橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素共同作為老香黃的含量測定指標(biāo)，并用于老香黃指紋圖譜的指標(biāo)峰加以研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時，使用文中所選擇的梯度洗脫程序，能保證樣品的分離度和峰的數(shù)目。同時，在283 nm波長下各峰分離度良好，特征性強(qiáng)，峰數(shù)目較多。因此本文優(yōu)化了老香黃的含量測定條件和指紋圖譜的HPLC條件。

（2）從圖2中可以看出27批老香黃樣品HPLC指紋圖譜雖存在一定差異，但橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素可作為老香黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特有峰。對27批老香黃的指紋圖譜進(jìn)行了相似度評價，色譜圖的整體相貌是相同的，但是不同批次老香黃的指紋圖譜在非共有峰及特征指紋峰的相對比例大小上還是有較大差別的。這說明老香黃的原料、產(chǎn)地和制作工藝差別，使得其指紋圖譜也有較大的差異。本實(shí)驗(yàn)建立了老香黃HPLC指紋圖譜，以及橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量測定方法，具備良好的專屬性，可作為老香黃的質(zhì)量控制方法。

表2 不同老香黃樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果

表3 27批老香黃橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量

（3）橙皮苷是中國藥典指定的佛手藥材的指標(biāo)成分，其含量不少于0.03%[1]；但是對5,7-二甲氧基香豆素卻沒有要求。林樂維等發(fā)現(xiàn)佛手中的5,7-二甲氧基香豆素含量很高，平均含量超過0.2%[13]。從表3中可以看出，雖然橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素是老香黃的特征成分，但在27批老香黃樣品中的含量均不高，遠(yuǎn)低于原材料中的含量。其中的主要原因可能是由于經(jīng)過多道工藝的炮制，特別是鹽浸和蒸煮等步驟嚴(yán)重流失了橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量。

（4）老香黃貯藏時間越長，身價就越高。佛手揮發(fā)性成分隨著儲藏時間逐漸降低。在27批老香黃樣品中，橙皮苷含量平均為73.29 mg·kg-1，香豆素含量平均為139.76 mg·kg-1。結(jié)合樣品的實(shí)際情況，可以看出當(dāng)橙皮苷低于73.29 mg·kg-1，香豆素低于139.76 mg·kg-1時，老香黃的儲藏時間較長，其質(zhì)量也越高。當(dāng)然，橙皮苷和香豆素含量與炮制工藝、儲藏時間的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步研究。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：178.

2 金曉玲,王瓊,陳彩娟,等.不同產(chǎn)地佛手的營養(yǎng)成分比較研究.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2002,4：66-68.

3 鄭玉忠,郭守軍,楊永利,等.藥食涼果老香黃制作工藝的研究.農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2014,1：44-46.

4 施長春,王建英,朱婉萍,等.金佛手揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析.藥學(xué)實(shí)踐雜志,2004,22(4)：209-210.

5 張瑞芳,高幼衡,崔紅花,等.廣佛手藥材HPLC指紋圖譜的研究.中草藥,2007,38(7)：1075-1077.

6 惠恩健.佛手片、砂仁等中醫(yī)理氣藥的有效成分溶出規(guī)律研究.杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2011.

7 焦聰聰.佛手廢渣中有效成分提取、分離及純化研究.金華：浙江師范大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012.

8 李榮,胡成穆,姜輝,等.橙皮苷的提取及其抗炎活性研究.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,42(5)：546-549.

9 何方奕,韓瑩,劉曼,等.無梗五加果中總香豆素和6,7二甲氧基香豆素的含量測定.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2006,23(1)：18-21.

10 郝光,王振國,付文艷,等.香豆素類化合物抗腫瘤作用研究進(jìn)展.中國中藥雜志,2008,33(18)：2016-2019.

11 張振霞,鄭玉忠,梁麗娟,等.酸橙和甜橙2種枳實(shí)藥材HPLC指紋圖譜研究及其柚皮苷和辛弗林含量分析.中國藥房,2011,22(39)：3711-3713.

12 高幼衡,刁遠(yuǎn)明,彭新生,等.HPLC法測定廣佛手中5,7-二甲氧基香豆素的含量.中藥新藥與臨床藥理,2003,14(4)：250-251.

13 林樂維,蔣林,郝大慶,等.不同采收期廣佛手中5,7-二甲氧基香豆素的含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2009,23(6)：15-17.

Analysis on HPLC FingerprintsAnd Index Content Determination of Lao-Xiang-Huang of Chaozhou

Liu Zhicong1,Zhang Zhenxia1,Lai Xuan2,Yang Qicai2,Lu Yuting1,Huang Qiuzhuan1,Zheng Yuzhong1
(1.Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;2.Guangdong JIGONG Healthy Food Co.,Ltd.,Chao'an 515638,China)

Lao-Xiang-Huang(LXH)ofChaozhouis the processed product of Fructus Citri sarcodactylis.LXH from different producing areas were used as research objects in the study for the establishment of HPLC fingerprints of LXH.Contents of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin were also determined to provide scientific basis for the establishment of quality standard of LXH.Samples were separated by an Agilent Eclipse XDB C18column(4.6 mm × 250 mm,5 μm)using acetonitrile-0.1%phosphoric acid with water gradient system as a mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The injection volume was 20 μL.The detection wavelength was at 283 nm.The results showed that HPLC fingerprint of LXH was established with good separation and repeatability.The similarity evaluation on 27 batches samples of LXH showed that there was a certain similarity on the HPLC fingerprints of LXH.However,there was a certain difference as a whole.Contents of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin in LXH were simultaneously determined.It was concluded that the established HPLC fingerprint of LXH and content determination of hesperidin and 5,7-dimethoxycoumarin method were accurate,sensitive and repeatable.It provided scientific evidence for the quality control standard of LXH ofChaozhou.

Lao-Xiang-Huang,Fructus Citri sarcodactylis,HPLC fingerprint,hesperidin,5,7-dimethoxycoumarin

10.11842/wst.2017.08.020

R917

A

2017-05-23

2017-07-20

＊

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030307043)：以佛手為原料的潮汕特色藥食“老香黃”的質(zhì)量控制及健胃消食功效機(jī)制的研究，負(fù)責(zé)人：張振霞；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(20141305)：以佛手為原料的潮汕“老香黃”的質(zhì)量控制研究，負(fù)責(zé)人：鄭玉忠；廣東順大食品調(diào)料有限公司資助項(xiàng)目(韓合[2012]170號)：潮汕老香黃的質(zhì)量控制和安全性研究，張振霞；潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016N02)：復(fù)方佛手膏加工工藝中關(guān)鍵技術(shù)的研究，負(fù)責(zé)人：賴宣；潮州市潮安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(安財工[2016]94號)：基于橘皮和佛手的“老藥吉”健康食品的關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：賴宣。

＊＊ 通訊作者：鄭玉忠，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)、中藥藥理學(xué)。

（責(zé)任編輯：韓覆蔓，責(zé)任譯審：王 晶）