減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-載體平衡致死系統(tǒng)的構建及其生物學特性研究①

楊亞東 丁 軻 張春杰 程相朝 賈艷艷 何 雷

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-載體平衡致死系統(tǒng)的構建及其生物學特性研究①

楊亞東 丁 軻 張春杰 程相朝 賈艷艷 何 雷

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

目的為構建減毒鼠傷寒沙門菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系統(tǒng)，并將其開發(fā)為能夠穩(wěn)定攜帶外源基因的活疫苗載體。方法利用重組自殺性質(zhì)粒(pREΔasd)介導的等位基因交換技術，以減毒鼠傷寒沙門菌株SL1344ΔsseK1為親本株，運用二步法篩選asd基因缺失株SL1344ΔsseK1Δasd。將攜帶有asd基因的無抗性pYA3493質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至上述缺失菌株SL1344ΔsseK1Δasd，構建SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)重組菌株。結果PCR及測序結果表明SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)構建成功。進一步研究表明重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)血清型和強毒株SL1344及親本株SL1344ΔsseK1相同，且能穩(wěn)定遺傳缺失后的asd基因；其生化特性和生長速度與強毒株SL1344及親本株SL1344ΔsseK1相比均無明顯差異。小鼠毒力試驗表明，SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)口服感染6周齡BALB/c小鼠的LD50為5.24×108CFU，毒力較強毒株SL1344約下降至0.048%；免疫保護效力試驗顯示，運用鼠傷寒沙門菌野生毒株對免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保護率，與親本株SL1344ΔsseK1基本一致。結論以上結果表明，鼠傷寒沙門菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-載體平衡致死系統(tǒng)構建成功，且遺傳穩(wěn)定，毒力明顯降低，具有較好的免疫原性，為深入研究以鼠傷寒沙門菌為載體的口服多價疫苗奠定基礎。

鼠傷寒沙門菌；自殺性質(zhì)粒；宿主-載體平衡致死系統(tǒng)；活疫苗載體

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)屬于腸道致病菌，也是重要的人類食物源性病原體，是引起世界人類食物中毒中最重要的病原體之一，在醫(yī)學及公共衛(wèi)生學上亦具有十分重要的意義[1]。

近年來，隨著基因工程技術的發(fā)展以及對沙門菌毒力遺傳學研究的不斷深入，以減毒沙門菌為活載體表達外源抗原、研制多價疫苗已成為該領域的研究熱點[2]。沙門菌的一個重要致病機制是在SPI-1和SPI-2兩個毒力島編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)介導下，細菌效應蛋白易位到宿主細胞，誘導炎癥反應[3]。沙門菌分泌性蛋白K1(Salmonella secreted effector K1)是沙門菌T3SS的一種效應蛋白，已有研究發(fā)現(xiàn)sseK1能由T3SS1和T3SS2同時分泌，與介導細菌的易位分泌有關，為沙門菌T3SS的一種調(diào)節(jié)底物，是沙門菌重要的毒力調(diào)節(jié)基因，在沙門菌的致病中發(fā)揮著重要作用[4]。同時，已有研究表明該類減毒菌能夠有效地刺激機體產(chǎn)生黏膜、細胞和體液等免疫應答，已被證明是攜帶外源基因的良好載體[5]。但在臨床應用中，減毒沙門菌所攜帶的外源質(zhì)粒常因生存壓力的存在而不能穩(wěn)定遺傳，且質(zhì)粒所攜帶的抗性基因也對生物安全帶來了潛在威脅[6]。近年來發(fā)展起來的宿主-載體平衡致死系統(tǒng)克服了質(zhì)粒攜帶外源基因表達不穩(wěn)定的問題[7]，其原理是將外源基因插入含有與沙門菌載體營養(yǎng)缺陷互補基因的質(zhì)粒中，以期實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定遺傳。已有相關研究表明asd基因平衡致死系統(tǒng)是有效的載體系統(tǒng)[8]，該系統(tǒng)質(zhì)粒中含有asd基因，可與asd缺失的沙門菌載體形成互補，從而保證減毒沙門菌攜帶外源抗原能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達。

SL1344ΔsseK1是本研究室在強毒株SL1344的基礎上構建的減毒株，試驗證明sseK1基因缺毒力降低顯著，并具有良好的免疫效果。本研究中，將進一步缺失編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶的asd基因，構建asd平衡致死系統(tǒng)，進而為研發(fā)更加安全有效的鼠傷寒沙門菌弱毒疫苗以及開發(fā)以鼠傷寒沙門菌SL1344為載體的多價疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件 鼠傷寒沙門菌SL1344標準強毒株由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈；減毒鼠傷寒沙門菌菌株SL1344ΔsseK1和缺失315 bp asd基因的重組自殺性質(zhì)粒pREΔasd由本室構建并保存；自殺性質(zhì)粒pRE112、pYA3493(asd+,pBRori,β-lactamase signal sequence)及其宿主菌χ7213由美國華盛頓大學Dr.Roy Curtiss III教授惠贈，本室保存。鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌在各種培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，根據(jù)需要加入終濃度為25 μg/ml的氯霉素(Chloramphenicol,Cm)，50 μg/ml的二氨基庚二酸(D L-α,ε-Diaminopimelic acid,DAP)及其他所需物質(zhì)。

1.1.2試劑和實驗動物 各種生化鑒定試劑購于杭州天和微生物試劑有限公司；11種沙門菌屬診斷血清及各種單因子血清購于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；DAP、蔗糖、麥芽糖購于美國Sigma-Aldrich公司；麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker和限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物公司；6～8周齡BALB/c小鼠購于鄭州大學實驗動物中心。

1.1.3引物 根據(jù)GenBank上已公布的鼠傷寒沙門菌LT2(GenBank No.AE006468.1)asd基因序列設計引物，根據(jù)鼠傷寒沙門菌invA基因序列合成特異性引物用于沙門菌的鑒定。各引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1鼠傷寒沙門菌SL1344株ΔsseK1Δasd缺失株的構建及篩選 根據(jù)文獻[8]的方法并加以改良，首先利用重組自殺性質(zhì)粒介導等位交換技術二步法篩選SL1344ΔsseK1Δasd缺失突變株。供體菌χ7213(pREΔasd)和受體菌SL1344ΔsseK1分別培養(yǎng)過夜，各取100 μl細菌懸液混合，補充LB(含DAP)液體培養(yǎng)基1 ml，37℃培養(yǎng)24 h，取適量菌液涂布于含氯霉素(Cm)和10%蔗糖的LB固體平板上培養(yǎng)過夜，挑取Cm抗性(Cmr)蔗糖敏感(SUCs)菌落，用引物Pa1/Pa2擴增鑒定。將Cmr/SUCs陽性接合子轉(zhuǎn)接于含10%蔗糖無抗性無NaCl的LB(NB)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，連續(xù)10倍稀釋后，選取合適的稀釋度涂布于含有1%麥芽糖的麥康凱固體平板，篩選SL1344ΔsseK1Δasd缺失株。用氯霉素檢測其抗性，進一步提取陽性缺失株基因組，用引物Pa1/Pa2、Pa3/Pa2進行PCR擴增鑒定，并將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 PCR擴增所用的引物序列

1.2.2鼠傷寒沙門菌重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的構建及鑒定 挑取攜帶有asd基因的無抗性質(zhì)粒pYA3493陽性結合子接種于4 ml LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，參照上海生工有限公司質(zhì)粒提取試劑盒的步驟提取質(zhì)粒并將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至缺失菌株SL1344ΔsseK1Δasd感受態(tài)細菌液中，37℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)90 min，涂布在預熱的LB固體平板上。挑取長出后的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，運用引物Pa2/Pa3進行PCR擴增鑒定，并將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.3重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的生物學特性的研究

1.2.3.1SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的表型鑒定 利用玻片凝集試驗對重組菌株SL1344Δsse-K1Δasd(pYA3493)進行血清型鑒定，同時將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)、缺失株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344分別劃線接種于含和不含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂平板，然后進一步將細菌轉(zhuǎn)接至麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖等生化鑒定管中，檢測其生化特性情況。

1.2.3.2SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的遺傳穩(wěn)定性 將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA34 93)于LB培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)傳代，挑取第10、20、30、40、50、60代單菌落做PCR擴增鑒定，利用引物pa2/pa3研究asd缺失基因在缺失株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3.3SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的生長特性 分別挑取重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA34 93)、缺失株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，連續(xù)10倍無菌生理鹽水稀釋，取適當稀釋度菌液100 μl于LB固體平板上均勻涂布，每個稀釋度做3個重復，37℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)，計算原液的平均CFU。調(diào)整菌落濃度約為1×106CFU/ml后，37℃、200 r/min振搖培養(yǎng)，每1 h取樣涂板計數(shù)，并繪制生長曲線。

1.2.4SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的毒力測定 分別將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)、缺失株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344在LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1.2.3.3所述方法平板計數(shù)并計算攻毒劑量，連續(xù)10倍無菌生理鹽水稀釋，根據(jù)預實驗結果，選取合適的稀釋度，每個稀釋度口服感染6只6周齡BALB/c小鼠，每只200 μl，觀察直至無小鼠死亡，同時設生理鹽水空白對照組。統(tǒng)計死亡情況，剖檢觀察死亡小鼠的臨床變化，并取肝臟無菌接種SS和含有1%麥芽糖的麥康凱固體平板，用引物pi1/pi2進行PCR擴增鑒定，根據(jù)Bliss法計算菌株對小鼠半數(shù)致死量(LD50)。

1.2.5SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)毒力穩(wěn)定性的測定 將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA34 93)于LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代60代，收集原代、10、20、30、40、50、60代細菌，稀釋至預期濃度后感染BALB/c小鼠，具體步驟同1.2.4所述，同時設無菌生理鹽水對照組。利用引物Pi1/Pi2對分離菌株進行PCR鑒定，并計算小鼠的LD50。

1.2.6SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)免疫保護率的測定 將32只6周齡BALB/c小鼠隨機平均分成4組，設實驗1組和實驗2組，對照1組和對照2組，按1.2.3.3所述方法制備免疫和攻毒菌液。實驗組分別于第1天和第8天以鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)重組菌株100 μl(1.0×107CFU)口服免疫每只小鼠，對照組每只口服100 μl生理鹽水。在免疫后第17天，分別對實驗1組和對照1組小鼠進行口服攻毒SL1344強毒株100 μl(1.0×108CFU)，實驗2組和對照2組的小鼠不做任何處理。攻毒后持續(xù)觀察記錄免疫小鼠生長及死亡情況，以評價減毒沙門菌的免疫保護作用。

1.3統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行分析，各組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1缺失株SL1344ΔsseK1Δasd的構建及鑒定 大腸桿菌χ7213(pREΔasd)與SL1344ΔsseK1親本株在含氯霉素的培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)后，由于自殺性質(zhì)粒pREΔasd整合到SL1344ΔsseK1染色體上，會得到野生型和缺失型的asd兩個拷貝且表型均為Cm抗性的陽性結合子。用上臂內(nèi)部引物pa1和下臂內(nèi)部引物pa2擴增結合子，可得到315 bp缺失型和1 803 bp野生型的兩條帶(圖1A)。pREΔasd含有負向選擇基因(sacB蔗糖敏感基因)，陽性結合子在含DAP和10%蔗糖NB培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)中發(fā)生第二次同源重組，挑取單菌落用引物pa1/pa2擴增產(chǎn)生315 bp大小的突變型和1 803 bp大小的恢復野生型兩種結果(圖1B)。為證明缺失發(fā)生于染色體，進一步用下臂內(nèi)部引物pa2和上臂以外染色體上的引物pa3對陽性缺失株進行PCR鑒定，結果缺失型可擴得2 229 bp的片段，野生型擴得3 717 bp的片段，pREΔasd則擴不出任何條帶(圖1C)。此時所篩選陽性結合子呈Cm敏感(Cms)和蔗糖抗性(SUCr)，同時PCR及測序結果表明，SL134 4ΔsseK1Δasd缺失株構建成功。

2.2重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的構建及鑒定 將無抗性表達質(zhì)粒pYA3493電轉(zhuǎn)入缺失株SL1344ΔsseK1Δasd中，利用引物pa2/pa3進行PCR擴增，結果可得到2 229 bp大小的片段(圖2)，并且該菌能夠在普通LB培養(yǎng)基(不含DAP)中生長，PCR及測序結果表明重組菌株SL1344ΔsseK1 Δasd(pYA3493)構建成功。

2.3重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的生物學特性

2.3.1SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的表型鑒定 血清型鑒定表明，重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的血清型沒有變化，與親本菌株SL1344ΔsseK1和強毒株SL1344相同，仍為1,4,5,12:i:1,2。生化鑒定結果表明，重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)與強毒株SL1344相比，其生化特性沒有發(fā)生明顯變化，與親本株SL1344ΔsseK1保持一致。

2.3.2SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的遺傳穩(wěn)定性 將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)60代，挑取第10、20、30、40、50、60代單菌落用引物Pa1/Pa2做PCR擴增鑒定，都能擴增出315 bp的asd缺失型片段，而親本株SL1344ΔsseK1則擴增出1 803 bp的asd野生型片段(圖3)，這表明重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)能夠穩(wěn)定遺傳無抗性表達載體pYA3493和315 bp大小的asd缺失片段。

圖1 缺失菌株SL1344ΔsseK1Δasd PCR鑒定Fig.1 PCR identification of SL1344ΔsseK1Δasd mutantNote:A.PCR identification of ΔsseK1Δasd mutant conjugants with Pa1 and Pa2.M.DNA marker Ladder(DL 5000);1.pREΔasd control;2.SL1344ΔsseK1 control;3.ΔsseK1Δasd mutant conjugants;4.ddH2O control;B.PCR identification of ΔsseK1Δasd mutant with Pa1 and Pa2.M.DNA marker Ladder(DL 2000);1.SL1344ΔsseK1 control;2.SL1344ΔsseK1Δasd mutant;3.ddH2O control;C.PCR identification of ΔsseK1Δasd mutant with Pa2 and Pa3.M.DNA marker Ladder(DL 5000);1.ΔsseK1Δasd mutant;2.SL1344ΔsseK1 control;3.pREΔasd control;4.ddH2O control.

2.3.3SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的生長特性 重組菌株、親本株及強毒株均以1×106CFU/ml為起始濃度開始振蕩培養(yǎng)，然后每1 h取50 μl菌液稀釋相應的倍數(shù)涂板，過夜培養(yǎng)后計數(shù)，結果表明兩種缺失株的生長速度基本一致，而重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)和親本菌株SL1344ΔsseK1的生長速度略慢于強毒株SL1344(圖4)。

2.4重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的毒力測定 小鼠經(jīng)重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)，親本株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344口服感染后，出現(xiàn)不同程度的死亡。無菌生理鹽水對照組小鼠均未發(fā)生死亡。剖檢死亡小鼠具有典型沙門菌病變，且用引物pi1/pi2均能從死亡小鼠分離的細菌中擴增出約580 bp左右的特異性條帶。經(jīng)Bliss法計算，SL1344的口服感染LD50為3.16×105CFU，親本株SL1344ΔsseK1口服感染LD50為6.63×108CFU，重組菌株SL1344ΔsseK1 Δasd(pYA3493)口服感染LD50為5.24×108CFU，其毒力較強毒株SL1344下降了約103倍，而與親本株相比無明顯變化(表2)。

圖2 PCR鑒定SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)Fig.2 PCR identification of SL1344ΔsseK1Δasd(pYA 3493)Note:M.DNA marker Ladder(DL 5000);1.ddH2O control;2.SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493).

圖3 PCR鑒定asd缺失片段的穩(wěn)定性Fig.3 PCR identification of stability of Δasd mutantNote:M.DNA marker Ladder(DL 2000);1-6.The 10th,20th,30th,40th,50th and 60th generation of SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493);7.SL1344ΔsseK1 control;8.ddH2O control.

圖4 重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)、親本菌株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344的生長曲線Fig.4 Growth curves of SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493),SL1344ΔsseK1 and SL1344

表2 重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)，親本株SL1344ΔsseK1與強毒株SL1344的毒力測定

2.5重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的毒力穩(wěn)定性測定 將重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)第10、20、30、40、50、60代細菌經(jīng)平板法培養(yǎng)計數(shù)后，用無菌生理鹽水稀釋至預期濃度后感染小鼠，并計算LD50。利用引物pi1/pi2對小鼠肝臟分離到的細菌進行PCR擴增，可得到約580 bp的特異性條帶。應用Bliss法計算，重組菌株經(jīng)傳代后其口服感染LD50差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)免疫保護率的測定 對照1組小鼠7 d內(nèi)全部死亡；實驗1組7 d內(nèi)死亡2只，8～15 d死亡1只，其余5只存活至觀察期結束；對照2組和實驗2組8只小鼠均無死亡現(xiàn)象。經(jīng)SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)重組菌株免疫的小鼠對野毒強毒株攻毒有62.5%的免疫保護率。

3 討論

宿主-載體平衡致死系統(tǒng)又叫作染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，是解決外源質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的有效途徑[9]，同時解決了在實際生產(chǎn)中應用抗生素標記的質(zhì)粒載體表達外源抗原時帶來的抗藥性風險問題[10]。其原理為asd基因編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，而DAP又是革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖的必需成分，是形成細胞壁所必要的，所以若無外源DAP補充的情況下，asd基因的缺失會出現(xiàn)自發(fā)溶菌死亡現(xiàn)象。而互補的無抗性pYA3493含有asd基因的表達質(zhì)粒，因此，本研究將攜帶有asd基因的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至缺失了asd基因的突變株SL1344ΔsseK1Δasd之后可形成互補，進而構建出宿主-載體平衡致死系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅用營養(yǎng)缺陷代替了抗生素的選擇壓力，同時解決了質(zhì)粒丟失等外源基因表達不穩(wěn)定的問題[11]，為沙門菌活疫苗載體的研發(fā)開辟了新的途徑。同時，本研究在缺失菌株構建上運用重組自殺性質(zhì)粒pREΔasd介導的細菌等位基因交換技術進行，與以往同源重組及轉(zhuǎn)座子隨機插入等傳統(tǒng)的方法相比，自殺性質(zhì)粒同時具備負向和正向兩種篩選標記，正向氯霉素(Cm)標記選擇有助于在接合轉(zhuǎn)移的第一步迅速篩選出含有抗性的接合子，負向蔗糖敏感基因(SacB)標記選擇有助于加速第二步的同源重組，具有重組率高、篩選方便等諸多優(yōu)點，很大程度上提高了重組的速度和幾率[7]。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌sseK1基因缺失后其毒力會發(fā)生顯著的降低，并且具有較好的免疫原性。因此，本研究運用鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsseK1株作為親本菌，用接合轉(zhuǎn)移的方法將含有缺失315 bp的asd基因的重組自殺性質(zhì)粒導入鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsseK1中，通過同源重組、抗性篩選標記和PCR檢測技術，最終篩選出不含任何抗性的SL1344ΔsseK1Δasd缺失株，然后將含有asd基因的無抗性pYA3493質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至上述缺失株，獲得SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)重組菌株。并對其生物學特性進行了比較研究，重組菌株的生長速度、生化特性與親本株SL1344ΔsseK1保持一致，說明asd基因并不影響親本株SL1344ΔsseK1的生長速度與生化特性，并且具有遺傳穩(wěn)定性。小鼠毒力測定試驗表明，重組菌株SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)的毒力較強毒株SL1344約下降至0.048%，與親本株SL1344ΔsseK1的安全性基本相同，說明由于無抗性質(zhì)粒pYA3493攜帶有asd基因可與SL1344ΔsseK1Δasd形成互補，對毒力不構成影響，具有良好的安全性，可用于外源基因的穩(wěn)定表達。小鼠免疫保護實驗結果顯示SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)重組菌株免疫后野毒攻毒有62.5%的免疫保護率，與親本株SL1344ΔsseK1的免疫保護力基本一致，這可能與sseK1基因作為T3SS的一種調(diào)節(jié)底物，缺失后能夠降低或終止對某些免疫原性基因的易位和表達產(chǎn)物的分泌有關，但具體機制尚需要進一步驗證。

總之，本研究成功構建了鼠傷寒沙門菌SL1344株ΔsseK1Δasd缺失株平衡致死系統(tǒng)，并對其生物學特性進行了檢測。研究表明，外源質(zhì)粒PYA3493能夠穩(wěn)定存在于該系統(tǒng)中，并具有遺傳穩(wěn)定性，這與張俊峰等[10]報道的豬霍亂沙門菌的結果一致，該系統(tǒng)能夠克服外源基因不能穩(wěn)定遺傳的問題，同時，該系統(tǒng)沒有任何抗生素基因的標記，不會帶來生物安全問題，并且毒力發(fā)生了明顯的降低，具有較好的免疫原性，為進一步將減毒鼠傷寒沙門菌開發(fā)為一種更加安全高效的口服多價疫苗活載體提供了新的靶點。

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[收稿2017-05-26]

(編輯 張曉舟)

Constructionandcharacterizationofhost-vectorbalancedlethalsystemofattenuatedSalmonellatyphimuriumSL1344ΔsseK1Δasd

YANGYa-Dong,DINGKe,ZHANGChun-Jie,CHENGXiang-Chao，JIAYan-Yan，HELei.
TheKeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicHealth,HenanUniversityofScienceandTechnology/LuoyangKeyLaboratoryofLiveCarrierBiomaterialandAnimalDiseasePreventionandControl,Luoyang471023,China

Objective:To develop a host-vector balanced lethal system of attenuated Salmonella typhinurium secreted effector K1 mutant,and an live vaccine vector which stably carries exogenous genes.MethodsWe constructed SL1344ΔsseK1Δasd mutant strain by recombinant suicide plasmid(pREΔasd),and screened by two-step method,transformed pYA3493 plasmid containing the asd gene without resistance electric into the mutant strain of SL1344ΔsseK1Δasd,then the recombinant strain SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493) was constructed successfully.ResultsThe results of PCR and sequencing showed that SL1344ΔsseK1Δasd(pYA3493)was constructed successfully.Further studies had shown that the serotype of the recombinant strain was identical to the parent SL1344ΔsseK1 and wild SL1344 strains,and the mutant was stable with the recombinant Δasd gene in vitro.It was found that the recombinant strain had displayed identical growth profile and biochemical characteristics compared with the parent SL1344ΔsseK1 strain and wild SL1344 strain.The oral challenge of bacteria in mice revealed that LD50 of the recombinant strain was 5.24×108CFU,and the toxicity reduced to about 0.048%;the immunoprotective effect assay showed that the protection rate infected with wild strain of Salmonella typhimurium was 62.5% on the 17th day post-immunization,which was identical to the parent SL1344ΔsseK1.ConclusionThese results show that the secreted effector K1 gene deleted mutant host-vector balanced lethal system of Salmonella typhimurium SL1344 strain has been successfully constructed,and genetic stability,significantly reduced virulence,which has laid a foundation for developing potential oral live vaccin vector to express foreign genes.

Salmonella typhimurium;Suicide plasmid;Host-vector balanced lethal system;Live vaccine vector

①本文受河南省科技攻關項目(112102110019)資助。

S852.612

A

1000-484X(2017)10-1520-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.016

楊亞東(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事人畜共患病的診斷和防治研究，E-mail：youngyadong@139.com。

及指導教師：張春杰(1964年-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事動物疫病防控和分子免疫學方面的研究，E-mail：cjzhang@sina.com。