新型HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶雙靶點抑制劑的虛擬篩選

肖澤云　李凱　李愛秀

[摘要] 目的 構(gòu)建3-OH HEPT類針對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶非核苷類抑制劑作用靶點和整合酶的雙靶點抑制劑[RT（NNRTI）/IN]藥效團模型，對中藥化學數(shù)據(jù)庫（TCMD）進行搜索，尋找潛在的新型HIV雙靶點抑制劑。 方法 從已知的3-OH HEPT類HIVRT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑出發(fā)，構(gòu)建藥效團模型，基于藥效團模型和Lipinski五規(guī)則對TCMD進行篩選，發(fā)現(xiàn)新的抗HIV雙靶點抑制劑。 結(jié)果 構(gòu)建的藥效團模型包括6個藥效特征基團，以符合6個藥效特征基團中任意5個為條件，在測試集數(shù)據(jù)庫中驗證性搜索命中全部16個化合物，檢出率達到了100%。利用所建的六點藥效團模型和Lipinski五規(guī)則對TCMD篩選，得到符合條件的化合物229個，其中包含已知的抗HIV活性化合物。 結(jié)論 建立的藥效團模型和篩選策略為后續(xù)研究打下了較好的基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 3-OH HEPT衍生物；RT（NNRTI）/IN；雙靶點抑制劑；藥效團模型；虛擬篩選

[中圖分類號] R918 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To create the pharmacophore of 3-OH HEPT derivatives of dual inhibitors against HIV non-nucleoside reverse transcriptase inhibit or binding pocket and integrase [RT（NNRTI）/IN]， filter traditional Chinese medicine database （TCMD） with the pharmacophore， and find novel dual inhibitors of HIV. Methods Based on the known 3-OH HEPT derivatives against HIV RT（NNRTI）/IN， the pharmacophore was created. TCMD was filtered with the pharmacophore and Lipinski's five rules. Results The pharmacophore of six features was created. 16 molecules which matched five out of the six features were hit by searching from texting database， and the detection rate was 100%. 229 compounds were hit when used the pharmacophore of six features and Lipinski's five rules to filter TCMD， which contained compounds that were known inhibitors of HIV. Conclusion The pharmacophore and the screening strategy lay a good foundation for further studies.

[Key words] 3-OH HEPT derivatives； RT（NNRTI）/IN； Dual inhibitors； Pharmacophore； Virtual screening

艾滋?。ˋIDS）是由人體免疫缺陷病毒（HIV）引起的獲得性免疫缺陷綜合征，其治療一直是全世界關(guān)注的焦點。目前，AIDS尚沒有根本治愈的方法，是與癌癥并列的全球十大醫(yī)學難題之一，臨床上主要采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄療法（highly active anti-retrovirus therapy，HAART）治療AIDS，屬于多組分多靶點藥物組合療法。然而，HAART多藥聯(lián)合容易引起HIV病毒的交叉耐藥[1]，治療方案的復雜性，嚴重的藥物毒副作用以及高昂的治療費用影響了患者的依從性。針對HAART的治療現(xiàn)狀，單組分多靶點抗HIV藥物成為研發(fā)熱點。

目前，HIV單組分多靶點藥物仍處在先導化合物的發(fā)現(xiàn)和活性測試階段，尚未有化合物進入臨床研究[2-3]。通過合理藥物設(shè)計和篩選途徑得到的HIV單組分多靶點抑制劑包括異靶標多靶點抑制劑[4-12]和針對同靶標不同活性部位的多靶點抑制劑[13-14]，其中以作用于非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）作用位點和整合酶（integrase，IN）鏈轉(zhuǎn)移抑制劑（strand transfer inhibitor of integrase，INSTI）活性位點的雙靶點抑制劑[簡寫為“RT（NNRTI）/IN”][4-9]居多，主要包含3-OH HEPT衍生物[4-5]、TNK-651和二酮酸（DKA）融合型[6-7]、TNK-651和GS-9137融合型[8]以及地拉韋啶（DLV）和DKA融合型[9]等。

Tang等[4-5]基于合理藥物設(shè)計理念，合成了一系列3-OH HEPT類衍生物，抗HIV實驗發(fā)現(xiàn)其中一部分化合物對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和IN均有抑制活性。雖然尚未有3-OH HEPT類化合物進入抗HIV臨床研究，但已證明該類化合物母核3-羥基嘧啶-2，4-二酮是具有潛力的抗HIV雙靶點抑制劑母核。本研究以已知的3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑為研究對象，運用構(gòu)象搜索、構(gòu)象疊合和藥效團識別技術(shù)[15-16]，構(gòu)建3-OH HEPT類RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑藥效團模型，并結(jié)合Lipinski五規(guī)則對中藥化學數(shù)據(jù)庫（TCMD）進行篩選，從中尋找潛在的新型HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 TCMD

TCMD[17]是由中科院過程工程研究所分子設(shè)計課題組研發(fā)的科學數(shù)據(jù)庫產(chǎn)品，本研究所用版本為TCMD2003.1，包括9127個化合物結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息。

1.1.2 分子模擬與分子設(shè)計軟件包（MOE）

MOE[18]由加拿大Chemical Computer Group公司開發(fā)，本研究使用的版本為MOE2009.10。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建數(shù)據(jù)庫

對文獻報道的化學合成的3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑進行收集、整理，通過MOE數(shù)據(jù)庫構(gòu)建模塊構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 構(gòu)建藥效團模型

1.2.2.1 構(gòu)象搜索 在MOE構(gòu)象搜索模塊對化合物1～5進行構(gòu)象搜索，得到其最低能量構(gòu)象。參數(shù)設(shè)置如下：搜索策略選擇LowModeMD；構(gòu)象能量截斷值（cutoff）設(shè)定為7 kcal/mol，即能量大于E-min+cutoff（E-min是全局極小值）的構(gòu)象將被刪除；RMS梯度（Gradient）為0.005；RMSD限定值為0.25？魡；其他參數(shù)保留默認設(shè)置。

1.2.2.2 識別藥效特征基團 在MOE分子疊合模塊，將抑制劑分子1～5最低能量構(gòu)象進行疊合，保留最佳疊合構(gòu)象。然后利用MOE藥效團分析模塊研究化合物1～5共有的藥效特征基團。設(shè)置如下參數(shù)：化合物的構(gòu)象分析方式為As-Is；化合物均為活性分子；藥效特征基團半徑小于等于1.4？魡；生成藥效特征基團個數(shù)最多為6個，此外，藥效特征基團活性分子覆蓋率為90%；其他參數(shù)保留默認值。

1.2.2.3 構(gòu)建藥效團模型 在MOE藥效團構(gòu)建模塊完成，具體步驟如下：①在MOE藥效團構(gòu)建模塊導入最佳疊合構(gòu)象，根據(jù)“1.2.2.2”中得到的共有藥效特征基團，在Unified Info模塊設(shè)定藥效特征基團組合方式；②運用藥效團Consensus模塊分析最佳疊合構(gòu)象，設(shè)定藥效特征基團半徑以及相互之間的空間距離限制，構(gòu)建藥效團模型；③以構(gòu)建的藥效團模型為提問結(jié)構(gòu)，對測試集數(shù)據(jù)庫進行驗證性搜索，調(diào)整藥效特征基團半徑和藥效特征基團組合模式，使命中化合物達到最多。

1.2.3 數(shù)據(jù)庫搜索

以構(gòu)建的藥效團模型為提問結(jié)構(gòu)，運用MOE數(shù)據(jù)庫搜索模塊，對TCMD進行篩選，然后再根據(jù)Lipinski五規(guī)則[19]，濾掉不符合條件的化合物。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

對文獻報道的3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑進行總結(jié)，構(gòu)建測試集數(shù)據(jù)庫3-OHHEPTMDB，包括16個化合物（表1）。從中選擇剛性較強、活性較高的化合物1～5構(gòu)建藥效團模型。

2.2 藥效特征基團計算結(jié)果

根據(jù)藥效特征基團計算結(jié)果，結(jié)合文獻中3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑與RT和IN分子模擬結(jié)果[4-5]，得到化合物1～5共有的藥效特征基團包括疏水中心或芳環(huán)中心兩個，二價金屬離子螯合中心兩個，金屬離子螯合中心或氫鍵給體一個，芳環(huán)中心一個。藥效特征基團與最佳疊合構(gòu)象見圖1。

2.3 藥效團模型

本研究構(gòu)建了3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑六點藥效團模型（圖2），其中包含INSTI藥效特征基團二價金屬離子螯合中心F1、F3，半徑均為0.7？魡；NNRTI和INSTI共有的藥效特征基團金屬離子螯合中心或氫鍵給體F2，半徑為0.7？魡；芳環(huán)中心F4，半徑為1.5？魡；疏水中心或芳環(huán)中心F5和F6，半徑均為1.5？魡。以所建六點藥效團模型為提問結(jié)構(gòu)，對3-OHHEPTMDB進行驗證性搜索，命中6個化合物，檢出率為37.5%；以符合6個藥效特征基團中任意5個為條件，命中全部16個化合物，檢出率達到了100%。

2.4 數(shù)據(jù)庫搜索

基于所建六點藥效團模型對TCMD進行篩選，命中445個化合物。根據(jù)Lipinski五規(guī)則，濾掉不符合條件的化合物，得到229個化合物，其中黃酮類化合物居多，與藥效團模型匹配較好的黃酮類化合物蛇葡萄素（Ampeloptin）結(jié)構(gòu)式及其空間構(gòu)象與藥效團模型疊合見圖3。

3 討論

本研究以已知的3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑為出發(fā)點，構(gòu)建了3-OH HEPT類HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑六點藥效團模型，既包括分別屬于NNRTI和INSTI的藥效特征基團，又含有INSTI與NNRTI共有的藥效特征基團，綜合運用藥效團模型和Lipinski五規(guī)則對TCMD進行篩選，得到符合條件的化合物229個。

在構(gòu)建藥效團模型的過程中，本研究定義C-6位芐基為疏水中心或芳環(huán)中心F5，而Tang等[4-5]通過分子模擬研究發(fā)現(xiàn)C-6位芐基基團作用于NNIBP氨基酸殘基Y188，在分子水平驗證了藥效特征基團F5選擇的合理性。此外，Tang等[4-5]對HEPT類進行分子對接研究發(fā)現(xiàn)N-1位的芐基基團結(jié)合點位于DNA與IN結(jié)合的疏水口袋，而本研究構(gòu)建的藥效團模型定義N-1位的芐基基團為芳環(huán)中心或疏水中心F6。分子對接的實驗結(jié)果表明，N-3羥基不僅能夠與RT NNIBP的氨基酸殘基Lys101之間形成氫鍵相互作用，而且能夠螯合IN活性口袋中的二價金屬離子Mg2+，N-3羥基為NNRTI和INSTI共有的藥效特征基團，定義N-3羥基為氫鍵受體或金屬離子螯合中心F2。此外，根據(jù)藥效特征基團分析結(jié)果，分別定義嘧啶環(huán)2，4位羰基為金屬離子螯合中心F1和F3。以構(gòu)建的六點藥效團模型為提問結(jié)構(gòu)，對3-OHHEPT.mdb進行驗證性搜索，符合6個藥效特征基團中任意5個的檢出率達到了100%，驗證了所建藥效團模型的合理性。endprint

虛擬篩選得到化合物以黃酮類化合物居多，已有實驗研究表明蛇葡萄素能夠減少HIV p24抗原的表達，并干擾HIV與靶細胞的融合，進而抑制HIV的感染[20]，本研究預測其也有可能通過作用于RT和IN來發(fā)揮抗HIV作用。目前，已有部分黃酮類化合物被證實是HIV RT和IN雙靶點抑制劑，如黃芩苷、黃芩素、槲皮素等，黃酮類化合物是具有較大潛力的HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑。但由于藥效團篩選是基于配體結(jié)構(gòu)的篩選，沒有考慮化合物與酶的相互契合，會得到假陽性結(jié)果。本研究篩選出的化合物將有待進一步通過分子對接、ADME/T等篩選，并通過實驗驗證，從而發(fā)現(xiàn)新型HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑先導化合物。

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（收稿日期：2017-06-24 本文編輯：程 銘）endprint