• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鈣離子調(diào)控微絲切割蛋白中A6亞基解折疊的單分子力譜研究?

    2017-10-23 07:17:06李鵬飛曹毅秦猛王煒
    物理學(xué)報 2017年19期
    關(guān)鍵詞:微絲肌動蛋白緩沖液

    李鵬飛 曹毅 秦猛 王煒

    (南京大學(xué)物理學(xué)院,固體微結(jié)構(gòu)國家實驗室,南京 201193)

    鈣離子調(diào)控微絲切割蛋白中A6亞基解折疊的單分子力譜研究?

    李鵬飛 曹毅 秦猛?王煒

    (南京大學(xué)物理學(xué)院,固體微結(jié)構(gòu)國家實驗室,南京 201193)

    在生命活動中,金屬離子扮演了非常重要的角色.微絲切割蛋白(adseverin)需要鈣離子的活化才能行使其切割肌動蛋白微絲的功能.本文通過基于原子力顯微鏡的單分子力譜研究了微絲切割蛋白C端末的A6亞基在結(jié)合鈣離子前后的力學(xué)解折疊機理.實驗結(jié)果顯示:在未結(jié)合鈣離子時,A6的解折疊表現(xiàn)為兩態(tài)過程;在結(jié)合鈣離子后A6力學(xué)穩(wěn)定性顯著提高;同時,鈣離子的結(jié)合使得A6解折疊過程中出現(xiàn)穩(wěn)定的中間態(tài).通過對中間態(tài)的鏈長的分析,我們推測了中間態(tài)對應(yīng)著A6的N端部分解折疊.而這一部分的解折疊可以使得掩藏在該結(jié)構(gòu)后的A5亞基中肌動蛋白微絲結(jié)合位點暴露,從而促使微絲切割蛋白執(zhí)行功能.我們的實驗結(jié)果為理解微絲切割蛋白的工作原理提供了新的實驗證據(jù).

    微絲切割蛋白,單分子力譜,解折疊,中間態(tài)

    1 引 言

    金屬離子在生命活動中扮演這非常重要的角色,例如鉀離子使神經(jīng)纖維產(chǎn)生內(nèi)外電位差并維持其穩(wěn)定,使得神經(jīng)電信號實現(xiàn)傳導(dǎo),鎂離子能夠激活多種酶的活性,鈉離子能夠維持生物體的內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很多蛋白質(zhì)完成其生物功能的重要保證.鐵離子與血紅蛋白的結(jié)合使得氧運輸?shù)靡詫崿F(xiàn),銅離子與銅伴侶蛋白的結(jié)合使生物體能夠正常利用銅離子,促進鐵的吸收與利用[1].在生物體中,鈣離子同樣執(zhí)行著非常重要的功能.鈣離子是骨骼構(gòu)成的重要物質(zhì),同時,鈣離子對于維持肌肉正常的收縮-舒張也有至關(guān)重要的意義.鈣離子與凝溶膠蛋白的結(jié)合使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,暴露其肌動蛋白的結(jié)合位點從而被激活行使生物功能[2?4].同時,鈣離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合也可能使蛋白質(zhì)本身的力學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化.有研究表明,一些蛋白質(zhì)與鈣離子結(jié)合后,其本身的力學(xué)穩(wěn)定性得到增強[5].本文利用基于原子力顯微鏡的單分子力譜方法,研究了受鈣離子調(diào)控的微絲切割蛋白的C端末端結(jié)構(gòu)域(A6)的受力解折疊性質(zhì)隨鈣離子結(jié)合的變化.

    原子力顯微鏡單分子力譜技術(shù)是新興的能夠很好地研究分子本身力學(xué)性質(zhì)以及分子間相互作用強度的手段[6?8],在高分子材料[9?11]、細胞生物學(xué)[12]、力化學(xué)等[13,14]方面也有廣闊的應(yīng)用前景.其在生物大分子的研究方面,例如蛋白質(zhì)的解折疊研究[15,16]、DNA和RNA性質(zhì)研究[17?19]、生物分子間的相互作用研究[20,21]都有著很好的應(yīng)用.通過單分子力譜,我們可以直接獲得所研究體系的力分布,同時,通過對所得力分布進行分析,根據(jù)Kramers方程,可以得到體系的壽命,解離常數(shù)(K0)以及轉(zhuǎn)變態(tài)長度(?x),進而通過Bell模型,得到體系的自由能分布[22?24].

    微絲切割蛋白通過本身存在的肌動蛋白結(jié)合位點與微絲結(jié)合,執(zhí)行對微絲切割、加帽活性以及成核的功能[25,26].在未結(jié)合鈣離子時,其結(jié)構(gòu)無法與肌動蛋白契合,因此不能與微絲結(jié)合.結(jié)合鈣離子后,其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,A4與A6兩個亞基能夠形成一個與肌動蛋白結(jié)構(gòu)符合的面,進而執(zhí)行其功能(圖1)[4].在其功能執(zhí)行過程中,會受到微絲的牽引而受力,因此其力學(xué)穩(wěn)定性對于其功能的實現(xiàn)具有重要的意義.微絲切割蛋白與肌動蛋白結(jié)合后,位于A5上的纖維形肌動蛋白結(jié)合及成核位點是被包埋住的[27],我們發(fā)現(xiàn)A6蛋白質(zhì)在結(jié)合鈣離子后,其解折疊過程可能會出現(xiàn)穩(wěn)定的中間態(tài),從而在不影響A6與肌動蛋白結(jié)合的情況下,暴露出位于A5上的結(jié)合位點.

    圖1 (網(wǎng)刊彩色)微絲切割蛋白中結(jié)合鈣離子后A4—A6結(jié)合域的三維結(jié)構(gòu)圖(PDB ID:3FG6) 圖中黑色球體代表鈣離子;綠色、橙色以及紅色結(jié)構(gòu)分別對應(yīng)A4—A6;紫紅色部分為位于A5上的肌動蛋白結(jié)合及成核位點;紫色部分對應(yīng)A6蛋白質(zhì)解折疊的中間態(tài)打開部分;棕色位置為A4—A6的N端(甘氨酸396);藍色位置為其C端(色氨酸715)Fig.1.(color online)3D-structure of Ca-bound A4–A6 domain of adseverin(PDBID:3FG6). Ca2+ions are shown as black spheres;the amaranthine part in A5(orange)depicts the actin binding and nucleating module and the purple part corresponds to the unfolding segment in intermediate state of A6(red);the N-terminus of A4–A6 is shown in brown;while the C-terminus is shown in blue.

    2 實驗方法

    2.1 蛋白質(zhì)載體構(gòu)建及表達

    A6與GB1融合蛋白的基因通過基因工程的方法構(gòu)建.A6基因和GB1基因分別來自于Robert Robinson教授和Hongbin Li的實驗室.多聚蛋白基因通過限制性核酸內(nèi)切酶BamHI及BglII產(chǎn)生的相同黏性末端連接來實現(xiàn),在pUC19載體里完成構(gòu)建.最終多聚蛋白基因通過測序確認,并轉(zhuǎn)入pQE80L載體,通過大腸桿菌BL-21菌株進行表達.由于表達載體上目的基因前端有6個組氨酸編碼,因此所得目的蛋白質(zhì)N端會有六個組氨酸標(biāo)記,能夠特異性地與鈷離子結(jié)合,純化過程使用鈷離子親和樹脂完成.之后,純化所得蛋白質(zhì)溶液加入1 mmol EGTA去除鈣離子和其他金屬離子后在Tris緩沖液(25 mmol Tris,72 mmol氯化鈉,pH=7.4)中進行透析,4°C保存.

    2.2 單分子力譜實驗

    實驗通過原子力顯微鏡(ForceRobot 300,JPK,柏林,德國)實現(xiàn),在Tris緩沖液中進行,結(jié)合鈣離子的A6解折疊實驗在緩沖液中加入1 mmol氯化鈣.實驗時,將150μL蛋白質(zhì)溶液滴加到玻璃基板上,吸附20 min后使用Tris緩沖液沖洗掉多余的蛋白質(zhì),之后加入緩沖液即可進行實驗.實驗所用探針(Biolever-RC-150VB-70,Olympus)的勁度系數(shù)通過能量均分定理確定,其特征值為7 pN/nm.實驗所用拉伸速度為400 nm/s.

    3 實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

    我們構(gòu)建了(GB1-A6)4(圖2(a))多聚蛋白進行單分子力譜.GB1與A6交疊連接,可以防止A6蛋白之間相互影響[28].蛋白質(zhì)通過物理吸附的方式吸附在玻璃基板上,實驗時,原子力顯微鏡探針下壓到基板上時,有與蛋白質(zhì)結(jié)合的概率,這樣抬起探針的過程中,蛋白質(zhì)被拉伸,通過探測探針受蛋白質(zhì)牽引的偏轉(zhuǎn)即可得到蛋白質(zhì)解折疊過程的力響應(yīng).我們分別在無鈣離子以及含有1 mmol的溶液中對(GB1-A6)4進行了單分子力譜實驗.基于原子力顯微鏡的單分子力譜所得多聚蛋白質(zhì)解折疊圖像為鋸齒狀峰,其形成原因為蛋白質(zhì)本身是有結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基多聚分子,當(dāng)受力解折疊后,轉(zhuǎn)變?yōu)楸焕钡亩嚯逆?釋放一段長度,其中GB1解折疊事件為間隔18 nm的峰,峰高約為150 pN.我們使用蠕蟲鏈模型擬合蛋白質(zhì)分子鏈受力與拉伸距離的關(guān)系.在同一條力譜曲線上,如果觀察到GB1的特征峰,那么由于A6也在同一個多聚蛋白上,應(yīng)觀察到其解折疊事件理應(yīng)被觀察到.因此,在力譜圖中,GB1解折疊事件之前,間隔35 nm的峰即代表A6的解折疊.由于A6蛋白質(zhì)擁有101個氨基酸殘基(微絲切割蛋白中614—715殘基),每個氨基酸殘基延伸長度為0.365—0.4 nm,A6折疊狀態(tài)N端到C端長度為3.5 nm,因此完全打開A6蛋白應(yīng)該獲得33.4—36.9 nm的長度延伸,這與所得實驗結(jié)果是符合的.統(tǒng)計A6的解折疊事件,即可得到其解折疊力分布直方圖.結(jié)果顯示,在A6沒有結(jié)合鈣離子的情況下,其解折疊力平均值為25.4 pN±6.0 pN(平均值±標(biāo)準差,n=99),在A6結(jié)合鈣離子的情況下,其解折疊力上升至44.7 pN±6.8 pN(n=164).這說明鈣離子的結(jié)合提高了A6蛋白質(zhì)的力學(xué)穩(wěn)定性.值得注意的是,探針吸附多聚蛋白的位置是隨機的,這使得所得數(shù)據(jù)并非一定包含所有結(jié)構(gòu)域的解折疊事件[29].

    在對A6解折疊事件進行分析的過程中,我們發(fā)現(xiàn)A6蛋白質(zhì)在結(jié)合鈣離子情況下解折疊有時會存在中間態(tài)(圖3(a)).這意味著在結(jié)合鈣離子的情況下,A6蛋白質(zhì)受力拉伸時,有分步完成解折疊的概率.該中間態(tài)的長度均為7.2 nm.同時對比中間態(tài)出現(xiàn)后的殘余A6部分的力學(xué)強度,我們認為解折疊中間態(tài)出現(xiàn)后,鈣離子并未從A6上脫落.根據(jù)單個氨基酸的長度0.365 nm估算,該中間態(tài)對應(yīng)著長度約20個氨基酸的結(jié)構(gòu)被打開,且剩余結(jié)構(gòu)仍然有較高的力學(xué)強度.鈣離子通過644位的天冬氨酸以及666位的谷氨酸與A6結(jié)合.根據(jù)實驗結(jié)果分析其結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)只有從A6的N端(614位脯胺酸)到643位天冬氨酸打開符合所有條件(圖3(e)).同時對比A4—A6部分與肌動蛋白結(jié)合的情況,正是該部分結(jié)構(gòu)對A5上的肌動蛋白結(jié)合位點的覆蓋使其被隔離,因此我們猜想當(dāng)微絲切割蛋白與微絲結(jié)合,微絲切割蛋白受微絲牽引導(dǎo)致部分解折疊,暴露A5上的結(jié)合位點,從而使其激活了肌動蛋白成核功能.

    對所得力分布使用Dudko-Hummer-Szabo方程,可以得到對應(yīng)力條件下體系的壽命τ:

    圖2 (網(wǎng)刊彩色)(GB1-A6)4的單分子力譜實驗結(jié)果 (a)(GB1-A6)4單分子力譜實驗示意圖,圖中紅色方塊代表GB1,藍色圓代表A6;(b)無鈣離子結(jié)合狀態(tài)下(GB1-A6)4的力譜圖,圖中藍色曲線為A6解折疊事件的蠕蟲鏈模型擬合曲線,紅色曲線為GB1解折疊的擬合曲線;(c)無鈣離子結(jié)合狀態(tài)下的A6解折疊力分布直方圖,藍色曲線為該分布的高斯擬合;(d)在1 mmol鈣離子緩沖液中(GB1-A6)4的力譜曲線圖;(e)1 mmol鈣離子緩沖液中A6解折疊力分布直方圖Fig.2.(color online)Mechanical properties of A6 probed by single-molecule AFM:(a)A schematic of polyprotein(GB1-A6)4used for single-molecule force spectroscopy experiment,red squares and blue circles represent GB1 and A6 domains,respectively;(b)typical unfolding trace for Ca-free(GB1-A6)4,worm-like chain fi tting curves for A6 and GB1 are shown in blue and red,respectively;(c)unfolding force histogram of Ca-free A6;(d)typical unfolding trace for Ca-bound(1 mmol Ca2+)(GB1-A6)4;(e)unfolding force histogram for Ca-bound A6.

    圖3 (網(wǎng)刊彩色)結(jié)合鈣離子情況下A6解折疊的中間態(tài) (a)存在解折疊中間態(tài)的(GB1-A6)4單分子力譜曲線,藍色及棕色曲線分別為A6蛋白質(zhì)兩步解折疊的蠕蟲鏈模型擬合曲線,紅色曲線為GB1解折疊的擬合曲線;(b)—(d)為(a)中A6解折疊力譜圖的放大圖;(e)A6的結(jié)構(gòu)圖,紫色部分為猜想的解折疊中間態(tài)打開部分(614—643位氨基酸),藍色標(biāo)注為A6上的鈣離子結(jié)合位點,分別為644位天冬氨酸以及666位谷氨酸,淺藍色位置為A6的N端(脯胺酸614),橙色位置為A6的C端(色氨酸725)Fig.3.(color online)The unfolding intermediate state of Ca-bound A6:(a)The unfolding trace for(GB1-A6)4with intermediate states appeared,blue and brown curves are the worm-like chain fi tting for two steps of A6 unfolding,respectively;(b)–(d)details of unfolding intermediate states of A6 in Fig.(a);(e)structure of A6,the proposed unfolded segment(residues 614–643)in intermediate state is shown in purple,and the Ca2+binding sites(Asp644 and Glu666)are shown in blue,N-terminus of A6 is shown in light blue(Pro614)and C-terminus is shown in orange(Trp715).

    方程中F0為直方圖中力的開始點,N為直方總數(shù),?F為每個直方的寬度,hk為第k個直方占總的比例,i與k為直方的編號,˙F為力的加載速率.

    將所得體系的壽命-力關(guān)系(圖3(a))代入Krammers方程并聯(lián)立Bell模型進行擬合,即可得到體系在不受力情況下的壽命τ0以及轉(zhuǎn)變態(tài)長度?x:

    kB為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對溫度.

    經(jīng)擬合得到無鈣離子結(jié)合的情況下,A6蛋白質(zhì)在不受力的情況下壽命τ0為0.5 ms,解折疊轉(zhuǎn)變態(tài)長度?x1為0.82 nm,在結(jié)合鈣離子的情況下,其壽命τ0提高至13.4 ms,解折疊轉(zhuǎn)變態(tài)長度?x不變.在有解折疊中間態(tài)的情況下,第一步解折疊的τ0及?x不變,第二步解折疊的τ0為4.9 ms,?x3為1.1 nm.

    壽命τ0的倒數(shù)即為解離常數(shù)k0,由阿倫尼烏斯方程:

    方程中?G為反應(yīng)的自由能勢壘,A為表征自由能形面的指前因子,在本體系中,A取106s?1,經(jīng)計算得無鈣離子結(jié)合時,A6蛋白質(zhì)自發(fā)解折疊的自由能勢壘高度為6.2kBT,結(jié)合鈣離子情況下,A6蛋白質(zhì)自發(fā)解折疊的自由能勢壘提高到9.5kBT,解折疊中間態(tài)第一步勢壘與其相同,第二步勢壘高度為8.5kBT.由計算結(jié)果可知,該中間態(tài)可相對穩(wěn)定存在.由此可得到體系的自由能曲線,如圖4(b)所示.

    圖4 (網(wǎng)刊彩色)A6蛋白質(zhì)在有無鈣離子結(jié)合情況下的壽命-力分布及自由能曲線 (a)藍色三角形代表無鈣離子結(jié)合情況下A6的壽命-力關(guān)系,紅色圓形代表結(jié)合鈣離子情況下的壽命-力分布,紫色方塊代表A6解折疊中間態(tài)第二步的壽命-力關(guān)系,圖中藍色、紅色以及紫色曲線分別為三種情況下的Krammers方程擬合;(b)圖中藍色曲線為無鈣離子結(jié)合情況下的A6蛋白質(zhì)自由能曲線,紅色曲線則對應(yīng)于結(jié)合鈣離子情況下無解折疊中間態(tài)的自由能分布,紫色曲線對應(yīng)于結(jié)合鈣離子情況下有解折疊中間態(tài)的自由能分布Fig.4.(color online)The lifetime-force plot and unfolding free-energy landscape for A6 under Ca-free and Ca-bound conditions:(a)Blue,red and purple markers represent the lifetime-force relationships for Cafree,Ca-bound and second step for unfolding intermediate state of A6,and the corresponding colour curves represent the Krammers-analysis;(b)blue,red and purple curves represent the free-energy landscape for Ca-free,Ca-bound and condition of unfolding with intermediate state of A6.

    4 結(jié) 論

    本文通過單分子力譜結(jié)合蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究了微絲切割蛋白的A6亞基的力學(xué)解折疊.結(jié)果表明,A6蛋白在結(jié)合鈣離子之前,其穩(wěn)定性較差.但結(jié)合鈣離子后,A6蛋白的力學(xué)強度及穩(wěn)定性有明顯的提高.這使得微絲切割蛋白能夠穩(wěn)定地執(zhí)行其生物功能.同時A6蛋白質(zhì)在結(jié)合鈣離子情況下受力可進入穩(wěn)定的中間態(tài),此中間態(tài)可能導(dǎo)致A5上的結(jié)合位點暴露,使其功能被激活.具體的驗證有待進一步的研究.

    [1]Lee J,Pena M M,Nose Y,Thiele D J 2002J.Biol.Chem.277 4380

    [2]Nag S,Larsson M,Robinson R C,Burtnick L D 2013Cytoskeleton70 360

    [3]Silacci P,Mazzolai L,Gauci C,Stergiopulos N,Yin H L,Hayoz D 2004Cell Mol.Life Sci.61 2614

    [4]Chumnarnsilpa S,Lee W L,Nag S,Kannan B,Larsson M,Burtnick L D,Robinson R C 2009Proc.Natl.Acad.Sci.USA106 13719

    [5]Lü C,Gao X,Li W,Xue B,Qin M,Burtnick L D,Zhou H,Cao Y,Robinson R C,Wang W 2014Nat.Commun.5 4623

    [6]Qian H,Chen H,Yan J 2016Acta Phys.Sin.65 188706(in Chinese)[錢輝,陳虎,嚴潔2016物理學(xué)報 65 188706]

    [7]Zhang W K,Wang C,Zhang X 2003Chin.Sci.Bull.48 7(in Chinese)[張文科,王馳,張希 2003科學(xué)通報 48 7]

    [8]Cui S X 2016Acta Polymerica Sinica2016(9)1160

    [9]Feng W,Wang Z,Zhang W 2017Langmuir33 1826

    [10]Zhang X,Zhang W K,Li H B,Shen J C 2000Prog.Nat.Sci:Nat.Key Lab.Newsletter10 385(in Chinese)[張希,張文科,李宏斌,沈家驄 2000自然科學(xué)進展:國家重點實驗室通訊10 385]

    [11]Pang X C,Cheng B,Cui S X 2016Chinese Journal of Polymer Science34 578

    [12]Yu X T,Yang Z B,Wang X Y,Tang M J,Wang Z Z,Wang H B 2016Prog.Biochem.Biophys.43 28(in Chinese)[于小婷,楊忠波,王鑫艷,湯明杰,王占忠,王化斌2016生物化學(xué)與生物物理進展43 28]

    [13]Xue Y,Li X,Li H,Zhang W 2014Nat.Commun.5 4348

    [14]Cheng B,Cui S X 2015Polymer Mechanochemistry369 97

    [15]Yuan G,Le S,Yao M,Qian H,Zhou X,Yan J,Chen H 2017Angew.Chem.Int.Ed.Engl.56 5490

    [16]Gao X,Qin M,Yin P,Liang J,Wang J,Cao Y,Wang W 2012Biophys.J.102 2149

    [17]Feng W,Wang Z,Zhang W 2017Langmuir33 1826

    [18]Luo Z,Cheng B,Cui S 2015Langmuir31 6107

    [19]Yang Z J,Yuan G H,Zhai W L,Yan J,Chen H 2016Science China-Physics Mechanics Astronomy59 680013

    [20]Schoeler C,Malinowska K H,Bernardi R C,Milles L F,Jobst M A,Durner E,Ott W,Fried D B,Bayer E A,Schulten K,Gaub H E,Nash M A 2014Nat.Commun.5 5635

    [21]Pfreundschuh M,Alsteens D,Wieneke R,Zhang C,Coughlin S R,Tampe R,Kobilka B K,Muller D J 2015Nat.Commun.6 8857

    [22]Dudko O K,Hummer G,Szabo A 2006Phys.Rev.Lett.96 108101

    [23]Dudko O K,Hummer G,Szabo A 2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA105 15755

    [24]Bell G I 1978Science200 618

    [25]Rodriguez Del Castillo A,Lemaire S,Tchakarov L,Jeyapragasan M,Doucet J P,Vitale M L,Trifaro J M 1990EMBO J.9 43

    [26]Maekawa S,Sakai H 1990J.Biol.Chem.265 10940

    [27]Marcu M G,Zhang L,Elzagallaai A,Trifaro J M 1998J.Biol.Chem.273 3661

    [28]Cao Y,Lam C,Wang M,Li H 2006Angew Chem.Int.Ed.Engl.45 642

    [29]Rief M,Gautel M,Oesterhelt F,Fernandez J M,Gaub H E 1997Science276 1109

    Single molecule force spectroscopy study of calcium regulated mechanical unfolding of the A6 domain of adseverin?

    Li Peng-FeiCao YiQin Meng?Wang Wei
    (National Laboratory of Solid Structure,Department of Physics,Nanjing University,Nanjing 201193,China)

    Adseverin is a member of calcium-regulated gelsolin superfamily existing in secretory cells,which functions as an actin severing and capping protein.Adseverin is comprised of six independently folded domains(A1–A6),sharing high sequence identity(60%)with that of gelsolin(G1–G6).Calcium binding can convert both adserverin and gelsolin from a globular structure into a necklace structure and expose the actin binding sites.However,compared with gelsolin,adseverin lacks a C-terminal extension.Our previous single molecule force spectroscopy studies indicated that the C-terminal helix is critical to the force regulated calcium activation of gelsolin.It remains largely unexplored how the calcium binding to adseverin is regulated by force.

    Here,using atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy,we demonstrate that the mechanical unfolding of the sixth domain of adseverin(A6)can be signi fi cantly a ff ected by calcium binding.In order to identify the unfolding events of A6 unambiguously,we construct a hetero-polyprotein(GB1-A6)4,in which A6 is spliced alternatively with well-characterized protein domain GB1.Therefore,in the force-extension traces,GB1 unfolding events can serve as a fi ngerprint to identify the unfolding signature of A6.

    In the absence of calcium,the unfolding traces for(GB1-A6)4show two distinct categories of events.The higher force events with unfolding forces of~180 pN and contour length increments of~18 nm correspond to the unfolding of GB1.The other category of events with lower unfolding forces of~25 pN and contour length increments of~35 nm are attributed to the mechanical unfolding of A6.The unfolding force for A6 is similar to that for the structural homological protein,G6.

    However,in the presence of calcium ion,the unfolding force of A6 is dramatically increased to~45 pN,indicating that the structure of A6 can be mechanically stabilized by calcium ion-binding.Moreover,we observe a clear mechanical unfolding intermediate state for the unfolding of calcium bound A6(holo A6).Upon stretching,holo A6 is fi rst partially unfolded to an intermediate state with a contour length increment of~7.2 nm.Then,the intermediate state is unfolded to release a contour length of~27.8 nm.The total contour length change is the same as that for the calcium free A6(apo A6).Because each amino acid in the unfolded structure corresponds to a contour length increment of 0.365 nm,according to the contour length change,we infer that in the unfolding intermediate state of A6,its N-terminal regions is partially unfolded.This leads to the exposure of the cryptic actin binding site on A5,which is otherwise buried in the folded structure of A6.The force regulated activation mechanism for A6 is similar to that for G6,except that they use di ff erent sequences from those in the force-sensitive region.In G6 the C-terminal helix serves as the force-responsive tail to regulate actin binding,while in A6 the N-terminal sequences are unstructured upon stretching to promote the actin binding for adseverin.

    Therefore,we infer that force may be an important regulator for the actin-binding of all members in the gelsolin family proteins,including adseverin and gelsolin.Our study represents an important step towards the understanding of the function of adseverin at a molecular level.

    adseverin,single molecule force spectroscopy,unfolding,intermediate state

    8 May 2017;revised manuscript

    30 June 2017)

    (2017年5月8日收到;2017年6月30日收到修改稿)

    10.7498/aps.66.196201

    ?國家自然科學(xué)基金(批準號:21522402,11674153,11374148,11334004)和國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(批準號:2013CB834100)資助的課題.

    ?通信作者.E-mail:qinmeng@nju.edu.cn

    ?2017中國物理學(xué)會Chinese Physical Society

    PACS:62.25.–g,64.60.Q–,68.37.Ps

    10.7498/aps.66.196201

    *Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.21522402,11674153,11374148,11334004)and the National Basic Research Program of China(Grant No.2013CB834100).

    ?Corresponding author.E-mail:qinmeng@nju.edu.cn

    猜你喜歡
    微絲肌動蛋白緩沖液
    Fe 對Ni-Mn-Ga 合金微絲形狀記憶效應(yīng)的影響
    材料工程(2024年3期)2024-03-29 16:36:08
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    肌動蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的研究進展
    動物細胞微絲觀察教學(xué)實驗的設(shè)計與探索
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    軟骨細胞微絲骨架的研究進展*
    肌動蛋白清除系統(tǒng)與凝血—纖溶系統(tǒng)在子癇前期患者外周血中的變化
    微絲解聚劑及微管阻斷劑對蘚羽藻細胞重建過程的影響
    2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究
    主動免疫肌動蛋白樣蛋白7a蛋白引起小鼠睪丸曲細精管的損傷
    亚洲精品色激情综合| 色播亚洲综合网| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久人妻福利社区极品人妻图片| cao死你这个sao货| 国产日本99.免费观看| www国产在线视频色| 成人永久免费在线观看视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色播在线永久视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 成人国产综合亚洲| 丝袜在线中文字幕| 在线永久观看黄色视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 后天国语完整版免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品久久久久久,| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜亚洲福利在线播放| 99在线视频只有这里精品首页| 免费看日本二区| 91老司机精品| 亚洲国产精品合色在线| 午夜免费成人在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一个人观看的视频www高清免费观看 | a级毛片在线看网站| 久9热在线精品视频| 国产成人欧美在线观看| 久久青草综合色| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩精品青青久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日韩高清综合在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲专区中文字幕在线| 在线免费观看的www视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 美女高潮到喷水免费观看| 一夜夜www| 亚洲精华国产精华精| aaaaa片日本免费| 级片在线观看| 成年版毛片免费区| 国产在线观看jvid| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩欧美 国产精品| 一级a爱片免费观看的视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 天天添夜夜摸| 欧美成狂野欧美在线观看| 91麻豆av在线| 欧美乱色亚洲激情| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜福利一区二区在线看| 久久中文字幕人妻熟女| 精品一区二区三区四区五区乱码| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产男靠女视频免费网站| 88av欧美| 一本一本综合久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 久久久久久久久久黄片| 黄频高清免费视频| 一级作爱视频免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 国产成人系列免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产色视频综合| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产av一区在线观看免费| 国产精品亚洲美女久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一区福利在线观看| 黄频高清免费视频| 狂野欧美激情性xxxx| 一区二区三区国产精品乱码| 999久久久精品免费观看国产| 国产一区在线观看成人免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 99在线视频只有这里精品首页| 天堂影院成人在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩高清综合在线| 91大片在线观看| www日本在线高清视频| 亚洲 国产 在线| 亚洲av美国av| 一区二区三区精品91| 国产久久久一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲全国av大片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本免费a在线| 热99re8久久精品国产| 最新美女视频免费是黄的| 成人国产综合亚洲| 午夜a级毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 无人区码免费观看不卡| 看片在线看免费视频| 在线观看www视频免费| av在线播放免费不卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 极品教师在线免费播放| 在线观看日韩欧美| 我的亚洲天堂| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜免费观看网址| 久久亚洲真实| 亚洲第一电影网av| 亚洲一区中文字幕在线| av欧美777| 国产高清有码在线观看视频 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费在线观看黄色视频的| 欧美一级a爱片免费观看看 | 女同久久另类99精品国产91| 国产精品久久久人人做人人爽| 两个人视频免费观看高清| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产99白浆流出| 两个人免费观看高清视频| 满18在线观看网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久久久久久久中文| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人手机av| 黄色丝袜av网址大全| 国产黄片美女视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产97色在线日韩免费| 欧美乱色亚洲激情| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 制服人妻中文乱码| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久国产一级毛片高清牌| 人人妻人人看人人澡| 悠悠久久av| 国产成年人精品一区二区| 青草久久国产| 窝窝影院91人妻| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品美女久久av网站| 男人操女人黄网站| 一区二区三区国产精品乱码| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 极品教师在线免费播放| 国产熟女午夜一区二区三区| 看免费av毛片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 哪里可以看免费的av片| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩欧美在线二视频| 曰老女人黄片| 88av欧美| 午夜成年电影在线免费观看| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲成人久久爱视频| 女性被躁到高潮视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 三级毛片av免费| 欧美日韩瑟瑟在线播放| av有码第一页| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 18禁观看日本| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品国产综合久久久| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品色激情综合| 精品欧美国产一区二区三| 精品第一国产精品| 亚洲精品国产区一区二| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99久久国产精品久久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 嫩草影院精品99| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 一区二区三区高清视频在线| www.999成人在线观看| 91国产中文字幕| 观看免费一级毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av有码第一页| 免费看日本二区| 亚洲一区中文字幕在线| 波多野结衣av一区二区av| 日本免费a在线| 日韩有码中文字幕| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人系列免费观看| cao死你这个sao货| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男人舔奶头视频| 欧美激情高清一区二区三区| 99热这里只有精品一区 | 久久香蕉国产精品| 免费在线观看亚洲国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲黑人精品在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩国内少妇激情av| 99re在线观看精品视频| 成人午夜高清在线视频 | 精品电影一区二区在线| 天天添夜夜摸| av片东京热男人的天堂| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一区二区日韩欧美中文字幕| 两性夫妻黄色片| 丁香六月欧美| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 韩国av一区二区三区四区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 两个人看的免费小视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产av一区在线观看免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 波多野结衣高清作品| 亚洲成人久久爱视频| 香蕉久久夜色| 午夜免费观看网址| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看舔阴道视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 日本一本二区三区精品| 精品人妻1区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲三区欧美一区| 淫秽高清视频在线观看| 日韩欧美在线二视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久99热这里只有精品18| 大香蕉久久成人网| 我的亚洲天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲精华国产精华精| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av电影不卡..在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲成人久久性| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美激情极品国产一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 99热只有精品国产| 成人午夜高清在线视频 | 午夜激情av网站| 在线观看一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 在线看三级毛片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产不卡一卡二| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲黑人精品在线| 99久久精品国产亚洲精品| 91麻豆av在线| 亚洲精品美女久久av网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产片内射在线| 精品电影一区二区在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品国产亚洲在线| 91成年电影在线观看| 国产97色在线日韩免费| 无限看片的www在线观看| 久久狼人影院| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美大码av| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 露出奶头的视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品一区二区三区四区久久 | 午夜视频精品福利| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一级片免费观看大全| 亚洲国产精品合色在线| 69av精品久久久久久| 欧美乱色亚洲激情| 精品免费久久久久久久清纯| 少妇熟女aⅴ在线视频| 成在线人永久免费视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 真人做人爱边吃奶动态| a级毛片a级免费在线| 脱女人内裤的视频| 亚洲中文av在线| 窝窝影院91人妻| 久久精品影院6| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美久久黑人一区二区| 十八禁网站免费在线| 级片在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜免费鲁丝| АⅤ资源中文在线天堂| 成人欧美大片| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美黑人欧美精品刺激| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av美国av| 欧美一级a爱片免费观看看 | bbb黄色大片| 999久久久国产精品视频| 1024手机看黄色片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久99久视频精品免费| 国产高清视频在线播放一区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产爱豆传媒在线观看 | 久久久久久久久中文| 哪里可以看免费的av片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成人国产一区最新在线观看| 成人午夜高清在线视频 | 国产高清激情床上av| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 1024香蕉在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品亚洲美女久久久| 在线观看一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品91蜜桃| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲午夜理论影院| 亚洲久久久国产精品| 欧美中文日本在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品在线观看二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 男女午夜视频在线观看| 久久九九热精品免费| 欧美乱色亚洲激情| АⅤ资源中文在线天堂| 国产成人啪精品午夜网站| 最好的美女福利视频网| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 视频在线观看一区二区三区| 身体一侧抽搐| x7x7x7水蜜桃| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品久久久久久成人av| 欧美激情 高清一区二区三区| 91老司机精品| 淫秽高清视频在线观看| 香蕉久久夜色| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人手机av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 人人妻人人澡人人看| 午夜免费成人在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 宅男免费午夜| 欧美最黄视频在线播放免费| 91成年电影在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 狠狠狠狠99中文字幕| 老司机在亚洲福利影院| 午夜免费激情av| 老司机靠b影院| 操出白浆在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久久久久久黄片| 久久久久久久久中文| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产高清视频在线播放一区| 亚洲免费av在线视频| 国产成人系列免费观看| 高清在线国产一区| 啦啦啦 在线观看视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 久久 成人 亚洲| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 757午夜福利合集在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美日韩黄片免| 99久久国产精品久久久| 欧美在线黄色| 中文字幕最新亚洲高清| av有码第一页| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产av在哪里看| 国产精品亚洲av一区麻豆| avwww免费| 级片在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 满18在线观看网站| 欧美三级亚洲精品| 国产成人av教育| 丁香欧美五月| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| www.999成人在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 大型av网站在线播放| 欧美成人午夜精品| 国产成人av教育| 国产又爽黄色视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲人成77777在线视频| 不卡av一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 少妇的丰满在线观看| 免费av毛片视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 曰老女人黄片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av中文乱码字幕在线| 国产精品久久电影中文字幕| 天堂动漫精品| 国产精品亚洲美女久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 我的亚洲天堂| 国产伦人伦偷精品视频| 久久香蕉精品热| 久久久国产成人免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 九色国产91popny在线| 色综合站精品国产| 国产精品国产高清国产av| www.www免费av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人欧美大片| 国产成人精品无人区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 女人被狂操c到高潮| 一进一出好大好爽视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 少妇 在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲中文av在线| 亚洲国产精品合色在线| 男人操女人黄网站| 美女免费视频网站| 一级毛片女人18水好多| 日日干狠狠操夜夜爽| 999久久久精品免费观看国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品成人免费网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精华国产精华精| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩福利视频一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美三级亚洲精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 岛国在线观看网站| 两个人视频免费观看高清| 美女国产高潮福利片在线看| 久久中文字幕一级| 精品国产国语对白av| 久久久久久国产a免费观看| 国产高清videossex| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久人妻av系列| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩欧美在线二视频| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久久久久久久久久久 | av有码第一页| 亚洲av成人一区二区三| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品国产综合久久久| 精品久久久久久久毛片微露脸| 丁香六月欧美| 变态另类丝袜制服| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲第一青青草原| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产清高在天天线| 国产久久久一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成年女人毛片免费观看观看9| 村上凉子中文字幕在线| www国产在线视频色| 在线视频色国产色| 成年免费大片在线观看| 国产在线观看jvid| 99热这里只有精品一区 | 午夜福利视频1000在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲一区中文字幕在线| 69av精品久久久久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 最近在线观看免费完整版| 亚洲全国av大片| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 一二三四社区在线视频社区8| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99riav亚洲国产免费| 久久久久久九九精品二区国产 | 夜夜夜夜夜久久久久| 国产在线观看jvid| 成熟少妇高潮喷水视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| av在线播放免费不卡| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美午夜高清在线| 正在播放国产对白刺激| 免费av毛片视频| 中文字幕久久专区| 露出奶头的视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲国产精品999在线| 日韩欧美国产在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 成人国产综合亚洲| 午夜福利在线观看吧| 亚洲电影在线观看av| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲成人久久性| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 哪里可以看免费的av片| 在线观看舔阴道视频| 满18在线观看网站|