非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型中自噬與脂質(zhì)代謝的相互調(diào)節(jié)

閆 蓉， 牛春燕， 于 璐， 田 宇

(1 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.消化內(nèi)科; b.檢驗(yàn)科， 西安 710077； 2 河南省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 鄭州 450003)

非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型中自噬與脂質(zhì)代謝的相互調(diào)節(jié)

閆 蓉1a， 牛春燕1a， 于 璐2， 田 宇1b

(1 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.消化內(nèi)科; b.檢驗(yàn)科， 西安 710077； 2 河南省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 鄭州 450003)

目的探討非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中自噬與脂質(zhì)代謝的相互作用。方法體外人肝細(xì)胞培養(yǎng)(脂肪變性)制備NAFLD細(xì)胞模型，雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，3-甲基腺嘌呤抑制細(xì)胞自噬，MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平，IF法檢測(cè) LC3-Ⅱ的定位與分布，Western Blot 檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果誘導(dǎo)自噬組的吸光度值和細(xì)胞活率與脂肪變組比較，明顯下降(HL-7702細(xì)胞q值分別為4.160、4.110，SK-HEP-1細(xì)胞q值分別為4.407、4.032；P值均<0.05)。脂肪變組TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平與對(duì)照組相比，明顯升高(HL-7702細(xì)胞q值分別為5.316、3.730、4.013、6.967、6.192、5.531，SK-HEP-1細(xì)胞q值分別為4.963、3.603、4.774、7.479、6.319、5.193；P值均<0.05)。誘導(dǎo)自噬組TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平與脂肪變組相比，明顯降低(HL-7702細(xì)胞q值分別為4.978、3.695、3.960、5.130、4.695、3.192，SK-HEP-1細(xì)胞q值分別為3.846、5.575、4.184、5.019、4.203、3.049；P值均<0.05)。LC3-Ⅱ在各組肝細(xì)胞中的標(biāo)記值，誘導(dǎo)自噬組最高(HL-7702細(xì)胞為90.1%，SK-HEP-1細(xì)胞為80.0%)，其次是脂肪變組(HL-7702細(xì)胞為47.2%，SK-HEP-1細(xì)胞為48.4%)及抑制自噬組(HL-7702細(xì)胞為30.2%，SK-HEP-1細(xì)胞為45.5%)。誘導(dǎo)自噬組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與脂肪變組相比，明顯升高(HL-7702細(xì)胞q值為6.786，SK-HEP-1細(xì)胞q值為5.926；P值均<0.05)。結(jié)論自噬的上調(diào)有利于促進(jìn)肝臟脂肪的清除，而下調(diào)則促進(jìn)脂質(zhì)的聚積。

脂肪肝； 自噬； 脂類代謝

近年來，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患病率逐年增加，已成為全球重要的公共健康問題[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，較為普遍接受的“二次打擊學(xué)說”認(rèn)為，初次打擊為脂質(zhì)聚積導(dǎo)致肝臟脂肪變及胰島素抵抗，通過外周脂解增加(脂質(zhì)過多)和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪堆積、脂肪變，二次打擊主要指氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞因子、線粒體功能異常等，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、炎癥、纖維化[2]。最近的研究[3-4]表明，自噬除了降解肝細(xì)胞內(nèi)過多或損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)外，還介導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的代謝和分解，介導(dǎo)脂滴內(nèi)貯存脂質(zhì)的降解，提示自噬在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要病理生理意義。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)體外人肝細(xì)胞培養(yǎng)(脂肪變性)制備NAFLD模型，觀察自噬的生物學(xué)特性，探討NAFLD中自噬與脂質(zhì)代謝的相互作用和可能的機(jī)制，為將來NAFLD治療領(lǐng)域的分子靶向治療相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-7702細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞株(西安東澳生物科技有限公司)，10%脂肪乳注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，雷帕霉素(Selleck，S1039)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Selleck，S2767)，LC3B (D11) XP?Rabbit mAb(CST，3868S)，Anti-PKC epsilon 抗體(Abcam，ab124806)，油紅O染色液(南京建成科技有限公司，D027)，科研人甘油三酯(TG)ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml026468)，科研人ALT檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml027133)，科研人AST檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml024056)，科研人乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml024518)，科研人GGT檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml027457)，科研人Alb檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml025061)。倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)，冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)，Mini-PROTEAN?Casting stand(Bio-Rad)，Power PacTMHC 高電流電泳儀(Bio-Rad)，Mini-PROTEAN?電泳槽(Bio-Rad)，Mini Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad)，iMarkTM酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 將從液氮中取出的HL-7702細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞在37 ℃水浴鍋中快速融化后接種于10 cm皿中，培養(yǎng)基分別是RPMI1640+10%FBS和MEM+10%FBS。將 10 cm皿中細(xì)胞廢液棄除，用PBS清洗1次，滴加8滴胰酶，消化30 s左右，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用1 ml的槍吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞液于15 ml離心管中，1000 r/min離心5 min；離心后棄上清，加入新的完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液；按1∶2的接種比例將細(xì)胞懸液接種于10 cm皿中，在CO2孵箱中培養(yǎng)。HL-7702、SK-HEP-1細(xì)胞分別用2%脂肪乳培養(yǎng) 48 h后，用油紅O染色肝細(xì)胞出現(xiàn)紅色脂滴，即為建模成功。另將普通培養(yǎng)的2種細(xì)胞株設(shè)為對(duì)照。

1.2.2 肝細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié) 人肝HL-7702、SK-HEP-1脂肪變細(xì)胞傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，誘導(dǎo)自噬組加入雷帕霉素(100 nmol/L)培養(yǎng)48 h；抑制自噬組加入3-MA(4.5 mg/L)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞活力與功能評(píng)價(jià)

1.2.3.1 油紅O染色 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-7702、SK-HEP-1細(xì)胞，以5×104/孔的密度接種于放玻片的24孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)到 60%～70%時(shí)，模型組加入 2%脂肪乳(10%脂肪乳注射液稀釋5倍)，對(duì)照組加入不含脂肪乳的培養(yǎng)基。放入孵箱培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，油紅O染液室溫染色30 min，37 ℃左右蒸餾水洗30 s至背景透明，再用復(fù)染劑室溫染色3 min，蒸餾水洗30～60 s，用水性封片劑封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的脂滴。

1.2.3.2 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力 將 T25培養(yǎng)瓶中的廢液全部吸棄，消化后重懸細(xì)胞；吸取10 μl細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板按照3×104/ml計(jì)數(shù)，接種到96孔板中，每孔100 μl，在 CO2孵箱中過夜培養(yǎng)。接種細(xì)胞后第2天，更換培養(yǎng)基，模型組加入2%脂肪乳(10%脂肪乳注射液稀釋5倍)，對(duì)照組加入不含脂肪乳的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中48 h。每孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去上清液，每孔加入150 μl二甲亞砜，置搖床低速振蕩10 min，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm測(cè)吸光度值。

1.2.3.3 ELISA檢測(cè) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-7702、SK-HEP-1細(xì)胞，以5×105/孔的密度接種于6孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)到60%～70%時(shí)，模型組加入2%脂肪乳(10%脂肪乳注射液稀釋5倍)；對(duì)照組加入不含脂肪乳的培養(yǎng)基；放入孵箱培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，用冰的PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加1 ml PBS后，收集細(xì)胞懸液至EP管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，用PBS調(diào)整至1×106個(gè)/ml。反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，4 ℃、3000 r/min，離心20 min，收集上清后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒操作說明檢測(cè)其中TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平。

1.2.4 肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白在人肝細(xì)胞及脂肪變?nèi)烁渭?xì)胞中活性狀態(tài)的檢測(cè)

1.2.4.1 IF法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ 培養(yǎng)好的細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS洗3次，每次5 min。0.3% TritonX-100室溫通透15 min。PBS洗3次，每次5 min。一抗孵育：用10%山羊血清將一抗LC3-Ⅱ(1∶100)稀釋，4 ℃孵育過夜。第2天吸去一抗，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗工作液[用 2%山羊血清熒光二抗Alexa Fluor 594 donkey-rabbit (1∶400)](稀釋到工作時(shí)的濃度)，37 ℃避光孵育30 min。吸去二抗，用PBS洗 3次，每次5 min。滴加VECTASHIELD?+DAPI封片并染細(xì)胞核。立即用倒置熒光顯微鏡拍照，藍(lán)色代表細(xì)胞核，紅色熒光代表LC3-Ⅱ。觀察LC3-Ⅱ的定位和分布。采用雙盲法在光鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)肝細(xì)胞/片，記數(shù)肝細(xì)胞的陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，LC3-Ⅱ在肝細(xì)胞中的標(biāo)記值為陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4.2 Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 收集各組細(xì)胞，用冰的PBS清洗細(xì)胞3次，每個(gè)孔加1 ml PBS后，收集細(xì)胞懸液至EP管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用移液槍反復(fù)吹打數(shù)次。將裂解好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入預(yù)冷的離心管中，冰浴10 min,以使細(xì)胞充分裂解。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中。用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)后將蛋白樣品分裝成小份，-80 ℃貯存?zhèn)溆?。取各組蛋白樣品30 μg，加入相當(dāng)于蛋白樣品1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴中煮5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至偏氟乙烯(polyvinylidence difluoride，PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放在麗春紅染色液中染色2～5 min，觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果。標(biāo)記出PVDF膜的右上角，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至含有5% BSA的TBST封閉液中，室溫封閉1.5 h。按1∶800稀釋抗體LC3B，按1∶500稀釋抗體β-Actin于封閉液中，將PVDF膜放入皿中，加入一抗的稀釋液，4 ℃過夜。次日，用TBST洗膜10 min×4次。按1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(LC3B)于封閉液中，按1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(β-Actin)于封閉液中，將PVDF膜放入含稀釋二抗的皿中，脫色搖床孵育1 h。孵育結(jié)束后，用TBST洗膜10 min×3次。暗室中，用濾紙輕輕將膜上的液體吸干，在增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合液中反應(yīng)2～3 min，壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色結(jié)果 對(duì)照組HL-7702細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞生長(zhǎng)為不規(guī)則或卵圓形，胞質(zhì)無明顯紅染或淡染，脂肪變組細(xì)胞胞質(zhì)廣泛染色，為紅色脂滴，大而多(圖1)。

2.2 MTT比色結(jié)果 對(duì)照組、脂肪變組HL-7702細(xì)胞及SK-HEP-1細(xì)胞生長(zhǎng)良好，吸光度值和細(xì)胞活率組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。誘導(dǎo)自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞的吸光度值和細(xì)胞活率與脂肪變組比較，明顯下降(P值均<0.05)。抑制自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞的吸光度值和細(xì)胞活率與脂肪變組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1，2)。

對(duì)照組

脂肪變組

圖1對(duì)照組和脂肪變組HL-7702細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞內(nèi)脂滴油紅O染色結(jié)果(×400) a、b：HL-7702；c、d：SK-HEP-1

表1 各組HL-7702細(xì)胞吸光度值和細(xì)胞活率

注：與脂肪變組比較，1)q值分別為4.160、4.110，P<0.05

表2 各組SK-HEP-1細(xì)胞吸光度值和細(xì)胞活率

注：與脂肪變組比較，1)q值分別為4.070、4.032，P<0.05

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果 脂肪變組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平與對(duì)照組相比，明顯升高(P值均<0.05)。誘導(dǎo)自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平與脂肪變組相比，明顯降低(P值均<0.05)。抑制自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb水平與脂肪變組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3,4)。

2.4 IF法檢測(cè)LC3-Ⅱ LC3-Ⅱ在各組細(xì)胞的定位及分布見圖2。LC3-Ⅱ在各組肝細(xì)胞中的標(biāo)記值，誘導(dǎo)自噬組最高，其次是脂肪變組及抑制自噬組。脂肪變組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ標(biāo)記值與對(duì)照組相比，明顯升高(P值均<0.05)。誘導(dǎo)自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ標(biāo)記值與脂肪變組相比，明顯升高(P值均<0.05)。抑制

表3 各組HL-7702細(xì)胞ELISA檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，1)q值分別為5.316、3.730、4.013、6.967、6.192、5.531，P<0.05；與脂肪變組比較，2)q值分別為4.978、3.695、3.960、5.130、4.695、3.192，P<0.05

表4 各組SK-HEP-1細(xì)胞ELISA檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，1)q值分別為4.963、3.603、4.774、7.479、6.319、5.193，P<0.05；與脂肪變組比較，2)q值分別為3.846、5.575、4.184、5.019、4.203、3.049，P<0.05

圖2 LC3-Ⅱ在各組細(xì)胞的定位及分布

自噬組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ標(biāo)記值與脂肪變組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表5)。

表5 LC3-Ⅱ在各組肝細(xì)胞中的標(biāo)記值

注：與對(duì)照組比較，1)q值分別為7.318、7.424，P<0.05；與脂肪變組比較，2)q值分別為8.486、8.609，P<0.05

2.5 Western Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值中誘導(dǎo)自噬組最高，其次是脂肪變組、對(duì)照組及抑制自噬組。脂肪變組HL-7702及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。誘導(dǎo)自噬組HL-7702細(xì)胞及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與脂肪變組相比，明顯升高(P值均<0.05)。抑制自噬組HL-7702細(xì)胞及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與脂肪變組相比，無顯著性差異(P值均>0.05)(圖3，表6)。

圖3 Western Blot分析中各組LC3蛋白表達(dá)水平

組別HL-7702細(xì)胞SK-HEP-1細(xì)胞對(duì)照組0．023±00050．443±0007脂肪變組0．030±00080．587±0006誘導(dǎo)自噬組0．772±00201)1．146±00301)抑制自噬組0．014±00020．317±0010F值3．4624．581P值0．0430．034

注：與脂肪變組比較，1)q值分別為6.786、5.926，P<0.05

3 討論

自噬是指一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等胞漿成分被包裹，并最終運(yùn)送至溶酶體降解的過程，自噬性降解產(chǎn)生的氨基酸和其他一些小分子物質(zhì)可被再利用或產(chǎn)生能量?，F(xiàn)已明確，自噬的主要功能之一實(shí)際上是在細(xì)胞受到應(yīng)激性的死亡威脅時(shí)保持細(xì)胞的存活，這是真核細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)、實(shí)現(xiàn)更新的一種重要的進(jìn)化保守機(jī)制[4]。參與自噬的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，主要有：(1)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)，最主要的2個(gè)通路為，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1通路，Ras/cAMP依賴的蛋白激酶途徑通路；(2)胰島素/生長(zhǎng)因子通路；(3)能量響應(yīng)；(4)應(yīng)激響應(yīng)(包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、氧應(yīng)激、病原體感染)。參與自噬的基因主要有Atg家族的31種基因、Beclin Ⅰ、LC3 Ⅰ/Ⅱ等。在自噬整個(gè)過程中，關(guān)鍵分子是位于啟動(dòng)階段的Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶和TOR/mTOR激酶。Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶通過磷酸化脂酰肌醇來募集胞漿中含F(xiàn)YVE或PX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成。3-MA通過抑制該激酶，可有效抑制自噬活性[5]。mTOR通過調(diào)控核糖體蛋白質(zhì)S6的活性而發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬活性的作用[6]，mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素可抑制mTOR通路，活化細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)中，各組細(xì)胞經(jīng)MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，3-MA抑制自噬組的吸光度值和細(xì)胞活率與脂肪變組比較無顯著性差異(P>0.05)。雷帕霉素誘導(dǎo)自噬組的吸光度值和細(xì)胞活率與脂肪變組比較明顯下降(P<0.05)，考慮與自噬導(dǎo)致細(xì)胞活力下降有關(guān)。

除維持生理狀態(tài)下機(jī)體的穩(wěn)態(tài)功能外，越來越多的研究[7]表明自噬與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退化性疾病、心肌病、克羅恩病、脂肪肝、2型糖尿病以及衰老有關(guān)，并且具有抵御細(xì)胞內(nèi)病原、抗原遞呈的功能。本實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)自噬組中反映脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)，TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb與脂肪變組相比，明顯降低(P<0.05)。抑制自噬組TG、ALT、AST、LDH、GGT、Alb與脂肪變組相比，無顯著性差異(P>0.05)?？紤]與自噬參與脂質(zhì)代謝有關(guān)，自噬的上調(diào)有利于促進(jìn)肝臟脂肪的清除，而下調(diào)則促進(jìn)脂質(zhì)的聚積[9-10]。另外，自噬還可減輕非酒精性脂肪性肝炎狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細(xì)胞損傷、改善胰島素抵抗[11-12]。

自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg蛋白)介導(dǎo)完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在2種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成 LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬性結(jié)構(gòu)膜上的Atg蛋白不同(僅在自噬過程的某一階段發(fā)揮作用)，LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[13]。本實(shí)驗(yàn)中采用IF法檢測(cè)LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ在各組肝細(xì)胞中的標(biāo)記值誘導(dǎo)自噬組最高，其次是脂肪變組及抑制自噬組。誘導(dǎo)自噬組LC3-Ⅱ標(biāo)記值與脂肪變組相比，明顯升高(P<0.05)，提示雷帕霉素可以顯著激活細(xì)胞自噬，增加自噬體數(shù)量。脂肪變組LC3-Ⅱ標(biāo)記值與對(duì)照組相比，明顯升高(P<0.05)，提示脂肪變組細(xì)胞自噬體數(shù)量增加，考慮與脂肪變導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)。

自噬發(fā)生后，通過Western Blot可以檢測(cè)到2個(gè)條帶的蛋白質(zhì)，盡管 LC3-Ⅱ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合后實(shí)際分子質(zhì)量大于LC3-Ⅰ，由于其疏水性較強(qiáng)，在聚丙烯酰胺凝膠中的泳動(dòng)速度要快于 LC3-Ⅰ。由于在自噬時(shí)細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白總的表達(dá)水平其實(shí)并無上調(diào)，僅僅是一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成了LC3-Ⅱ，自噬時(shí)應(yīng)表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅰ的減少和LC3-Ⅱ的增加，通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反映自噬水平[14]。本實(shí)驗(yàn)中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值中誘導(dǎo)自噬組最高，其次是脂肪變組及抑制自噬組。誘導(dǎo)自噬組HL-7702細(xì)胞及SK-HEP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與脂肪變組相比，明顯升高(P<0.05)。提示與IF法檢測(cè)LC3-Ⅱ相比，采用Western Blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值更能反映細(xì)胞真實(shí)的自噬水平。

自噬在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用近年來受到越來越多的關(guān)注，但NAFLD背景下自噬與脂質(zhì)代謝之間的作用機(jī)制尚未明確。本課題研究的結(jié)果初步顯示，自噬的上調(diào)有利于促進(jìn)肝臟脂肪的清除，而下調(diào)則促進(jìn)脂質(zhì)的聚積；自噬還可減輕非酒精性脂肪性肝炎狀態(tài)下的肝細(xì)胞損傷。因此，肝細(xì)胞自噬活性的調(diào)控有望成為治療NAFLD的新靶點(diǎn)。

[1] CHANG BX, ZOU ZS, LI BS, et al. 2015 The Japanese Society of Gastroenterology of Evidence-based clinical practice guidelines for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis

[J]. J Clin Hepatol, 2015, 31(7): 1027-1030. (in Chinese)

常彬霞, 鄒正升, 李寶森, 等. 2015年日本胃腸病學(xué)會(huì)非酒精性脂肪肝病/非酒精性脂肪肝炎的循證醫(yī)學(xué)臨床治療指南[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(7): 1027-1030.

[2] MESHKANI R, ADELI K. Hepatic insulin resistance, metabolic syndrome and cardiovascular disease[J]. Clin Biochem, 2009, 42(6): 1331-1346.

[3] GREEN DR, LEVINE B. To be or not to be? How selective autophagy and cell death govern death cell fate[J]. Cell, 2014, 157(1)： 65-75.

[4] MARTINEZ-LOPEZ N, SINGH R. Autophagy and lipid droplets in the liver[J]. Annu Rev Nutr, 2015, 35: 215-237.

[5] ESKELINEN EL, SAFTIG P. Autophagy: a lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1793(4): 664-673.

[6] HIROSAKO K, IMASATO H, HIROTA Y, et al. 3-Methyladenine specifically inhibits retrograde transport of cation-independent mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor from the early endosome to the TGN[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 316(3): 845-852.

[7] ROSENFELDT MT， RYAN KM．The multiple roles of autophagy in cancer[J]. Carcinoqenesis， 2011， 32(7): 955-963．

[8] MIJALJICA D, PRESCOTT M, DEVENISH RJ. Autophagy in disease[J]. Methods Mol Biol, 2010, 648: 79-92.

[9] CZAJA MJ. Autophagy in health and disease. 2. Regulation of lipid metabolism and storage by autophagy: pathophysiological implications[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2010, 298(5): c973-c978.

[10] MARTINEZ-VICENTE M, TALLOCZY Z, WONG E, et al. Cargo recognition failure is responsible for inefficient autophagy in Huntington′s disease[J]. Nat Neurosci, 2010, 13(5): 567-576.

[11] YOSHIZAKI T, KUSUNOKI C, KONDO M, et al. Autophagy regulates inflammation in adipocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417(1): 352-357.

[12] CHRISTIAN P, SACCO J, ADELI K. Autophagy: emerging roles in lipid homeostasis and metabolic control[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1831(4): 819-824.

[13] KIMURA S, FUJITA N, NODA T, et al. Monitoring autophagy inmammalian cultured cells through the dynamics of LC3[J]. Methods Enzymol, 2009, 452: 1-12.

[14] KADOWAKI M, KARIM MR. Cytosolic LC3 ratio as a quantitative index of macroautophagy[J]. Methods Enzymol, 2009, 452: 199-213.

Interactionbetweenautophagyandlipidmetabolismincellmodelsofnonalcoholicfattyliverdisease

YANRong,NIUChunyan,YULu,etal.

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalCollege,Xi′an710077,China)

ObjectiveTo investigate the interaction between autophagy and lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsHuman hepatocytes (steatosis) were cultured in vitro to establish a cell model of NAFLD. Rapamycin was used to induce autophagy and 3-methyladenine was used to inhibit autophagy. MTT colorimetry was used to measure cell viability. ELISA was used to measure the levels of triglyceride (TG), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), and albumin (Alb). IF method was used to determine the location and distribution of LC3-II. Western blot was used to measure LC3-II/LC3-I ratio. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between groups, and the SNK-qtest was used for further comparison between two groups.ResultsCompared with the steatosis group, the induced autophagy group had significant reductions in absorbance and cell viability (HL-7702 cells:q=4.160 and 4.110,P<0.05; SK-HEP-1 cells:q=4.407 and 4.032,P<0.05). Compared with the control group, the steatosis group had significant increases in the levels of TG, ALT, AST, LDH, GGT, and Alb (HL-7702 cells:q=5.316, 3.730, 4.013, 6.967, 6.192, and 5.531,P<0.05; SK-HEP-1 cells:q=4.963, 3.603, 4.774, 7.479, 6.319, and 5.193,P<0.05). Compared with the steatosis group, the induced autophagy group had significant reductions in the levels of TG, ALT, AST, LDH, GGT, and Alb (HL-7702 cells:q=4.978, 3.695, 3.960, 5.130, 4.695, and 3.192,P<0.05; SK-HEP-1 cells:q=3.846, 5.575, 4.184, 5.019, 4.203, 3.049,P<0.05). The induced autophagy group had the highest percentage of LC3-II-positive HL-7702 cells (90.1%) and LC3-II-positive SK-HEP-1 cells (80.0%), followed by the steatosis group (47.2% LC3-II-positive HL-7702 cells and 48.4% LC3-II-positive SK-HEP-1 cells) and the autophagy inhibition group (30.2% LC3-II-positive HL-7702 cells and 45.5% LC3-II-positive SK-HEP-1 cells). The induced autophagy group had a significant increase in LC3-II/IC3-I ratio compared with the steatosis group (HL-7702 cells:q=6.786,P<0.05; SK-HEP-1 cells:q=5.926,P<0.05).ConclusionUpregulation of autophagy can promote the elimination of liver fat, while downregulation of autophagy can promote lipid accumulation.

fatty liver; autophagy; lipid metabolism

R575.5

A

1001-5256(2017)10-1981-06

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.10.027

2017-06-30；

2017-07-27。

陜西省教育廳科研基金(2013JK0788)

閆蓉(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事脂肪肝及胃腸動(dòng)力性疾病研究。

牛春燕，電子信箱：nchy69@163.com。

引證本文：YAN R, NIU CY, YU L, et al. Interaction between autophagy and lipid metabolism in cell models of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(10): 1981-1986. (in Chinese)

閆蓉， 牛春燕， 于璐， 等. 非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型中自噬與脂質(zhì)代謝的相互調(diào)節(jié)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(10): 1981-1986.

(本文編輯：朱 晶)