含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預(yù)防肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)的療效分析

孟 健， 杜松濤， 張勁光

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院， 北京 100069)

論著/肝臟腫瘤

含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預(yù)防肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)的療效分析

孟 健， 杜松濤， 張勁光

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院， 北京 100069)

目的觀察外科手術(shù)聯(lián)合基因治療對(duì)預(yù)防肝細(xì)胞癌(HCC)術(shù)后復(fù)發(fā)的療效。方法選取2006年7月-2013年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院收治的102例單發(fā)HCC患者(腫瘤分期TNM1～2期,腫瘤直徑<10 cm), 對(duì)其中60例患者在手術(shù)前后聯(lián)合含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)基因治療(基因組)，42例患者采用單純手術(shù)切除(手術(shù)組)，對(duì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行定期隨訪。2組患者的臨床資料比較采用t檢驗(yàn)(計(jì)數(shù)資料)和χ2檢驗(yàn)(計(jì)量資料)；采用log-rank檢驗(yàn)分析2組患者的累積復(fù)發(fā)率，采用單因素和多因素Cox回歸分析對(duì)患者復(fù)發(fā)率有顯著影響的因素。結(jié)果基因組1、3、5年的腫瘤復(fù)發(fā)率為13.8%、33.7%和47.7%, 手術(shù)組為18.5%、53.2%和69.2%,2組累積復(fù)發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.643,P=0.041)。除術(shù)后基因組發(fā)熱患者顯著多于手術(shù)組外，2組并發(fā)癥發(fā)生率以及住院時(shí)間無(wú)明顯差別。多因素分析顯示，基因治療是腫瘤累積復(fù)發(fā)率的獨(dú)立影響因素(比值比=2.752,95%可信區(qū)間：1.164～4.251,P=0.038)。結(jié)論在手術(shù)切除的基礎(chǔ)上聯(lián)合基因治療，可以有效減少術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，值得臨床推廣。

癌, 肝細(xì)胞； 基因療法； 復(fù)發(fā)

隨著肝膽外科技術(shù)的發(fā)展，大部分肝細(xì)胞癌(HCC)患者都能獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率居高不下，成為困擾肝膽外科醫(yī)生的重要難題之一?；蛑委熓墙鼛啄陙?lái)在國(guó)際發(fā)展起來(lái)的一種有別于傳統(tǒng)治療的非常規(guī)方法，通過(guò)不同的基因載體將病毒整合于腫瘤細(xì)胞中，引發(fā)某種基因改變使腫瘤細(xì)胞自行凋亡或者提高對(duì)特定藥物的敏感性，為一些難治性腫瘤提供了一種新的思路，這種方法在婦科及胃腸腫瘤的治療中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用并觀察到了較好的效果[1]，但其在肝癌的臨床應(yīng)用中尚缺少相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)和資料。為了觀察基因治療對(duì)預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響及長(zhǎng)期療效，解決術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的難題，為提高目前國(guó)內(nèi)肝癌外科治療水平提供新的思路，本院在2000年開(kāi)始對(duì)裸鼠體內(nèi)肝癌和體外肝癌細(xì)胞進(jìn)行了基因治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，未觀察到明顯毒副作用[2]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)基因?qū)CC患者進(jìn)行了試驗(yàn)性治療，觀察了術(shù)后復(fù)發(fā)率，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 選取2006年7月-2013年2月在本院肝膽外科治療的HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡40～60歲(肝癌多人群，有代表性)；(2)術(shù)前經(jīng)臨床影像學(xué)診斷單發(fā)腫瘤直徑<10 cm，無(wú)明確淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TNM分期1～2期(無(wú)肝內(nèi)大血管侵犯)；(3)手術(shù)完整切除腫瘤，術(shù)后病理診斷為HCC，病理切緣距腫瘤>2 cm。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前已有介入或者其他腫瘤治療史；(2)服用免疫抑制劑或者其他影響免疫功能藥物的患者；(3)術(shù)中或術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥在1個(gè)月內(nèi)死亡；(4)嚴(yán)重肝硬化，肝功能Child-Pugh分級(jí)B～C級(jí)；(5)嚴(yán)重脾功能亢進(jìn)，PLT<5.0×109/L；(6)有其他臟器的功能不全以及對(duì)更昔洛韋過(guò)敏等不適合進(jìn)行基因治療的患者。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加試驗(yàn)的患者均簽屬了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法和分組標(biāo)準(zhǔn) 共有102例患者參加了試驗(yàn)，在治療前將基因治療的方法、費(fèi)用及可能產(chǎn)生的副作用向患者及家屬講明，然后根據(jù)自愿的原則由患者自主選擇分組和治療的方法。在術(shù)前符合研究要求的患者中，有60例患者采用了基因+手術(shù)治療(基因組)，其他42例患者采用單純的手術(shù)切除(手術(shù)組)。

1.3 基因治療方法 基因組患者分別進(jìn)行至少3次或者多次基因注射。注射用基因?yàn)锳DV-TK(濃度5×1012/ml)，共分3次(或者多次)進(jìn)行注射。第1次于術(shù)前在B超引導(dǎo)下通過(guò)穿刺針經(jīng)皮注射，3～4 ml/次，以生理鹽水100 ml稀釋后使用，注射于腫瘤中心及四周；第2次在術(shù)中注射于肝斷面、隔肌、腎包膜、后腹膜及胃網(wǎng)膜血管，2～3 ml/次，以生理鹽水100 ml稀釋后使用；第3次在術(shù)后2周通過(guò)介入方法，經(jīng)導(dǎo)管于肝動(dòng)脈內(nèi)注射基因2～3 ml(根據(jù)情況可多次注射，每次間隔1～2個(gè)月)。每次基因治療后常規(guī)靜脈滴注更昔洛韋，0.25 g/次，2次/d，持續(xù)2周。術(shù)后根據(jù)患者情況，可通過(guò)介入進(jìn)行多次局部或者全身治療。

1.4 觀察指標(biāo) 術(shù)后每月對(duì)患者隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括AFP、肝功能、B超，如有可疑，即行CT或者M(jìn)RI檢查以明確診斷，必要時(shí)對(duì)患者行PET-CT或者肝穿刺檢查，隨訪終點(diǎn)為腫瘤復(fù)發(fā)或者死亡。復(fù)發(fā)定義為術(shù)后CT或MRI檢查見(jiàn)肝內(nèi)肝外再次出現(xiàn)HCC或者AFP明顯升高。觀察指標(biāo)包括術(shù)前腫瘤大小、肝功能、AFP、異常凝血酶原[維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì) (protein induced by vitamine K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)]、術(shù)后病理結(jié)果(分化程度)、術(shù)后1個(gè)月內(nèi)并發(fā)癥及住院天數(shù)，主要觀察指標(biāo)為腫瘤累積復(fù)發(fā)率以及對(duì)其有顯著影響的因素。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 在參加試驗(yàn)的102例患者中，最終有92例患者完成了試驗(yàn)(基因組54例，手術(shù)組38例)，10例患者未完成基因治療療程或者術(shù)后無(wú)法進(jìn)行定期隨訪確定腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間。術(shù)前2組患者的腫瘤大小、肝功能、PLT以及腫瘤標(biāo)志物、PIVKA-Ⅱ比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。基因組54例患者中，有28例進(jìn)行了局部切除，17例進(jìn)行了1個(gè)肝段的切除,9例進(jìn)行了2個(gè)肝段及以上的切除；術(shù)后病理結(jié)果6例為高分化癌，其余48例患者為中-低分化癌。手術(shù)組38例患者中，19例進(jìn)行了局部切除，11例進(jìn)行了1個(gè)肝段切除，8例進(jìn)行了2個(gè)肝段及以上的切除；術(shù)后病理結(jié)果7例為高分化癌，其余31例為中-低分化癌。2組術(shù)后并發(fā)癥比較，除發(fā)熱基因組高于手術(shù)組外，余下差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組住院時(shí)間無(wú)明顯差異。術(shù)后病理切緣及患者術(shù)后1個(gè)月復(fù)查CT結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤殘余或者復(fù)發(fā)?；蛑委熀?，約88%的患者通過(guò)大體標(biāo)本及病理證實(shí)腫瘤壞死明顯，并形成完整包膜(圖1a～c)，而手術(shù)組僅有34%的患者有自然形成的包膜，二者相差明顯(χ2=3.12，P<0.05)。

表1 2組患者的臨床資料比較

圖1基因組術(shù)前MRI及術(shù)后病理標(biāo)本a：術(shù)前在治療后可見(jiàn)腫瘤與肝組織間有低信號(hào)帶；b:腫瘤包膜完整，中心有大量壞死細(xì)胞；c：包膜由纖維及部分凝固性壞死細(xì)胞組成(箭頭所示)， T示腫瘤， H示正常肝細(xì)胞

2.2 臨床預(yù)后 基因組平均隨訪時(shí)間為(3.9±1.2)年，手術(shù)組為(3.7±1.1)年?；蚪M中腫瘤復(fù)發(fā)26例，手術(shù)組腫瘤復(fù)發(fā)25例。基因組1、3、5年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為13.8%、33.7%和47.7%；手術(shù)組為18.5%、53.2%和69.2%，2組累積復(fù)發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.643,P=0.041)(圖2)。多數(shù)腫瘤復(fù)發(fā)部位在原腫瘤附近，或者肝內(nèi)其他部位出現(xiàn)新的增強(qiáng)結(jié)節(jié)。另有2例患者出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，2例患者為肝門(mén)及后腹膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖2 2組患者累積復(fù)發(fā)率比較

變量單因素分析(P值)多因素分析βP值比值比95%可信區(qū)間男/女0．5730．2630．310年齡(歲)(>60vs≤60)0．4830．2010．651基礎(chǔ)肝病(乙型肝炎vs丙型肝炎)0．7590．1750．397基因治療(是vs否)0．0311．1740．0382．7521．164～4．251肝硬化(是vs否)0．1730．4210．205TBil(μmol/L)(>34．2vs≤34．2)0．3920．3180．301PLT(109/L)(>100vs≤100)0．8690．1920．562PTA(%)(>80vs≤80)0．5640．1730．591AFP(ng/ml)(>7vs≤7)0．0290．4180．152PIVKA-Ⅱ(mAU/ml)(>40vs≤40)0．0210．3210．126腫瘤大小(cm)(>2vs≤2)0．1750．2850．375

2.3 與腫瘤累積復(fù)發(fā)率相關(guān)的影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，AFP、PIVKA-Ⅱ和基因治療與腫瘤累積復(fù)發(fā)率相關(guān)；多因素分析結(jié)果顯示，基因治療是腫瘤累積復(fù)發(fā)率的獨(dú)立影響因素(表2)。

3 討論

對(duì)于可切除的HCC患者，腫瘤復(fù)發(fā)仍是影響預(yù)后的重要因素。研究[3]發(fā)現(xiàn)HCC在肝內(nèi)擴(kuò)散以及局部的微轉(zhuǎn)移是術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因之一，此外手術(shù)過(guò)程對(duì)肝組織的擠壓和推動(dòng)也加速了腫瘤的轉(zhuǎn)移。所以多數(shù)醫(yī)院在術(shù)后采用藥物、介入及放療等方法，防止腫瘤復(fù)發(fā)。但肝癌一般惡性程度相對(duì)較高，對(duì)藥物敏感性較差，故效果均不明顯。因此目前迫切需要一種新的輔助方法防止腫瘤在術(shù)后擴(kuò)散。

根據(jù)最新國(guó)際研究成果以及本院的前期臨床試驗(yàn)，在對(duì)肝癌和晚期口腔腫瘤治療的體外試驗(yàn)中，基因治療具有良好的療效[4]。試驗(yàn)中采用的是整合了自殺基因的重組腺病毒，其中病毒作為載體將胸苷激酶基因傳入腫瘤細(xì)胞，磷酸化并納入到新生的DNA鏈中，其編碼產(chǎn)生鳥(niǎo)苷化合物(胸苷激酶)，可以將無(wú)毒性藥物前體更昔洛韋轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性藥物，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡。病毒對(duì)代謝和分裂活躍的細(xì)胞感染率較高[5]，而對(duì)正常細(xì)胞作用較少，因而可以有效的消滅殘留的腫瘤細(xì)胞。通過(guò)病理檢查還發(fā)現(xiàn)在基因治療后，腫瘤組織局部會(huì)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，伴有T、B淋巴細(xì)胞、巨細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，腫瘤體積縮小并形成完整的包膜，這樣減少了腫瘤復(fù)發(fā)和擴(kuò)散的機(jī)率[6]。所以這是一種新的治療思路，比傳統(tǒng)方式適用性和可重復(fù)性高，同時(shí)無(wú)其他毒副作用，對(duì)于肝功能較差的患者同樣適用。因此筆者在上述研究的基礎(chǔ)上將其用于HCC的臨床治療，發(fā)現(xiàn)基因治療同傳統(tǒng)治療方法相比，患者的無(wú)瘤生存率明顯提高，說(shuō)明基因治療可以延緩和減少腫瘤的復(fù)發(fā)。通過(guò)單因素分析發(fā)現(xiàn)與腫瘤累積復(fù)發(fā)率有關(guān)的因子包括AFP、PIVKA-Ⅱ和基因治療，在多因素分析中獨(dú)立影響因素僅為基因治療。這是因?yàn)榍?個(gè)指標(biāo)主要反映了腫瘤的惡性程度，AFP及PIVKA-Ⅱ高的患者腫瘤惡性程度高，易復(fù)發(fā)，這一點(diǎn)已經(jīng)在臨床得到證實(shí)，而后一項(xiàng)主要反映了治療因素，所以在單因素分析中也與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)；在多因素治療中排除了前二者，是因?yàn)榛蛑委熆梢杂行У慕鉀Q惡性程度較高的腫瘤高復(fù)發(fā)的問(wèn)題，是與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)性最強(qiáng)的因素。基因治療之所以較傳統(tǒng)方法療效更好，除了能夠直接抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)外，還可以通過(guò)旁觀者效應(yīng)，使附近腫瘤以及部分正常細(xì)胞死亡，與正常肝組織間形成一道纖維屏障，阻止腫瘤細(xì)胞向臨近播散和內(nèi)外血管交匯[7],這在本研究術(shù)前影像及術(shù)后病理中也得到了證實(shí)。所以在術(shù)前采用基因治療，就可以有效防止在手術(shù)過(guò)程中擠壓腫瘤所發(fā)生的肝內(nèi)擴(kuò)散，反復(fù)多次治療可以為再次切除或者射頻治療創(chuàng)造條件。而且這種方法基本無(wú)毒副作用，對(duì)肝功能不產(chǎn)生損傷，可以通過(guò)反復(fù)多次使用，達(dá)到更好的效果，這一點(diǎn)更是目前其他療法不具備的。

通過(guò)多年的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臨床療效與基因治療的腫瘤轉(zhuǎn)染率密切相關(guān)，這就需要注意以下幾個(gè)問(wèn)題。首先是腫瘤體積對(duì)治療的完全性影響較大，這是因?yàn)楸M管ADV-TK可以通過(guò)旁觀者效應(yīng)使臨近的腫瘤細(xì)胞死亡，但由于腺病毒滲透能力過(guò)低，一般來(lái)說(shuō)只有表層及臨近的細(xì)胞受到轉(zhuǎn)染，而壞死的細(xì)胞對(duì)內(nèi)部腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步感染有一定防護(hù)作用，這樣僅從外圍注射難以到達(dá)腫瘤內(nèi)部[8]，因此需要多點(diǎn)的內(nèi)部注射，而對(duì)于10 cm以及更大的腫瘤，多點(diǎn)注射轉(zhuǎn)染率也會(huì)受到明顯影響，甚至大部分腫瘤細(xì)胞都無(wú)法轉(zhuǎn)染，則難以達(dá)到治療目的，這也是此次試驗(yàn)主要針對(duì)10 cm以上肝癌患者的主要原因。此外轉(zhuǎn)染的途徑和次數(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)染率也有一定的影響，如果采用傳統(tǒng)的全身注射的方式，腺病毒濃度較低，且易被免疫系統(tǒng)破壞，所以為了提高轉(zhuǎn)染率，采用了多次和局部給藥的方式，所有患者給藥3次或者以上。同時(shí)筆者認(rèn)為作為一種仍處于試驗(yàn)階段的方法[9]，還有下列問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，主要包括探討新的載體及其轉(zhuǎn)染方式，使基因轉(zhuǎn)染量增加，以及針對(duì)個(gè)體的基因化精準(zhǔn)應(yīng)用，制訂標(biāo)準(zhǔn)化的基因治療方案和療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

基因治療具有安全、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，在肝癌患者的手術(shù)治療過(guò)程中，肝切除聯(lián)合基因治療可以在清除腫瘤的同時(shí)，防止術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存期，是一種值得推廣的新的治療方法。

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Clinicaleffectofrecombinantadenoviruscontainingthymidinekinasesuicidegeneinpreventingpostoperativerecurrenceofhepatocellularcarcinoma

MENGJian,DUSongtao,ZHANGJinguang.

(BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the clinical effect of surgical operation combined with gene therapy in preventing postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsA total of 102 patients with single HCC (TNM stage 1-2, tumor diameter <10 cm) who were admitted to Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, from July 2006 to February 2013 were enrolled, and among these patients, 60 underwent the gene therapy with recombinant adenovirus containing thymidine kinase suicide gene (ADV-TK) before and after surgery (gene group) and 42 underwent surgical resection alone (surgery group). The patients were followed up regularly after surgery to observe postoperative recurrence. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups, and the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. The log-rank test was used for the analysis of cumulative recurrence rate, and univariate and multivariate Cox regression analyses were used to identify influencing factors for recurrence rate.ResultsThe 1-, 3-, and 5-year recurrence rates of tumor were 13.8%, 33.7%, and 47.7% in the gene group and 18.5%, 53.2%, and 69.2% in the surgery group, and there was a significant difference between the two groups (χ2=2.643,P=0.041). The gene group had a significantly higher proportion of patients with pyrexia after surgery than the surgery group, and there were no significant differences in the incidence rates of other complications and length of hospital stay between the two groups. The multivariate analysis showed that gene therapy was an independent influencing factor for cumulative rumulative recurrence rate (odds ratio=2.752,95 confidence interval:1.164-4.251,P=0.038).ConclusionGene therapy combined with surgical resection can effectively reduce postoperative recurrence of tumor, and therefore, it holds promise for clinical application.

carcinoma, hepatocellular； gene therapy； recurrence

R735.7

A

1001-5256(2017)10-1944-05

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.10.019

2017-04-25；

2017-06-13。

孟健(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事肝癌治療和肝移植免疫方面的研究。

張勁光， 電子信箱：3522428451@qq.com。

引證本文：MENG J, DU ST, ZHANG JG. Clinical effect of recombinant adenovirus containing thymidine kinase suicide gene in preventing postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(10): 1944-1948. (in Chinese)

孟健， 杜松濤， 張勁光. 含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預(yù)防肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)的療效分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(10): 1944-1948.

(本文編輯：朱 晶)