低氧復(fù)合運動抑制低氧誘導(dǎo)的骨骼肌NLRP3炎性小體活化

張子怡 薄海 楊爽 王天添 袁瑤 張勇

1天津體育學(xué)院天津市運動生理學(xué)與運動醫(yī)學(xué)重點實驗室（天津 300381）

2武警后勤學(xué)院軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室（天津 300309）

低氧（hypoxia）是呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、血液疾病、高原病等的重要病理表征，表現(xiàn)為細胞氧供應(yīng)不足或氧利用障礙。骨骼肌是機體主要的氧利用器官。研究表明，長期低氧暴露造成骨骼肌肌纖維橫截面積減小，收縮耐受性和肌力降低，嚴(yán)重影響機體作業(yè)能力和生活質(zhì)量[1]。探討低氧損傷骨骼肌的病理機制及有效防護措施具有重要意義。研究表明，低氧環(huán)境下中等強度的運動訓(xùn)練，即低氧復(fù)合運動（exercise train?ing in hypoxia）可有效抑制低氧誘導(dǎo)的骨骼肌蛋白降解和細胞凋亡，促進毛細血管生成以提高低氧狀態(tài)下肌肉組織的氧氣供應(yīng)[2]。

炎癥反應(yīng)是低氧損傷的重要病理機制之一[3]。NL?RP3炎性小體（NLRP3 inflammasome）是機體固有免疫系統(tǒng)的重要成員，由識別蛋白NOD樣受體、銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和效應(yīng)蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）共同組成。NOD樣受體識別應(yīng)激源后聚集為NLRP3寡聚體，通過ASC募集并激活caspase-1，活化的caspase-1切割炎癥因子白介素1-β（IL?1β），使之成熟以參與炎癥反應(yīng)[4]。研究表明，低氧狀態(tài)下骨骼肌NLRP3炎性小體活性及其調(diào)控的IL-1β含量明顯升高[5]。提示NLRP3炎性小體活化是機體應(yīng)答低氧的重要環(huán)節(jié)。

研究表明，線粒體功能障礙產(chǎn)生高水平活性氧（ROS）是NLRP3炎性小體活化的重要因素[6]。人紅細胞衍生核因子2樣蛋白2（Nrf2）是細胞中應(yīng)答氧化應(yīng)激，并調(diào)控抗氧化酶系表達的重要轉(zhuǎn)錄因子[7]。研究表明，上調(diào)Nrf2[8]或抑制NLRP3炎性小體活化[9]均可有效減輕細胞缺血/缺氧損傷。但Nrf2是否參與NLRP3炎性小體對低氧的應(yīng)答尚不清楚。我們前期證明，低氧復(fù)合運動可有效改善低氧狀態(tài)下骨骼肌線粒體質(zhì)量，同時上調(diào)抗氧化酶表達[10]。本研究觀察低氧復(fù)合運動是否能抑制低氧誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化，并探討Nrf2在其間的生物角色。

1 材料與方法

1.1 動物分組與干預(yù)方案

32只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重201～233 g，隨機分為4組：常氧組（normoxia control group，NC）、常氧運動組（normoxia and exercise training group，NT）、低氧組（hypoxia control group，HC）和低氧復(fù)合運動組（hypoxia and exercise training group，HT），每組8只。HC組和HT組進行低氧暴露干預(yù)，參照本組前期工作[10]，將大鼠飼養(yǎng)于常壓低氧帳篷，氧氣濃度設(shè)置為11.3%，正常進食進水，光照12 h/d，持續(xù)4周。HT組大鼠每日一次置于低氧帳篷內(nèi)，小動物跑臺中行跑臺訓(xùn)練（5°，15 m/min），1 h/d，5 d/w，持續(xù)4周。NC和NT組大鼠于常氧帳篷內(nèi)飼養(yǎng)，NT組大鼠于常氧帳篷內(nèi)小動物跑臺訓(xùn)練，訓(xùn)練方案同HT組。各組大鼠末次低氧后即刻斷頭處死，組織剪分離雙側(cè)股四頭肌，單側(cè)肌肉在動物處死1 h內(nèi)提取線粒體，另一側(cè)肌肉于－80℃凍存，用于Caspase-1活性、IL-1β含量和蛋白表達檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 線粒體ROS產(chǎn)生速率測定

參照本組前期工作[11]，采用差速離心法純化線粒體，考馬斯亮藍法測定樣品蛋白濃度。0.5 mg線粒體加入反應(yīng)介質(zhì)中，加入5 mmol/L蘋果酸和10 mmol/L谷氨酸啟動線粒體態(tài)2呼吸，再加入5 μmol/L還原型二氯熒光素，37℃避光水浴15 min，充分反應(yīng)后置于熒光分光光度計（激發(fā)波長499 nm，發(fā)射波長521 nm）連續(xù)檢測10 min，計算線粒體ROS產(chǎn)生速率。

1.2.2 線粒體DNA中8-oxodG含量測定

嚴(yán)格按照試劑盒（Biovision）說明書純化mtDNA。參照我們前期工作[12]，高效液相色譜法檢測線粒體DNA中8-oxodG含量。采用粒徑為4 μm的C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm），流動相使用用10 mM醋酸，30 mM氫氧化鈉，12.5 mM檸檬酸，25 mM醋酸鈉，6%甲醇，流速0.8 mL/min，測量波長為260 nm。試劑盒內(nèi)8-oxodG標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)液，同等條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。換算樣品中8-oxodG含量。

1.2.3 骨骼肌Caspase-1活性測定

500 mg骨骼肌組織置于組織裂解液（0.1 mmol/L十二烷基硫酸鈉、0.5 mmol/L鵝去氧膽酸鈉、10 μmol/L抑酞酶和5 μmol/L苯甲基磺酰氟化物），裂解1 h后離心（8000 r/min），收集上清，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度。取200 μg樣品蛋白加入50 μL反應(yīng)介質(zhì)（組織裂解液+1mmol/L YVAD-AFC），避光反應(yīng)1 h，終產(chǎn)物于微量熒光酶標(biāo)儀檢測。NC組Caspase-1活性定義為1，NT、HC、HT組Caspase-1活性為與NC組比較的相對活性。

1.2.4 骨骼肌IL-1β 含量測定

采用ELISA法檢測。嚴(yán)格按照大鼠IL-1β定量酶聯(lián)檢測試劑盒說明書操作，于微量熒光酶標(biāo)儀檢測各組骨骼肌IL-1β含量。

1.2.5 Western blot法檢測NLRP3、ASC、Nrf2和NQO 1蛋白表達

以β-actin為內(nèi)參。將骨骼肌組織勻漿根據(jù)濃度不同加入SDS上樣緩沖液加熱處理5 min。10 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)于PVDF膜上。1∶2000對應(yīng)一抗孵育過夜，漂洗后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，充分漂洗后用熒光顯色試劑盒顯影，X-ray膠片曝光記錄，掃描各條帶灰度值。NC組條帶灰度值定義為100%，NT、HC和HT組為與NC組比較的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中雙因素方差分析進行組間比較，P＜0.05定義為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA中8-oxodG含量和ROS產(chǎn)生速率

HC組線粒體DNA中8-oxodG含量顯著高于NC組（P＜0.01），HT與HC組線粒體ROS產(chǎn)生速率顯著高于NC組（P＜0.05，P＜0.01）。HT組線粒體DNA中8-oxodG含量及ROS產(chǎn)生速率顯著低于HC組（P＜0.01）（表1）。

表1 各組線粒體DNA中8-oxodG含量及ROS產(chǎn)生速率的變化

2.2 骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表達

HT與HC組骨骼肌NLRP3蛋白表達顯著高于NC組（P＜0.05，P＜0.01），HC組ASC蛋白表達顯著高于NC組（P＜0.01）。HT組NLRP3和ASC蛋白表達均顯著低于HC組（P＜0.05，P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表達的變化

2.3 骨骼肌Caspase-1活性和IL-1β 含量

HC組骨骼肌Caspase-1活性顯著高于NC組（P＜0.01），HT與HC組IL-1β含量顯著高于NC組（P＜0.05，P＜0.01）。HT組Caspase-1活性和IL-1β含量均顯著低于HC組（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

2.4 骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表達

HC組骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表達均顯著低于NC組（P＜0.05，P＜0.01）。HT組Nrf2和NQO1蛋白表達均顯著高于HC組（P＜0.01）（圖2）。

表2 各組骨骼肌Caspase-1活性和IL-1β含量的變化

圖2 各組骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表達的變化

3 討論

作為細胞固有免疫的重要組分，NLRP3炎性小體活化是抵御病原微生物等危險因素侵襲的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但過度且持續(xù)的NLRP3炎性小體活化參與糖尿病、腫瘤等一系列疾病發(fā)生[4]。本研究中4周低氧暴露明顯活化大鼠骨骼肌NLRP3炎性小體，表現(xiàn)為NLRP3炎性小體的三個關(guān)鍵組分NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達增加，同時caspase-1活性及IL-1β含量升高。研究表明，IL-1β可通過活化泛素-蛋白酶體途徑參與低氧狀態(tài)下骨骼肌蛋白降解，導(dǎo)致肌肉萎縮。此外，IL-1β刺激其它細胞因子和趨化因子釋放，誘導(dǎo)組織炎性細胞浸潤，進一步加重骨骼肌損傷[13]。Cero等[14]報道，低氧暴露下，銜接蛋白ASC敲除小鼠肺動脈平滑肌受損程度顯著低于野生型小鼠。以上提示，NLRP3炎性小體活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是骨骼肌低氧損傷的病理機制之一。

本研究中，4周低氧復(fù)合運動明顯抑制了低氧誘導(dǎo)的骨骼肌NLRP3炎性小體活化。Wang等[15]在抑郁癥模型小鼠中也發(fā)現(xiàn)，4周有氧耐力訓(xùn)練顯著抑制海馬組織NLRP3炎性小體活化。以上提示，運動訓(xùn)練可在病理狀態(tài)下通過調(diào)控NLRP3炎性小體抑制炎性損傷。所有的NLRP3炎性小體活化因子，如Toll樣受體激活物、炎性因子、組織蛋白酶等，均可誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生[4]。這表明ROS在NLRP3炎性小體活化中的關(guān)鍵作用。研究表明，線粒體自噬障礙導(dǎo)致受損線粒體積累，產(chǎn)生過量ROS并激活NLRP3炎性小體[6]。此外，Oka等[16]報道，mtDNA氧化損傷后可從受損線粒體中釋放，直接結(jié)合并激活NLRP3炎性小體。本研究中，低氧復(fù)合運動明顯降低了低氧誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體ROS產(chǎn)量和mtD?NA中8-oxodG含量。以上提示，低氧復(fù)合運動可通過抑制ROS產(chǎn)生及mtDNA氧化損傷，下調(diào)低氧狀態(tài)下NLRP3炎性小體活化水平。

線粒體ROS的量由其產(chǎn)生能力和抗氧化酶系清除能力共同決定。Nrf2與其負調(diào)節(jié)蛋白Keap1結(jié)合而處于無活性狀態(tài)，ROS或親電子物質(zhì)促進Nrf2與Keap1脫偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位入細胞核與DNA中抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，調(diào)控血紅素氧化酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化還原酶1（NQO1）等一系列抗氧化酶的表達[7]。本研究中，4周低氧暴露顯著抑制骨骼肌Nrf2及其下游NQO1的表達。Shimizu等[17]報道，缺血早期心肌Nrf2表達迅速上調(diào)，但隨著缺血時間的延長，Nrf2表達逐漸降低。ROS是Nrf2活化的啟動因素，但持續(xù)高水平氧化應(yīng)激會活化胞核抑制因子Bach1，競爭性抑制Nrf2與ARE基因結(jié)合[18]。此外，前列腺素F2α參與調(diào)控Nrf2的泛素化和降解[19]。而慢性低氧上調(diào)骨骼肌前列腺素F2α表達[20]。這可能是長期低氧抑制骨骼肌Nrf2表達及轉(zhuǎn)錄活性的機制之一。

本研究中，低氧復(fù)合運動抑制了低氧對骨骼肌Nrf2及其下游NQO1的下調(diào)效應(yīng)，這與ROS和NLRP3炎性小體的變化趨勢一致。Liu等[21]報道，在腹膜炎模型中，Nrf2-/-小鼠巨噬細胞ROS產(chǎn)生增加，同時NLRP3炎性小體活化水平及IL-1β含量顯著高于野生型小鼠。證明Nrf2參與對NLRP3炎性小體的調(diào)控。他們還發(fā)現(xiàn)，Nrf2-/-小鼠給予抗氧化劑TBHQ灌胃，NLRP3炎性小體活性被抑制，而ARE相關(guān)抗氧化酶中僅NQO1表達升高[21]。表明NQO1清除過量ROS是Nrf2調(diào)控NLRP3炎性小體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，Nrf2可與p62直接結(jié)合以上調(diào)線粒體自噬，參與線粒體質(zhì)量控制[22]。我們前期證明低氧復(fù)合運動可提高骨骼肌PINK1和Bnip3介導(dǎo)的線粒體自噬[11]。以上表明Nrf2參與了低氧復(fù)合運動對NLRP3炎性小體的抑制效應(yīng)。

4 總結(jié)

低氧復(fù)合運動可上調(diào)Nrf2表達，并至少通過兩條途徑減少低氧誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化的因素，降低骨骼肌炎性反應(yīng)：1）提高線粒體健康水平以抑制ROS產(chǎn)生；2）上調(diào)抗氧化酶NQO1等抗氧化酶表達，增加ROS清除能力，并抑制線粒體DNA氧化損傷。