實時熒光核酸恒溫擴增技術和液體培養(yǎng)法在不孕不育人群解脲脲原體檢測中的應用比較

包杰，陳丹

(河南省人口和計劃生育科學技術研究院，河南 鄭州450002)

實時熒光核酸恒溫擴增技術和液體培養(yǎng)法在不孕不育人群解脲脲原體檢測中的應用比較

包杰，陳丹

(河南省人口和計劃生育科學技術研究院，河南 鄭州450002)

目的比較實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT）和液體培養(yǎng)法在解脲脲原體（UU）檢測中的診斷價值，以選擇更為準確、快速、實用的臨床檢測方法。方法 采集本院就診的不孕不育對象200例的分泌物2份拭子樣本，分別用于液體培養(yǎng)法和SAT法檢測。結果 液體培養(yǎng)法陽性率為60%，SAT法陽性率為47%，培養(yǎng)法陽性率高于SAT法，女性UU陽性率顯著高于男性，26例結果不一致中有11例培養(yǎng)陰性SAT陽性，15例培養(yǎng)陽性而SAT陰性，SAT法的敏感性（100%）和特異性（93.5%）均高于培養(yǎng)法。結論 解脲脲原體在不孕不育人群中感染率較高，加強就診對象UU的篩查、診治和預防，確保優(yōu)生優(yōu)育。SAT技術簡便、快速、精準，具有較高的臨床實用性，是適合實驗室診斷的檢測方法。

不孕不育；解脲脲原體；實時熒光核酸恒溫擴增技術；液體培養(yǎng)法

解脲脲原體 （UU）感染可引起泌尿生殖道疾病，是常見的性傳播疾病，在30%～40%的不孕不育人群中非淋菌性尿道炎是由解脲脲原體感染所致。近年來UU感染率迅速上升趨勢更加明顯，且在女性中的感染率更高，對人體生殖系統(tǒng)的健康造成了極大危害，已經成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前臨床檢測UU的方法多為液體培養(yǎng)法，它是通過UU分解不同底物改變其pH，使液體培養(yǎng)基發(fā)生顏色變化來判斷，但能分解尿素的細菌均可導致培養(yǎng)基顏色的變化，故單純靠顏色變化來判斷是否有UU感染會存在假陽性，且靈敏度低、用時長，因此，尋找準確、快速、實用的檢測方法有著重要的意義[1]。實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT）作為新一代的核酸擴增檢測技術現(xiàn)已被廣泛應用到病原體檢測領域，該技術具有高靈敏性、高特異性、低污染、反應穩(wěn)定等優(yōu)點[2]。本研究隨機選取了本院前來就診的200例不孕不育對象，采集男性尿道分泌物和女性陰道分泌物，同時應用液體培養(yǎng)法和實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT）進行UU的檢測，對這2種方法的診斷價值在臨床上的應用進行比較，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 2017年3-5月來自本院門診婦科、男科、生殖科或中醫(yī)科就診的不孕不育患者200例，年齡20～45歲，其中男性68例、女性132例。要求所有人員在標本采集的前7～10d，禁止采用抗菌藥物。所有人員在身體方面沒有明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 樣本采集用特制無菌棉拭子伸入女性宮頸口或男性尿道口約1～2cm，旋轉1周，停留10s后取出，第一個棉拭子立即加入1ml液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，第二個棉拭子放入1ml生理鹽水中浸泡，洗脫后取出，取0.5ml洗滌液加0.5ml尿樣保存液 （SAT試劑盒提供）混合作UU-SAT待測樣本，用EP管保存于-20℃冰箱。

1.3 試劑與方法

1.3.1 試劑 液體培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒 （UU+MH）生產廠商是鄭州安圖綠科生物有限公司，SAT法恒溫擴增檢測試劑盒（UU-RNA）由上海仁度生物科技有限公司提供，TL 988 PCR儀由西安天隆科技有限公司提供。

1.3.2 方法嚴格按照試劑盒的說明進行操作檢測，SAT預留標本從冰箱取出平衡至室溫后，按試劑盒說明書進行UU-SAT檢測。

1.4 樣本檢測

1.4.1 培養(yǎng)鑒定將分泌物拭子洗脫入培養(yǎng)基后，置37℃培養(yǎng)箱中24～48h，結果判斷嚴格按說明書進行。

1.4.2 SAT檢測按照試劑盒說明書操作，設置陰、陽性對照。取400μl加有尿樣保存液的預留樣本和100μl核酸提取液混勻，60℃恒溫5min，室溫放置10min，置磁珠分離器上靜置5min，加入洗滌液洗滌2次；加40μl反應液提取RNA，吸取30μl含磁珠的擴增檢測液至8連管中60℃恒溫10min、42℃恒溫5min，加入預熱的SAT酶液10μl，42℃實時恒溫擴增40min[3]。

1.5 結果判斷⑴液體培養(yǎng)法于24h或48h觀察結果，解脲脲原體（UU）陽性時生成的堿性物質會與培養(yǎng)基中的尿素發(fā)生反應，分解精氨酸，導致PH值上升，若培養(yǎng)液由黃色變成紅色，透明無混濁，則為陽性。⑵SAT法檢測結果根據(jù)實時熒光信號的出現(xiàn)時間和強度，結合陰、陽性對照和界值參考品對檢驗結果進行判定。dt≤35的樣本為陽性；dt為40或無數(shù)值的樣本為陰性；35＜dt＜40的樣本建議重新檢測，結果dt＜40的樣本為陽性（dt為閾值線與樣本曲線交點的橫坐標讀數(shù)，與PCR結果的Ct值類似）[5]。⑶以2種以上(包括2種)檢測方法的結果均陽性為真陽性，結果均陰性為真陰性。靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性+假陰性)例數(shù)×100%。特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性+假陽性)例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析 UU培養(yǎng)法和SAT法檢測結果采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件中的配對χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析，結果以率表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義[4]。

2 結果

2.1 UU培養(yǎng)和SAT檢測結果陽性率比較

2.1.1 200例受檢者中UU培養(yǎng)法陽性率為60%，UU-SAT法陽性率為47%，其中女性UU培養(yǎng)與UU-SAT陽性率分別為66.7%、54.5%，男性UU培養(yǎng)與UU-SAT陽性率分別為47.1%、32.4%，培養(yǎng)法陽性率均高于SAT法，女性UU陽性率顯著高于男性（P＜0.01）。2種方法的檢測結果見表1。

表1 2種方法檢測解脲脲原體陽性率統(tǒng)計表[n(%)]

2.2 敏感性和特異性比較 200例受檢者用2種方法檢測UU時有26例結果不一致，其中11例培養(yǎng)陰性SAT陽性，15例培養(yǎng)陽性而SAT陰性。通過感染者真陰性、真陽性的比較得出培養(yǎng)法的敏感性和特異性分別為91.4%、83.3%，SAT法的敏感性和特異性分別為100%、93.5%，SAT法的敏感性和特異性均高于培養(yǎng)法，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2種方法的敏感性和特異性見表2。

3 討論

支原體是存在于人類泌尿生殖系統(tǒng)中的病原微生物，侵犯泌尿生殖道黏膜上皮，可引起非淋菌性尿道炎，生殖器慢性炎癥，導致男女不孕不育。據(jù)報道支原體感染增加男性不育風險5倍多[6]，其感染影響精子活力，減低精子數(shù)量，干擾精卵結合，并可引起男性慢性前列腺炎、附睪炎等。女性感染未經治療可引起盆腔炎和宮頸炎，并使輸卵管黏膜上皮細胞受到損害，引起其炎性反應而導致阻塞或障礙，由支原體感染引起的輸卵管性不孕癥占22%。孕婦感染會造成母嬰垂直傳播與感染，引起嬰兒結膜炎、肺炎等新生兒感染，有部分研究表明支原體感染可能與習慣性流產、胚胎停育等生育異常相關。UU感染者大多數(shù)為隱匿性感染，常無癥狀或癥狀不明顯，因此易忽略就醫(yī)常被漏診，為發(fā)現(xiàn)無癥狀的患者，臨床多建議不孕不育患者進行常規(guī)UU篩查。傳統(tǒng)的UU檢測方法有涂片、培養(yǎng)、免疫學等，都存在檢出率低、周期較長、特異性差等缺點，給診斷和治療帶來困難，因此，建立高敏感、高特異、快速便捷的實驗室診斷方法控制該疾病的傳播，對臨床診斷和經驗治療有重要意義[7]。本研究采用液體培養(yǎng)法和SAT技術對本院就診的不孕不育對象的分泌物樣本進行UU檢測，分析不孕不育與支原體感染的相關性，并為其檢測治療提供合理的方法學和依據(jù)[8]。

表2 2種方法檢測解脲脲原體的結果比較

臨床實驗室多采用液體培養(yǎng)法檢測UU，其依據(jù)培養(yǎng)基顏色變化來判斷有無UU的生長，主觀性強，易造成假陽性或假陰性結果，且培養(yǎng)常需24～48h，但由于液體培養(yǎng)法操作簡單、經濟方便，可同時進行藥敏試驗，幫助臨床指導用藥，是目前包括基層在內的大部分醫(yī)院最常用的檢測方法。SAT法是一種新型RNA檢測技術，近年在國內病原體診斷領域發(fā)展快速[9]，臨床上常應用于檢測CT、UU、NG、MG等，該技術將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結合，無須高速離心、高溫加熱，特異性提取尿液或拭子樣本中的病原體RNA；RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易降解，交叉污染少，可有效降低核酸擴增檢測引起的假陽性問題，有助于臨床療效監(jiān)測；SAT采用磁珠法對特異性靶標進行捕獲擴增檢測，水相洗滌，最大限度去除雜質，有效減少假陰性，尤其是當患者正處于感染初期，病原體DNA量較少，RNA量相對較多時SAT技術更能顯示出其高敏感性[10]。SAT法檢測的是病原體16sr RNA，只有活菌中才有完整的RNA片段，因此相當于檢測活的病原體，此法既增加了液體培養(yǎng)法的靈敏度，又增加DNA檢測方法的特異性[11]，避免了機體殘留病原體DNA片段的影響，陽性可提示病原體處于活性狀態(tài)，對診斷有重要意義。患者經治療后病菌死亡、臨床癥狀消失，RNA在死亡的病原體中降解快速，有利于臨床用藥后的療效觀察及判愈，避免造成過度治療，增加患者心理和經濟負擔。這也說明用SAT檢測技術進行用藥療效判定有一定價值，SAT檢測陰轉提示已治愈，并為治愈后的復檢以及臨床用藥提供了參考方案[12]。有研究表明，UU-SAT在尿液和拭子檢測中的結果無差異，首段尿標本與拭子的敏感性相當，說明SAT法可以使用泌尿生殖道分泌物或尿液作檢測樣本，由于部分無癥狀患者對生殖道檢查取樣的排斥，做非侵入性的尿液樣本檢測更易于采集接受，避免拭子取樣的尷尬和痛苦，提高了患者取樣的依從性，減少了醫(yī)生的工作量，簡化了收集流程，具有較大的臨床應用價值[13]。

研究結果表明，200份標本中培養(yǎng)法與UUSAT陽性率分別為60%、47%，SAT法與國內文獻結果報道的不育不孕患者的UU陽性率更相近，SAT法低于培養(yǎng)法陽性率13%，該方法檢測的假陽性率明顯低于培養(yǎng)法。其中26例培養(yǎng)和SAT檢測結果不一致，出現(xiàn)11例SAT檢測陽性而液體培養(yǎng)陰性的可能原因有：培養(yǎng)過程中分泌物中存在某些微生物抑制了UU的生長繁殖，或在進化過程中UU發(fā)生突變，不分解尿素，沒有使培養(yǎng)基顏色改變；受檢者正處于感染初期，病原體DNA量少而RNA量多，SAT技術能檢測到病原體RNA的存在等。出現(xiàn)15例SAT檢測陰性而液體培養(yǎng)陽性的可能因素：拭子樣本中含有一些亦能分解尿素的細菌或真菌，菌量超過培養(yǎng)基抗生素抑制能力而導致液體培養(yǎng)變紅，出現(xiàn)假陽性；SAT樣本中的UU含量較低、存在擴增抑制物或樣本保存不當造成RNA降解等。目前的觀點認為，UU陽性只提示泌尿生殖道UU的存在，不能作為泌尿生殖道感染確診的依據(jù)，當病原菌達到一定的量（≥104CFU/ml）或出現(xiàn)臨床癥狀才需給予臨床治療[14]。

本研究結果顯示，UU在不孕不育患者感染中增加趨勢明顯，且女性的陽性率明顯高于男性，說明支原體對女性生殖道感染的影響嚴重，孕前應積極預防和治療UU的感染，從而提高UU感染所致不孕癥的治愈率。通過了解不孕不育人群中支原體的感染情況發(fā)現(xiàn)，在UU感染者中無癥狀患者占50%，提示多加防范檢測對象的漏診，為避免未及時檢測與就診延誤病情導致繼發(fā)感染或影響胚胎及胎兒發(fā)育等隱患，建議擬生育的夫婦雖無癥狀，也應做相關檢測，對于陽性患者，及早治療，確保優(yōu)生優(yōu)育[15]。本研究通過SAT法與液體培養(yǎng)法檢測UU的結果比較，應用SAT法可以幫助辨別培養(yǎng)造成的假陽性，對無癥狀患者和已治療但未完全清除的患者，標本中含量不高的病原微生物，SAT法可以更好的檢測出，避免漏檢[16]。

總之，SAT技術在臨床應用中，既具備采樣方便、耗時短、低污染的實驗要求[17]，又有敏感性高，特異性好，反應穩(wěn)定，結果準確可靠等優(yōu)點，還可用于用藥后的療效和判愈，幫助及時調整藥物，減少耐藥菌產生的機會，輔助進行臨床判愈評估[18]，并為支原體的實驗室診斷提供新的采樣方式和檢測方法，該技術更具有臨床實用性，優(yōu)于目前其他檢測方法，是一種值得推廣的檢測方法。

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Comparison of Simultaneous Am plification and Testing and Liquid Culture in the Detection of Ureaplasma Urealyticum amongInfertilitycrowd

BAO Jie，CHEN Dan.
Henan Province Research Institute for Population and Family Planning，Zhengzhou 450002，China.

Objective To evaluate the diagnostic value of real-time fluorescence nucleic acid thermostatic expansion technology(SAT)and liquid culturemethod in the detection of Ureaplasma Urealyticum(UU)，and select amore accurate，rapid and practical clinical testingmethod.Methods Swab and secretion were collected from 200 sterile patients in our hospital.Swab and secretion were tested by SAT and liquid culturemethod respectively.Results The positive rate of liquid culture was 60%，while the positive rate of SATmethod was 47%.The positive rate of culture was higher than the SATmethod.Female UU positive rate is significantly higher thanmale.The results of 26 patientswere inconsistent between SAT and liquid culturemethod.11 caseswere negative tested by liquid culturemethod but positive by SAT，and 15 caseswere positive tested by liquid culturemethod butnegative by SAT.The sensitivity(100%)and specificity(93.5%)of SATmethod were higher than culturemethod.Conclusion The infection rate of ureamycoplasma is higher in the population of infertile people.Thuswe should strengthen screening，diagnosis and prevention of UU，and ensure eugenics.The SAT is a simple，fast and precise technique for detection of UU，and has high clinical practicality，which is suitable for clinical laboratory diagnosis.

Infertility；Ureaplasma urealyticum；Simultaneous amplification and testing；Liquid culture

R375+.3，R446.5，R698+.2，R711.6

A

1674-1129(2017)05-0673-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.012

河南省屬科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(編號：JBKY2017003)

包杰，女，1974年生，主管檢驗技師，學士學位，從事工作：臨床檢驗。E-mail：905293917@qq.com

陳丹，男，檢驗師；學士/本科，從事工作：臨床檢驗。

2017-06-22；

2017-08-26)