我國3種瘋草的內生真菌培養(yǎng)特性研究

汪治剛，曹師，徐娜，徐杉，李彥忠

(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

我國3種瘋草的內生真菌培養(yǎng)特性研究

汪治剛，曹師，徐娜，徐杉，李彥忠*

(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

家畜取食瘋草出現中毒或死亡的原因為瘋草體內含可產生苦馬豆素的內生真菌。我國的多種瘋草中的內生真菌為同一種，同種瘋草中的內生真菌因隨種子傳播而孤立于單一寄主，可能出現與其他瘋草內生真菌不同的生物學特性。為此在通過形態(tài)學和分子生物學鑒定菌種的基礎上研究了我國最主要3種瘋草小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆中內生真菌菌株(LYZ0091、LYZ0093和LYZ0109)在不同溫度、pH值和培養(yǎng)基上的菌落生長速率和形態(tài)特性。結果表明，1)3個菌株的菌落停止生長的最高溫度不同，LYZ0109無法在30 ℃下生長，但LYZ0091和LYZ0093仍可生長，最適宜生長溫度分別為20、25和25 ℃，在5、10和15 ℃下4周時LYZ0091的生長速率顯著(P<0.05)高于LYZ0109，在20和25 ℃下則顯著(P<0.05)低于LYZ0109；2)在pH 4～11下3個菌株均可生長，菌株之間無顯著(P>0.05)差異；在培養(yǎng)基NA、PCA、PDA、PSA和WHDA上LYZ0109多顯著(P<0.05)大于LYZ0091；3)在溫度、pH值和培養(yǎng)基處理中3個菌株均未產生分生孢子，LYZ0091和LYZ0109的菌絲扭曲狀，厚垣孢子少，而LYZ093無扭曲狀菌絲，大量成串的厚垣孢子由基質底部向上呈樹狀生長。

瘋草;內生真菌;共生體;菌株;培養(yǎng)特性

瘋草(locoweed)是能引起草食動物出現典型神經學癥狀和病理學變化的有毒植物的統(tǒng)稱，主要為棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalus)植物中的部分種[1-2]，全球已知25種棘豆和31種黃芪，共計有56種[3]，其中我國有23種棘豆和22種黃芪，共計45種[4]。全世界每年因瘋草導致的家畜中毒，損失十幾億美元[5]，其中美國和我國是主要的受害國，美國西部是受害最嚴重的地區(qū)，據統(tǒng)計，西部17個州每年因有毒植物導致家畜中毒所造成的經濟損失高達1億美元；我國瘋草主要分布在陜西、四川、內蒙古、寧夏、甘肅、青海、新疆和西藏等省(區(qū))的草原、山地和荒漠地帶，優(yōu)勢瘋草為黃花棘豆和甘肅棘豆，瘋草災害已經成為世界范圍內的“生態(tài)經濟病”之一[6]。

已查明瘋草中的毒性物質主要為苦馬豆素(Swainsonine，SW)，而苦馬豆素的含量與其體內的內生真菌有關[7-8]。美國已在絹毛棘豆(O.sericea) 、密柔毛黃芪(A.mollissimus)和蘭伯氏棘豆(O.lambertii)等2種棘豆和6種黃芪中發(fā)現了內生真菌[8-10]。我國已在甘肅棘豆(O.kansuensis)[11]、小花棘豆(O.glabra)[12]、黃花棘豆(O.ochrocephala)[13]、毛瓣棘豆(O.sericopetala)、冰川棘豆(O.glacialis)[14]、變異黃芪(A.variabilis)[13]和莖直黃芪(A.strictus)[14]5種棘豆和2種黃芪中發(fā)現了內生真菌。

瘋草內生真菌自1999年首次發(fā)現至今，其分類地位先后發(fā)生了多次變化，起初鑒定為鏈格孢(Alternaria)[8]，2006年描述為埃里磚格孢(Embellisia)[15]，2009年為此類真菌建立了新屬(Undifilum)，并將長蠕孢(Helminthosporiumbornmuellerii)描述為一個組合新種Alternariabornmuellerii作為此新屬的模式種[16]，2014年又重新歸入鏈格孢屬，為此類真菌建立了Undifilum組[17]。瘋草內生真菌目前已描述了3個種，分別為絹毛棘豆、蘭伯氏棘豆、甘肅棘豆和小花棘豆中的棘豆鏈格孢(Alternariaoxytropis)[18]和美國的密柔毛黃芪中的Alternariacinereum和斑莢黃芪中的Alternariafulvum[19]。Yu[20]、盧萍等[21-22]、崔振[23]研究發(fā)現我國的所有瘋草內生真菌無論黃芪還是棘豆均為棘豆鏈格孢，而美國的瘋草內生真菌的種類更多。

瘋草內生真菌在常用培養(yǎng)基上和通常溫濕條件下生長極其緩慢、產孢量較少，給深入研究該菌帶來了很大困難。以往研究發(fā)現，菌落生長極其緩慢，在25 ℃、馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(PDA)下生長速率為0.03～0.34 mm/d，菌落形狀與顏色因不同瘋草種類及菌株變化較大，白色絮狀至深棕色或黑色，菌落表面致密，培養(yǎng)基內部常產生黑色、褐色的厚垣孢子[24]。大多菌落很難產孢，某些瘋草上的內生真菌從不產孢，如U.Cinereum[19]。該菌產生的分生孢子為棒狀，有隔膜。分隔處縊縮，分生孢子萌發(fā)出的芽管呈波浪狀，故稱之為波浪芽管孢[24]。不同瘋草上的內生真菌產生的分生孢子的形態(tài)并無明顯差異[19，24]。

已有研究發(fā)現瘋草內生真菌的菌絲分布于包括種子在內的植株體內的任何組織中[25-26]，其僅可通過種子帶菌傳到下一代瘋草植株中[10，27-28]，但不能在同種的不同植株之間傳播，更不能在不同種的植株之間傳播，然而，在美國絹毛棘豆、蘭伯氏棘豆和我國的小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆中的內生真菌卻為同一個真菌種。如果瘋草內生真菌只能通過種子垂直傳播而不能通過孢子水平傳播的論斷正確，則說明這種菌在其寄主進化的某個階段就已分別進入到不同瘋草之中了，經過長期與寄主的共同進化，不同瘋草中的菌株之間可能存在某些差異。

本試驗的研究目的為比較我國的甘肅棘豆、小花棘豆和黃花棘豆體內的內生真菌在不同溫度、不同培養(yǎng)基、不同酸堿度的培養(yǎng)基上的菌落特征確定菌株之間的異同。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1植物材料 小花棘豆于2013年8月采集于內蒙古自治區(qū)阿拉善左旗，黃花棘豆于2014年7月采集于寧夏海原縣南華山，甘肅棘豆于2014年9月采集于甘肅省天祝縣抓喜秀龍鄉(xiāng)。將采集的標本制作為蠟葉標本，供分離其內生真菌。

1.1.2供試菌株 從1.1.1中采集的植株中分離真菌，獲得不同瘋草中的內生真菌，在每種瘋草中各選一個菌株用于比較菌落生長特性。

1.1.3供試培養(yǎng)基 本研究使用的8種培養(yǎng)基分別為：馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(Potato dextrose agar， PDA。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)[29]、馬鈴薯胡蘿卜煎液培養(yǎng)基(Potato carrot agar， PCA。胡蘿卜和馬鈴薯各20 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)[30]、馬鈴薯蔗糖瓊膠培養(yǎng)基(Potato sucrose agar， PSA。馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar, NA。牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)、水瓊脂培養(yǎng)基(Water agar, WA。瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)[29]、V-8培養(yǎng)基(Vegetables-8。番茄濾液200 mL，CaCO33 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)[30]、麥稈煎液瓊脂培養(yǎng)基 (Wheat-straw decoction agar， WHDA。小麥秸稈20 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)[31]、瘋草煎液瓊膠培養(yǎng)基(Locoweed decoction agar， LDA。瘋草植株20 g，瓊膠17 g，蒸餾水1000 mL)。

1.2方法

1.2.1內生真菌分離 按如下步驟從植株的莖稈中分離內生真菌：在每種瘋草的植株中挑選無病無蟲生長健壯的2個枝條，摘除葉片、葉柄和側枝，選取5 cm的一段莖稈；用75%的酒精消毒30 s，再用1%的次氯酸鈉溶液消毒3 min，用無菌水沖洗2次后用濾紙吸干表面的水滴；切成3 mm的大塊，轉移到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上22 ℃下培養(yǎng)。待組織塊周圍長出菌落時挑取菌落邊緣的菌絲體純化獲得純培養(yǎng)。

1.2.2內生真菌的確定 采用菌落形態(tài)和分子生物學2種方法確認分離純化的菌株為內生真菌。將純化的菌株在PDA上培養(yǎng)，根據菌落生長速度極其緩慢、菌落凸起而不易在培養(yǎng)基表面擴展的特性初步確定為瘋草內生真菌。并提取菌株的DNA，用ITS1和ITS4引物PCR擴增后測序，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法(neighbour-joining method, NJ)將測序獲得的序列與國內外已報道的瘋草內生真菌菌種的ITS序列混總構建系統(tǒng)發(fā)育樹進一步確認為瘋草內生真菌。

1.2.3菌落特性比較 本研究設有不同培養(yǎng)基、 不同溫度和pH值共3個試驗， 其中供試培養(yǎng)基同1.1.3，22 ℃黑暗培養(yǎng)； PDA培養(yǎng)基在5、10、15、20、25、30和35 ℃共7個溫度梯度， 黑暗培養(yǎng)； 用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調制為4、5、6、7、8、9、10和11， 共8個梯度， 22 ℃黑暗培養(yǎng)。

在上述培養(yǎng)基制備后用內徑4.5 mm的打孔器在PDA上22 ℃下培養(yǎng)5周的菌落邊緣取出菌餅，轉至裝有供試培養(yǎng)基的90 mm培養(yǎng)皿中，每個處理設3個重復并用封口膜封口，置于滿足上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中每周檢查封口膜是否完好，如發(fā)現封口膜有裂口則及時更換。

培養(yǎng)后每周按十字交叉法測量1次菌落直徑，共測4次，按如下公式計算菌落凈生長直徑和菌落生長速度。

菌落凈生長直徑(D)=菌落直徑(D2)-菌餅直徑(D1)

菌落生長速率(R)=菌落凈生長直徑(D)/培養(yǎng)天數(T)

每次測量時觀察菌落形狀、顏色和質地，并拍照。

1.2.4菌絲生長與產孢顯微觀察 測量觀察4周后繼續(xù)培養(yǎng)至菌落大小占培養(yǎng)皿一半以上，選擇具有代表性的NA培養(yǎng)基和pH 7的PDA培養(yǎng)基的菌落，用于觀察菌絲特征和產孢特征。具體方法為：剪下蓋玻片一半大小的透明膠帶放在菌落表面，輕輕按下使菌絲粘在膠帶上，再把膠帶放在載玻片上，加1滴無菌水，加1滴苯胺藍液，蓋上蓋玻片制作水裝片后觀察氣生菌絲和厚垣孢子的形狀和顏色，并測量直徑。在培養(yǎng)皿中向下切取一塊菌落，深度至培養(yǎng)皿底部，再切去培養(yǎng)基的表面，留無氣生菌絲的培養(yǎng)基，取小塊壓碎在載玻片上，加水和苯胺藍，置于普通光學顯微鏡下觀察基質內菌絲的形狀和顏色，測量菌絲直徑和厚垣孢子的大小。

1.3統(tǒng)計分析

同組的菌落生長速率采用SPSS 17.0軟件Duncan法統(tǒng)計分析，計算結果采用Excel 2007制圖。采用Photeshop制作菌落特性、菌絲特征和厚垣孢子特征的圖片。

2 結果與分析

2.1菌株分類與分類地位確認

從小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆的莖稈中分離的真菌菌落均生長緩慢，菌落初期白色，后變灰褐色，與此前研究獲得的菌株特性相同。從中選擇出的菌株編號分別為LYZ0091、LYZ0093和LYZ0109。此3個菌株在構建系統(tǒng)發(fā)育樹均與已報道的瘋草內生真菌Alternariaoxytropis、Alternariafulvum和Alternariacinereu歸于同一分支，自展值為95，均屬于鏈格孢undifilum組，在該組中供試的3種瘋草中的內生真菌與Alternariaoxytropis無差異，而Alternariafulvum和Alternariacinereu自成下一級分支中，可確定供試的3種瘋草的內生真菌為Alternariaoxytropis(圖1)。

圖1 基于ITS-rDNA的瘋草內生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of locoweed endophyte based on ITS-rDNA 圖中數字表示自展支持率，越高代表親緣關系越近。 The digital of the Figure represents the bootstrap value, of which higher on behalf of closer genetic relationship.

2.2在不同溫度下的菌落特征

3個菌株在5～25 ℃范圍內均可生長，LYZ0091和LYZ0093在30 ℃下也可緩慢生長，但LYZ0109在30 ℃下不能生長，3個菌株在35 ℃下均停止生長(圖2)。

除在10 ℃下第一周時之外，在5、10和15 ℃下的第1周至第四周時LYZ0091的生長速率均顯著(P<0.05)高于其他2個菌株，LYZ0093的生長速率在5 ℃下的第4周、10 ℃下的第4周和15 ℃下的第3周和第4周均顯著(P<0.05)高于LYZ0109 (圖2-A, B, C)。

在20和25 ℃下LYZ0109 的生長速度超過其他2個菌株，在20 ℃時僅在第2周時顯著(P<0.05)高于其他2個菌株，而在25 ℃下除在第1周差異不顯著之外，其他3周均顯著(P<0.05)高于其他2個菌株(圖2-D, E)。在30 ℃下LYZ0109 已停止生長，而其他2個菌株生長緩慢，其中LYZ0091的生長速率顯著高于LYZ0093(圖2-F)。

LYZ0091的最高生長速率為0.80 mm/d(20 ℃下3周時)(圖2-D)，LYZ0093的最高生長速率為0.96 mm/d(25 ℃下4周時)(圖2-E)，LYZ0109 的最高生長速率為1.09 mm/d(25 ℃下4周時)(圖2-E)。

由上可見，3個菌株最適溫度為20～25 ℃，LYZ0091與LYZ0093對溫度的反應相似，在5～20 ℃下比LYZ0109 生長快。與其他2個菌株相比，LYZ0109 不耐高溫。

在5、10和15 ℃下3個菌株的菌落均為白色，菌落邊緣圓，而20和25 ℃下菌落表面出現黑褐色，菌落邊緣鋸齒狀；在30 ℃下LYZ0091和 LYZ0093有少量生長，前者白色，后者僅有少量菌絲，菌落顏色未明顯變化，LYZ0109未生長，仍保留接入時的黑色。

Taking a0 = 84 μm, xd = 37.5 μm, γc = 0.9545 and γd = 1 into Eqs. (9) and (10)：

圖2 瘋草內生真菌3個菌株在PDA上不同溫度下黑暗培養(yǎng)4周的生長速率 Fig.2 Grow rate of locoweed endophyte cultured on PDA under different temperature at dark for 4 weeks A：5 ℃，B：10 ℃，C：15 ℃，D：20 ℃，E：25 ℃，F：30 ℃；LYZ0091為小花棘豆內生真菌，LYZ0093為黃花棘豆內生真菌，LYZ0109 為甘肅棘豆內生真菌；3個菌株比較在同一時間的數據上標有不同字母者差異顯著(P<0.05)。下同。A: 5 ℃, B: 10 ℃, C: 15 ℃, D: 20 ℃, E: 25 ℃, F: 30 ℃; LYZ0091: endophyte from Oxytropis glabra, LYZ0093: endophyte from O. ochrocephala, LYZ0109: endophyte from O. kansuensis; Data with different letters mean difference significantly (P<0.05) compared within 3 strains.The same below.

在20和25 ℃下3菌落差異最明顯，LYZ0091的菌落凸起，表面的菌絲體隆起，呈同心輪紋狀，LYZ0109則在培養(yǎng)基表面擴展，菌落平坦，LYZ0093介于二者之間。

2.3在不同酸堿度下的菌落特征

3個菌株在供試的所有酸堿度下均能正常生長，LYZ0093的生長速率在大部分處理中均高于其他2個菌株，LYZ0109在堿性條件下低于其他2個菌株，但差異不顯著(P>0.05)(圖3-A、C、D、E、F、G、H)。

3個菌株在pH 10下菌落生長較快，其次為pH 8和pH 9下。LYZ0091生長速率最大為1.11 mm/d(在pH 10下4周)(圖3-G)，LYZ0093生長速率最大為1.30 mm/d(在pH 10下4周)(圖3-G)，LYZ0109最大為0.80 mm/d(在pH 7下4周)(圖3-D)。

LYZ0091除在pH 10上菌落邊緣有放射狀菌絲外, 在其他酸堿條件下(pH 4～9)均呈白色至灰色， 中心凸起，邊緣隆起一圈，呈煎蛋狀。LYZ0093和LYZ0109在pH 4～9下的菌落黑褐色，菌落平坦，邊緣有白色的圈。LYZ0109在pH 10～11下的菌落為白色泛藍?？傮w上，LYZ0091不同于LYZ0093和LYZ0109, 而后兩者相似。

圖3 瘋草內生真菌3個菌株在PDA上不同酸堿度下黑暗培養(yǎng)4周的生長速率Fig.3 Grow rate of locoweed endophyte cultured on PDA under different pH at dark for 4 weeks A：pH 4，B：pH 5，C：pH 6，D：pH 7，E：pH 8，F：pH 9，G：pH 10；H：pH 11.

2.4在不同培養(yǎng)基上的菌落特征

LYZ0109在大部分培養(yǎng)基上的生長速率高于其他2個菌株(圖4-B、C、D、E)，且從第1周至第4周先增加后降低(圖4-A、B、D、E、F)。除在WHDA上第2周時生長速率明顯增加和在WA上2周時明顯下降之外，LYZ0091在其他培養(yǎng)基上的生長曲線與橫坐標幾乎平行，或輕微向上，故此菌株的生長速度最穩(wěn)定(圖4-A、B、C、D、E、F)。

LYZ0091的生長速率最大為1.25 mm/d(在V-8上4周時)，LYZ0093的生長速率最大為1.28 mm/d(在V-8上3周時)，LYZ0109的生長速率最大為1.30 mm/d(在PSA上3周時)(圖4)。

圖4 瘋草內生真菌3個菌株在不同培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)4周的生長速率Fig.4 Grow rate of locoweed endophyte cultured on different media at dark for 4 weeks A：瘋草煎液瓊膠培養(yǎng)基 Locoweed decoction agar (LDA); B：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 Nutrient agar (NA); C：馬鈴薯胡蘿卜煎液培養(yǎng)基 Potato carrot agar (PCA); D：馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基 Potato dextrose agar (PDA); E：馬鈴薯蔗糖瓊膠培養(yǎng)基 Potato sucrose agar (PSA); F：V-8培養(yǎng)基 Vegetables-8 (V-8); G：水瓊脂培養(yǎng)基 Water agar (WA); H：麥稈煎液瓊脂培養(yǎng)基 Wheat-straw decoction agar (WHDA).

供試菌株在PDA和PSA上的菌落形狀和顏色基本相同。LYZ0091的菌落中心凸起，灰色，邊緣隆起，白色，中心至邊緣下陷，菌落呈煎蛋狀，LYZ0093的菌落平展，黑褐色，邊緣放射狀白色菌絲體，LYZ0109的菌落平展，白色，邊緣整齊，但在PSA上的菌落邊緣灰色。

同一菌株在V-8、WHDA、LDA上的菌落也相似，灰色泛藍，但在LDA上有黑色暈圈。

在PCA上的菌落與其他培養(yǎng)基上均不同，除頂部有白色之外，菌落其他部位均呈黑褐色。在NA上的菌落均呈白色。

綜合3種菌株在8種培養(yǎng)基上的特征，最明顯的差異為：LYZ093的菌落邊緣放射狀的菌絲，不整齊，而其他菌株的邊緣無放射狀菌絲，整齊。

2.5菌絲生長與產孢顯微觀察

圖5 瘋草內生真菌3個菌株培養(yǎng)30周時的菌落特征Fig.5 Colony characteristics of locoweed endophyte cultured for 30 weeks A：小花棘豆內生真菌LYZ0091在NA上；B：黃花棘豆內生真菌LYZ0093在NA上；C：甘肅棘豆內生真菌LYZ0109在NA上；D：LYZ0091在pH 7上；E：LYZ0093在pH 7上；F：LYZ0109在pH 7上。A: Endophyte from Oxytropis glabra LYZ0091 on NA; B: Endophyte from O. ochrocephala LYZ0093 on NA; C: Endophyte from O. kansuensis LYZ0109 on NA; D: LYZ0091 on pH 7; E: LYZ0093 on pH 7; F: LYZ0109 on pH 7.

3個菌株在NA培養(yǎng)基和pH 7下培養(yǎng)30周后菌落均存在明顯差異，其中在NA上的菌落白色，但LYZ0091的菌落上有灰色，LYZ0093的菌落表面粗糙，邊緣鋸齒狀，LYZ0109的菌落平坦，質地細密(圖5)；在pH 7下的菌落均呈黑色，其中LYZ0093最黑，且邊緣有樹狀大量分枝，LYZ0109的菌落邊緣有纖細的放射狀分枝，LYZ0091的菌落邊緣出現不對稱的聚集狀變黑(圖5)。

LYZ0091和LYZ0109的菌絲特征相同：氣生菌絲的生長方向雜亂，多纖細，寬5 μm，高度扭曲狀，菌絲圈狀(圖6-a)，纖細的菌絲中有少量筆直，比螺旋狀菌絲寬2倍，10 μm，氣生菌絲中出現圓球狀的膨大體，即生于菌絲中的厚垣孢子，無色至褐色，培養(yǎng)基中的菌絲與氣生菌絲相似(圖6-b)；而LYZ0093的氣生菌絲從菌落中心向外擴展，筆直、無扭曲狀菌絲，菌絲中出現成串的黑褐色的厚垣孢子(圖6-c)，培養(yǎng)基中菌絲少，而有大量成串的厚垣孢子，形成樹狀多級分枝，“樹”的主稈在培養(yǎng)基的底部，樹狀分枝向上伸展(圖6-d)。3個菌株在所有培養(yǎng)條件下均未產生分生孢子。

圖6 瘋草內生真菌3個菌株的菌絲和產孢觀察(在NA和pH 7上黑暗培養(yǎng)30周)Fig.6 Hyphae and sporulation of locoweed endophyte cultured for 30 weeks a：LYZ0109卷曲的氣生菌絲;b：LYZ0091的波浪形的菌絲；c：LYZ0093氣生菌絲上產生的厚垣孢子;d：LYZ0093基質中的厚垣孢子。a: Curved aerial hypha of LYZ0109; b: Waved aerial hyphae of LYZ0091; c: Chlamydospore of LYZ0093 from aerial hyphae; d: Chlamydospore of LYZ0093 from submerged hyphae.

3 結論與討論

小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆作為我國主要的3種瘋草，造成家畜中毒死亡的事件頻發(fā)，動物毒理學測定其對反芻動物的毒性較高[32-36]。這些瘋草的內生真菌可產生苦馬豆素，其含量與美國瘋草中的苦馬豆素含量接近[20，22，37-40]。本研究用分離自小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆的3個內生真菌菌株LYZ0091、LYZ0093和LYZ0109，經形態(tài)學和分子生物學鑒定后確定為同一種即棘豆鏈格孢(Alternariaoxytropis)，研究其菌落培養(yǎng)特性如生長速率、形態(tài)學特征等，與Pryor等[24]、Baucom等[19]、崔振[23]的研究基本一致。我國的小花棘豆和甘肅棘豆的內生真菌已在此類真菌分類地位確立時被鑒定為Alternariaoxytropis(異名為Embellisiaoxytropis，Undifilumoxytropis)[16-17]，2015年崔振[23]測定了黃花棘豆內生真菌的7個基因位點，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹均證明該瘋草中的內生真菌與小花棘豆和甘肅棘豆中的內生真菌屬于同個物種。

每種生物在進化過程中都形成了穩(wěn)定的生物學特性，其中對溫度適應能力是主要的生物學指標，可生存的最高、最低和最適溫度稱為生物的三基點溫度。本研究發(fā)現3個菌株之間最大差異為菌落可生長的最高溫不同，即甘肅棘豆內生真菌在30 ℃下無法生長，在25 ℃下可良好生長，故甘肅棘豆內生真菌菌落最高生長溫度在25～30 ℃之間。此特性同其近似種甘肅鏈格孢(Alternariagansuense)，異名為沙打旺埃里磚格孢(Embellisiaastragali)[41-42]。小花棘豆和黃花棘豆內生真菌在35 ℃下也無法生長，在30 ℃下生長，但后者的生長速率極小，近于停止，因此，二者最高生長溫度在30～35 ℃之間，且完全抑制黃花棘豆菌落生長的最高溫應低于小花棘豆內生真菌。因菌株不同，適宜于菌落生長的最適溫度不同，菌株LYZ0091適宜溫度為20 ℃，LYZ0093，LYZ0109適宜溫度為25 ℃。其中小花棘豆內生真菌對溫度的反應較為遲鈍，在30 ℃下的生長速率與在5 ℃下相近，在15 ℃下的也與在20 ℃下和在25 ℃下的差異不大。

甘肅棘豆內生真菌不耐高溫可能與其寄主生長環(huán)境有關，甘肅棘豆多生長在祁連山脈的高山草原，土壤以黑鈣土為主，海拔在2500 m以上，氣候寒冷陰濕，主要見于寧夏、甘肅、青海、四川和云南的西北以及西藏的一些高寒牧區(qū)[43]，本研究的LYZ0109菌株的寄主采集自天祝縣抓喜秀龍草原，該地位于青藏高原的東北緣，海拔在2878～3425 m，年均氣溫僅1.2 ℃[44-46]。與此相比，小花棘豆生長在草原、荒漠草原以及荒漠區(qū)的低濕地，是輕度耐鹽植物[47-48]，如本研究中小花棘豆采集于阿拉善左旗，年均氣溫為6.0～8.5 ℃[49]，采集黃花棘豆的海原縣的年均氣溫為7 ℃[50]。然而，本研究觀察到不同菌株在一定高溫下停止生長，也并不意味著菌絲死亡，故后續(xù)有必要確定其菌絲死亡的溫度，即致死高溫。

3個菌株在供試的各級酸性和堿性培養(yǎng)基上均可生長，LYZ0091和LYZ0093在pH 10下的生長速率最高，但LYZ0109在pH 7下的生長速率最大，差異不明顯。瘋草內生真菌的菌絲完全生活在寄主體內，其寄主體內的pH條件應較為穩(wěn)定，甘肅棘豆生長土壤以黑鈣土為主，pH偏中性，而小花棘豆生長的草原、荒漠草原以及荒漠區(qū)的低濕地，pH偏堿性，是輕度耐鹽植物，故在pH 10時生長最快，為何其對酸堿條件的反應不明顯，有待后續(xù)研究。同類的情況亦出現在菌絲完全寄生體內的一種其近似種甘肅鏈格孢(Alternariagansuense)上[31]。

V-8是培養(yǎng)和鑒定此類真菌常用的培養(yǎng)基[10]，3個菌株在此培養(yǎng)基上菌落生長最快，在WA上生長速率最低，是因為其僅可提供菌物水分，而不提供營養(yǎng)成分。用瘋草莖稈煎熬配制的LDA對菌落生長速率未產生明顯影響。甘肅鏈格孢在WHDA上的生長速率顯著高于V-8[41]，瘋草內生真菌與此菌不同。然而，在不同培養(yǎng)基條件下，菌落形狀和顏色比菌落生長速率提供的信息更豐富，可用來區(qū)分菌株。如根據3個菌株在PDA或PSA上的形狀和顏色可區(qū)分開來。瘋草內生真菌是一類生長緩慢的真菌，氣生菌絲較少，而大部分菌絲生長在培養(yǎng)基內，故其菌落的生長速率可能與培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況有關，觀察發(fā)現營養(yǎng)豐富時菌落更易向培養(yǎng)基底部和頂部生長，而不會沿培養(yǎng)基表面和內部擴散，如在PDA培養(yǎng)基上。V-8、PCA、WHDA、LDA等培養(yǎng)基為營養(yǎng)貧乏培養(yǎng)基，瘋草內生真菌的菌落生長速率高于PDA等。

在所有培養(yǎng)條件下3個菌株均未產生分生孢子，但在一些條件下產生了大量成串的厚垣孢子。瘋草內生真菌在人工培養(yǎng)條件下較難產孢，有的菌種未見產孢，如密柔毛黃芪中的內生真菌Alternariacinereum就不能產孢，而是根據其分子生物學特性鑒定為新種[19]。顯微觀察發(fā)現菌落顏色決定于是否產生厚垣孢子，如果沒產生厚垣孢子，則菌落為白色，如果產生了少量厚垣孢子，則菌落顏色淺；換言之，菌落顏色加深意味著已產生了厚垣孢子。在氣生菌絲和基質中的菌絲上均可產生厚垣孢子，但以基質中的菌絲為主。無論是氣生菌絲還是基質中的菌絲，新生的菌絲呈波浪狀或高度扭曲狀，氣生菌絲在培養(yǎng)基表面則出現圈狀菌絲團。瘋草內生真菌曾命名為Undifilum屬，其義為分生孢子產生的芽管呈波浪狀[16]，但近年發(fā)現這種特性并不一定出現在所有同類真菌中[40]。崔振[23]研究發(fā)現瘋草內生真菌在培養(yǎng)過程中劃傷菌落有利于產孢，本研究培養(yǎng)的3個菌株在多種培養(yǎng)條件下均未產孢可能與密封培養(yǎng)皿導致皿內的濕度過大，有利于營養(yǎng)生長而不利于生殖產孢有關。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件獲得分生孢子有利于最終查明其完整的生活史，可減輕瘋草及其內生真菌對畜牧業(yè)造成的負面影響。

內生真菌對寄主有明顯的趨化性，在進化過程中已經形成對寄主的適應機制[38]。內生真菌侵染組織后，為了行使特定的生物學功能，雙方在形態(tài)、生理和分子水平均發(fā)生著深刻的變化，從而建立穩(wěn)定有效的共生體[43]。小花棘豆采自內蒙古騰格里境內，黃花棘豆采自寧夏海原，均屬溫帶大陸性氣候，甘肅棘豆采自甘肅天祝高寒草原，氣候寒冷陰濕，3種菌株雖屬同種真菌，但因對寄主不同生境的適應性進化，彼此產生了一定的差異。雖然小花棘豆、黃花棘豆和甘肅棘豆中的內生真菌在培養(yǎng)溫度等方法存在一些差異，但趨同性多于差異性，這與分子生物學研究結果相符。我國已發(fā)現的2種黃芪和6種棘豆中的內生真菌均為同一個真菌種[23，39]，意味著可能存在不同瘋草中的內生真菌可以相互侵染其寄主的情況，是否存在這種可能尚有待通過交換寄主接種來驗證。

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Culturalcharacteristicsoffungalendophytefrom3locoweedspeciesinChina

WANG Zhi-Gang, CAO Shi, XU Na, XU Shan, LI Yan-Zhong*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology，LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Locoweeds contain swainsonine-producing fungal endophytes. Endophytes in several locoweed species in China are known to belong to the same taxonomic species of fungus. However, since these endophytes are isolated within their respective hosts and vertically transmitted to seed of the next plant generation, it is likely that the fungal endophytes of the various locoweed species have developed distinctive biological traits. Colony growth rate and morphological characteristics of endophytes fromOxytropisglabra,O.ochrocephalaandO.kansuensis(strains LYZ0091, LYZ0093 and LYZ0109, respectively) were studied under different temperature and pH regimes and grown on various media to test this hypothesis. It was found that: 1) The maximum temperature for growth differed between strains (LYZ0109 ceased growth at 30 ℃, while LYZ0091 and LYZ0093 continued to grow at 30 ℃); 2) The optimum temperatures for colony growth were 20, 25 and 25 ℃, respectively, for LYZ0091, LYZ0093, and LYZ0109; 3) The growth rate of LYZ0091 at 5, 10 and 15 ℃ was significantly (P<0.05) higher than LYZ0109, while significantly (P<0.05) lower than LYZ0109 at 20 and 25 ℃. 4) No significant growth difference between fungal strains was found over the pH range pH 4 to pH 11; 5) The colony growth rate of strain LYZ0109 was significantly (P<0.05) higher than that of LYZ0091 on NA, PCA, PDA, PSA and WHDA media for most growth measures; 6) No conidia were produced by any fungal strain in any of temperature, pH and media combinations tested; 7) Hyphae of LYZ0091 and LYZ0109 were waved, and seldom produced chlamydospores; hyphae of LYZ093 were straight with plentiful chlamydospores arranged as tree-like structures from the media bottom to the surface.

locoweed; endophyte; symbiont; strain; cultural characteristics

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2017-01-09；改回日期：2017-03-15

國家自然基金面上項目(31272496)，公益性行業(yè)(農業(yè))科研經費專項項目(201303057)和云南省高端科技人才引進項目(2012HA012)資助。

汪治剛(1993-)，男，甘肅天水人，在讀碩士。E-mail: wangzhg14@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail: liyzh@lzu.edu.cn