外源水楊酸對(duì)干旱脅迫下小冠花葉片活性氧水平及抗氧化系統(tǒng)的影響

馬樂元，陳年來，韓國君，李良，孫小妹

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

外源水楊酸對(duì)干旱脅迫下小冠花葉片活性氧水平及抗氧化系統(tǒng)的影響

馬樂元，陳年來*，韓國君，李良，孫小妹

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

本研究以小冠花幼苗葉片為材料，用0.25，0.5，1和2 mmol/L外源水楊酸(SA)對(duì)植株進(jìn)行葉面噴施，通過盆栽模擬干旱脅迫處理，測(cè)定幼苗葉片在連續(xù)干旱下膜脂過氧化指標(biāo)、抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量，研究外源水楊酸對(duì)干旱脅迫下小冠花幼苗活性氧水平及抗氧化系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，0.5～2.0 mmol/L的水楊酸顯著降低了干旱脅迫下小冠花葉片中超氧陰離子(O2-·)的產(chǎn)生速率、過氧化氫(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量及細(xì)胞膜透性，顯著提高了過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，提升了抗氧化指數(shù)，但對(duì)抗壞血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影響不顯著。在干旱脅迫第11天，1 mmol/L SA處理的小冠花葉片O2-·產(chǎn)生速率、MDA含量、細(xì)胞膜透性顯著低于干旱處理79.78%，34.42%，36.96%(P<0.05)；CAT酶活性顯著高于干旱處理2.45倍(P<0.05)；到干旱脅迫第 16天，SOD、POD酶活性比干旱處理提高了3.85和3.63倍。表明外源水楊酸能夠降低干旱脅迫下小冠花葉片的活性氧水平，提高小冠花葉片抗氧化能力，緩解干旱脅迫造成的細(xì)胞膜脂過氧化損傷，提高了小冠花的抗旱性，尤其以1 mmol/L水楊酸效果最佳。

水楊酸；小冠花；干旱脅迫；活性氧水平

干旱是影響植物生存和生長的主要非生物脅迫因子之一[1]。在正常條件下，植物體內(nèi)自由基的形成與清除保持一種動(dòng)態(tài)平衡，但受到干旱脅迫后，誘導(dǎo)體內(nèi)活性氧(包括O2-·、H2O2、·OH)大量積累[2]，導(dǎo)致這種平衡被破壞。干旱脅迫往往造成活性氧的過量積累，對(duì)植物造成氧化脅迫，導(dǎo)致以丙二醛(MDA)生成量為標(biāo)記的膜脂過氧化，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，促進(jìn)膜滲漏發(fā)生，導(dǎo)致膜功能改變，嚴(yán)重的還會(huì)進(jìn)一步引起一些關(guān)鍵蛋白和核酸的損傷，嚴(yán)重干擾正常的代謝活動(dòng)，并最終引起細(xì)胞及整個(gè)植株的死亡[3]。為有效防止活性氧(ROS)的氧化損傷，植物形成了一套有效的ROS清除機(jī)制，主要包括抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)兩類。其中酶系統(tǒng)主要包括：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等；非酶系統(tǒng)主要是一些相對(duì)分子質(zhì)量較小的活性氧清除有機(jī)物，包括：抗壞血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等。這些抗氧化酶和抗氧化物相互調(diào)節(jié)，能避免或減弱脅迫對(duì)植物造成的氧化傷害[4-6]。

鄰羥基苯甲酸，又稱水楊酸(salicylic acid，簡稱SA)，是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚類化合物，能作為信號(hào)分子參與植物體內(nèi)多種代謝調(diào)控，被認(rèn)為是一種新的植物激素[7-8]。大量研究表明，SA可誘導(dǎo)逆境相關(guān)蛋白的表達(dá)、激活植物超敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性，提高植物對(duì)重金屬鎘[9]、高溫[10]、鹽分[11]和干旱脅迫[12]的耐受能力。近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)SA可以提高干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum)[13]、蘋果(Maluspumila)[14]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[15]、毛竹(Phyllostachysedulis)[16]等植物細(xì)胞CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性和GSH、ASA等的含量，降低細(xì)胞活性氧水平。水楊酸還能夠降低干旱脅迫下番茄(Lycopersiconesculentum)葉片MDA積累和細(xì)胞膜透性，進(jìn)而增強(qiáng)其抗旱性[17]。

小冠花(Coronillavaria)為豆科小冠花屬多年生牧草，原產(chǎn)于歐洲和地中海地區(qū)[18]。其根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高，可作為飼草、綠化、水土保持、觀賞及綠肥植物等。我國于1973年將其作為新型牧草及水土保持作物首次引入陜西省[19]，之后在西北、華北等地區(qū)推廣種植，對(duì)發(fā)展當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和改善生態(tài)環(huán)境起到了重要作用。由于我國小冠花主要種植區(qū)域降雨少且分配不均，土壤水分缺乏[20]，對(duì)小冠花的生長和繁殖產(chǎn)生影響，因此研究提高小冠花抗旱性問題具有重要意義。

目前，關(guān)于小冠花的研究主要集中于栽培技術(shù)[21]、遺傳育種[22]等方面，而關(guān)于外源SA對(duì)干旱脅迫下小冠花活性氧清除的研究還未見報(bào)道。本研究以盆栽控水模擬干旱條件，用不同濃度的外源SA對(duì)干旱脅迫下小冠花幼苗進(jìn)行葉面噴施處理，測(cè)定小冠花葉片膜脂過氧化指標(biāo)、抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量，探討SA對(duì)干旱脅迫條件下小冠花抗氧化能力的影響和誘導(dǎo)小冠花耐旱響應(yīng)的生理機(jī)制，為合理利用水楊酸解決小冠花栽培中的干旱問題和培育抗旱小冠花品種提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

供試小冠花品種為綠寶石，由甘肅創(chuàng)綠草業(yè)科技有限公司提供，該品種抗逆性強(qiáng)，已在我國西北地區(qū)廣泛種植。試驗(yàn)于2015年5-8月在蘭州甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱區(qū)生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)室盆栽條件下進(jìn)行。所用塑料花盆上口徑直徑25 cm，下口徑直徑20 cm，高20 cm，每盆裝過3 mm篩的田園土4.5 kg。選取飽滿、大小一致的小冠花種子均勻播于塑料盆中，出苗后每盆保留5株，之后進(jìn)行常規(guī)管理，待幼苗平均株高長到20 cm左右時(shí)(8月1日)進(jìn)行干旱脅迫和SA處理。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置正常供水(CK)、逐步干旱(DS)和4個(gè)濃度(0.25, 0.5, 1和2 mmol/L)SA處理后逐步干旱(DS+SA0.25、DS+SA0.5、DS+SA1、DS+SA2)，共計(jì)6個(gè)處理，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)8盆。8月1日17: 00對(duì)SA處理統(tǒng)一葉面噴施4個(gè)濃度等量SA溶液[23-24]，對(duì)照和干旱處理用蒸餾水替代。自處理之日起，對(duì)干旱及水楊酸處理停止?jié)菜?，依靠自然蒸發(fā)形成逐步干旱處理的梯度。對(duì)照正常澆水，通過稱重法使土壤相對(duì)含水量始終保持在(75±3)%。參照Hsiao等[25]提出的水分脅迫梯度劃分標(biāo)準(zhǔn)，土壤相對(duì)含水量在55%～60%為輕度脅迫、40%～45%為中度脅迫、30%～35%為重度脅迫。干旱脅迫后，分別在第2、6、11、16 天和復(fù)水12 h后(實(shí)測(cè)土壤相對(duì)含水量分別為74.45%、60.12%、45.38%、32.44%和71.36%)采集測(cè)定樣本。采樣時(shí)間為早上7:00-8:00，隨機(jī)選擇植株頂部生長狀況基本一致的幼苗葉片用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)[26]。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1葉片O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響 O2-·產(chǎn)生速率測(cè)定：根據(jù)王愛國等[27]的方法略加修改，稱取0.2 g新鮮葉片，剪碎后混勻，加入2 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液(內(nèi)含1%的PVP-40，pH=7.8)，充分研磨，10000 r/min離心20 min，上清液定容至3 mL，提取液即為O2-·產(chǎn)生待測(cè)液。取0.5 mL待測(cè)液加入0.5 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.8)，1.5 mL 1 mmol/L的鹽酸羥胺混勻后在25 ℃下保溫60 min，再加入2 mL 17 mmol/L對(duì)氨基苯磺酸和2 mL 7 mmol/L 1-萘胺，混勻，于25 ℃下顯色20 min后測(cè)定波長530 nm的OD值。

H2O2含量測(cè)定：采用二甲酚橙法，按照 Jana等[28]的方法測(cè)定。

1.3.2葉片過氧化傷害程度 MDA含量測(cè)定：采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定[29]。細(xì)胞膜透性用DDS-11A型電導(dǎo)儀參照王關(guān)林等[30]的方法測(cè)定其電導(dǎo)率值。

抗氧化指數(shù)測(cè)定：取0.3 g新鮮葉片，剪碎，加入5 mL 80%乙醇溶液，用研缽研磨成勻漿，過濾，濾渣用5 mL 80%乙醇洗滌，過濾，合并濾液于225 mL容量瓶中，加塞，靜置20 min后可測(cè)定。采用β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液氧化法測(cè)定[29]。

1.3.3葉片抗氧化酶活性 超氧化物歧化酶(SOD)活性：取0.5 g新鮮葉片，置于研缽中，加入5 mL提取液(50 mmol/L磷酸緩沖液，內(nèi)含100 μmol/L EDTA，1% PVP，5 mmol/L DTT， pH 7.2)，冰浴研磨，勻漿在4000 r/min、4 ℃下離心20 min，上清液為酶提取液。SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定[29]，單位(U/g FW)。

過氧化氫酶(CAT)活性：取0.1 g新鮮葉片，加入5 mL 4 ℃下預(yù)冷的pH 7.8的磷酸緩沖溶液(內(nèi)含1% PVP)，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。置于4 ℃冰箱中靜置10 min，取5 mL上清液于4000 r/min離心15 min，上清液即為酶提取液。CAT活性采用紫外分光光度法測(cè)定[29]，單位[U/(g FW·min)]。

過氧化物酶(POD)活性：取0.5 g新鮮葉片，加入10 mL 20 mmol/L KH2PO4，于研缽中研磨成勻漿，3000 r/min離心15 min，上清液即為酶提取液。POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定[29]，單位[U/(g FW·min)]。

1.3.4抗氧化物質(zhì)含量 抗壞血酸(ASA)含量采用二甲苯萃取比色法測(cè)定[31]。谷胱甘肽(GSH)含量采用分光光度法測(cè)定[29]。

1.4數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 使用最小顯著差異法(least significant difference, LSD)在0.05顯著性水平進(jìn)行差異顯著性分析，利用Excel 2007軟件作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1葉片O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

2.1.1O2-·產(chǎn)生速率 試驗(yàn)期間，對(duì)照小冠花葉片的O2-·產(chǎn)生速率基本穩(wěn)定在0.5～0.6 nmol/(g FW·min)(圖1)。干旱脅迫處理的葉片O2-·產(chǎn)生速率在第6天開始急速上升，于脅迫處理的第 11天達(dá)到最大值1.78 nmol/(g FW·min)，顯著高于對(duì)照和4個(gè)濃度SA處理(P<0.05)，之后下降；SA處理的小冠花，葉片O2-·產(chǎn)生速率在脅迫第2天顯著高于干旱處理和對(duì)照(P<0.05)，隨后開始降低。脅迫處理第11天，4個(gè)濃度SA處理的葉片O2-·產(chǎn)生速率均顯著低于干旱處理(P<0.05)，分別比干旱低23.60%(DS+SA0.25)、65.17%(DS+SA0.5)、79.78%(DS+SA1)和83.15%(DS+SA2)，其中0.25 mmol/L SA處理顯著高于對(duì)照(P<0.05)。在脅迫第16天，2 mmol/L SA處理與對(duì)照無差異但顯著低于干旱處理(P<0.05)，其他SA處理與干旱處理無顯著差異(P>0.05)。復(fù)水12 h后，各處理O2-·的產(chǎn)生速率均恢復(fù)至較低水平，但干旱處理仍顯著高于其他處理(P<0.05)。

2.1.2H2O2含量 干旱處理下小冠花葉片H2O2含量在第6天開始迅速上升(圖2)。處理第16天達(dá)到最大值18.89 nmol/g FW，顯著高于對(duì)照(P<0.05)；干旱脅迫第2天，4個(gè)濃度SA處理H2O2含量均顯著高于干旱處理和對(duì)照(P<0.05)，隨后開始降低，脅迫處理第6天，4個(gè)濃度SA處理的葉片H2O2含量分別比干旱低31.73%(DS+SA0.25)、33.24%(DS+SA0.5)、53.69%(DS+SA1)和56.80%(DS+SA2)。脅迫第16天，1 mmol/L和2 mmol/L SA處理后的小冠花葉片H2O2含量分別為8.50和6.86 nmol/g FW，較干旱處理減少了55.00%和63.68%。復(fù)水12 h后，各處理的H2O2含量均恢復(fù)至較低水平，但干旱和0.25 mmol/L SA處理仍顯著高于其他處理(P<0.05)，0.5和1.0 mmol/L SA處理的與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)，2 mmol/L SA 處理顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

圖1 干旱脅迫下外源水楊酸處理小冠花葉片O2-·產(chǎn)生速率Fig.1 Effects of exogenous salicylic acid on O2-· production rate in the seedling leaves of Coronilla varia under drought stress

圖2 干旱脅迫下外源水楊酸處理小冠花葉片H2O2含量Fig.2 Effects of exogenous salicylic acid on H2O2 content in the seedling leaves of Coronilla varia under drought stress

相同處理天數(shù)中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。The different letters in the same treatment time mean significant difference atP<0.05.2，6，11，16 d表示干旱脅迫的天數(shù)，RW12h表示干旱脅迫后復(fù)水12 h。下同。2, 6, 11 and 16 d indicate days of drought stress, RW12h indicates 12 hours of rewatering after drought stress. The same below．

2.2葉片過氧化傷害程度

2.2.1MDA含量 干旱處理下小冠花葉片MDA含量逐漸升高，在脅迫第6、11、16天MDA含量分別比對(duì)照高了76.62%、58.69%和250.19%(圖3A)。干旱脅迫第6天，4個(gè)濃度SA處理均顯著高于對(duì)照但顯著低于干旱處理(P<0.05)，處理第16天，4個(gè)濃度SA處理的葉片MDA含量分別為34.41 μmol/g FW (DS+SA0.25)、32.48 μmol/g FW (DS+SA0.5)、32.42 μmol/g FW (DS+SA1)和28.99 μmol/g FW (DS+SA2)，分別顯著(P<0.05)比干旱處理低7.99%(DS+SA0.25)、13.16%(DS+SA0.5)、13.32%(DS+SA1)和22.49%(DS+SA2)。復(fù)水12 h后，各處理的MDA含量均恢復(fù)至較低水平且與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2細(xì)胞膜相對(duì)透性 隨干旱脅迫的持續(xù)，干旱處理和SA處理下的小冠花葉片細(xì)胞膜透性均逐漸升高，在脅迫第6、11、16天干旱處理小冠花葉片細(xì)胞膜透性分別比對(duì)照高了81.82%、253.85%和229.41%(圖3B)。在第11天，SA處理下的小冠花葉片細(xì)胞膜透性分別為38.72%(DS+SA0.25)、37.28%(DS+SA0.5)、28.92%(DS+SA1)和35.65%(DS+SA2),均顯著低于干旱脅迫(P<0.05)；第16天，4個(gè)濃度SA處理的葉片細(xì)胞膜透性顯著低于干旱處理，分別比干旱處理低了14.29%(DS+SA0.25)、16.07%(DS+SA0.5)、32.14%(DS+SA1)和17.86%(DS+SA2)，但仍顯著高于對(duì)照(P<0.05)。復(fù)水12 h后，各處理細(xì)胞膜透性降至較低水平，但干旱處理仍顯著高于其他處理，4個(gè)濃度SA處理間無顯著差異但顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

2.2.3抗氧化指數(shù) 試驗(yàn)中，對(duì)照小冠花葉片的抗氧化指數(shù)基本穩(wěn)定在0.5～0.6之間(圖3C)；干旱脅迫處理的葉片抗氧化指數(shù)在第6天開始急速上升，第 11天達(dá)到最大值1.06，顯著高于對(duì)照(P<0.05)，之后下降，第16天僅為0.34。說明重度干旱脅迫下小冠花抗氧化能力減弱；SA處理的小冠花抗氧化指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；在脅迫第2天顯著高于干旱處理和對(duì)照(P<0.05)，之后開始降低，第16天4個(gè)濃度SA處理的葉片抗氧化指數(shù)分別高于干旱處理3.50(DS+SA0.25)、3.47(DS+SA0.5)、3.85(DS+SA1)和3.26(DS+SA2)倍，但SA各處理間差異并不顯著。復(fù)水12 h后，各處理抗氧化指數(shù)繼續(xù)升高，其中，0.25 mmol/L SA處理顯著高于干旱處理(P<0.05)，其他SA處理與干旱處理無顯著差異(P>0.05)。

2.3葉片抗氧化酶活性變化

2.3.1SOD活性 干旱處理小冠花葉片SOD酶活性于脅迫處理的第6天開始急速上升(圖4A)，第 11天達(dá)到最大值698.14 U/g FW,顯著高于對(duì)照64.62%(P<0.05)，之后下降，第16天僅為314.02 U/g FW，顯著低于對(duì)照(P<0.05)；干旱脅迫第2天，4個(gè)濃度SA處理下SOD酶活性均顯著高于干旱處理和對(duì)照(P<0.05)，隨后開始緩慢上升，第11天SA處理均顯著低于干旱處理(P<0.05)；第16天0.5 mmol/L及以上濃度的SA處理的小冠花葉片SOD活性分別達(dá)到653.61 U/g FW(DS+SA0.5)、834.13 U/g FW(DS+SA1)、641.01 U/g FW(DS+SA2)，比對(duì)照顯著高了49.43%(DS+SA0.5)、90.85%(DS+SA1)和46.68%(DS+SA2)(P<0.05)，干旱和0.25 mmol/L SA處理顯著低于對(duì)照(P<0.05)。復(fù)水后2 mmol/L SA處理顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其他SA處理與對(duì)照和干旱處理無顯著差異(P>0.05)。

2.3.2CAT活性 干旱脅迫下小冠花葉片CAT酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖4B)，干旱處理第6天小冠花葉片CAT酶活性達(dá)到15.87 U/(g FW·min)，比對(duì)照增加了88.25%，隨后開始降低，脅迫處理第16天，葉片CAT酶活性為3.96 U/(g FW·min)，比對(duì)照低了50.13%；在脅迫第2天，2 mmol/L SA處理小冠花葉片CAT酶活性與對(duì)照和干旱處理無顯著差異(P>0.05)，其他SA處理均顯著低于對(duì)照和干旱處理；脅迫第11天，4個(gè)濃度SA處理的小冠花葉片CAT活性顯著高于干旱處理91.94%(DS+SA0.25)、82.08%(DS+SA0.5)、144.98%(DS+SA1)和217.20%(DS+SA2)(P<0.05)，之后開始降低，脅迫處理第16天，4個(gè)濃度SA處理的葉片CAT活性顯著(P<0.05)低于對(duì)照，分別比對(duì)照低65.24%(DS+SA0.25)、43.45%(DS+SA0.5)、46.47%(DS+SA1)和37.41%(DS+SA2)，4個(gè)濃度SA處理與干旱處理無顯著差異(P>0.05)。復(fù)水后，各處理下的小冠花CAT活性恢復(fù)，0.25 mmol/L SA處理與干旱處理仍顯著高于對(duì)照和其他SA處理(P<0.05)。

2.3.3POD活性 對(duì)照小冠花葉片的POD酶活性基本穩(wěn)定在25.00 U/(g FW·min)左右(圖4C)；干旱脅迫下，葉片POD酶活性于第2天開始急速上升至第11天達(dá)到最大值41.34 U/(g FW·min),顯著高于對(duì)照63.65%(P<0.05)；SA處理的小冠花葉片POD酶活性先升高后降低，在脅迫第6天顯著低于干旱處理(P<0.05)，脅迫處理第11天， SA處理小冠花的葉片POD酶活性與干旱處理無顯著差異(P>0.05)。在干旱脅迫第16天，各處理POD酶活性均下降，其中干旱處理和0.25 mmol/L SA處理小冠花葉片POD酶活性僅為7～10 U/(g FW·min)，顯著低于對(duì)照(P<0.05)；其他SA處理小冠花的葉片POD酶活性顯著高于干旱處理(P<0.05)，分別是干旱的3.77(DS+SA0.5)、2.63(DS+SA1)和1.14(DS+SA2)倍。復(fù)水12 h后，干旱和4個(gè)濃度SA處理下的小冠花POD活性恢復(fù)至對(duì)照水平，各處理間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 干旱脅迫下外源水楊酸處理小冠花葉片 SOD (A)、CAT (B)、POD (C)活性的影響Fig.4 Effects of exogenous salicylic acid on SOD (A), CAT (B) and POD (C) activities in the seedling leaves of C. varia under drought stress

2.4抗氧化物質(zhì)含量

2.4.1抗壞血酸含量 隨干旱脅迫程度的加劇，小冠花葉片抗壞血酸含量逐漸升高。在脅迫第6、11、16天干旱處理小冠花葉片ASA含量分別比對(duì)照高61.79%、56.49%和71.56%(圖5)。脅迫第2天4個(gè)濃度SA處理的小冠花葉片ASA含量顯著高于對(duì)照和干旱處理(P<0.05)；脅迫第6天后，SA處理與干旱處理無顯著差異(P>0.05)。復(fù)水12 h后，各處理ASA含量降低但仍顯著大于對(duì)照(P<0.05)，0.25和2 mmol/L SA處理與干旱處理無差異，0.5和1 mmol/L SA處理顯著低于干旱處理11.56%和9.25%(P<0.05)。

2.4.2谷胱甘肽含量 試驗(yàn)期間，對(duì)照小冠花葉片的谷胱甘肽含量基本穩(wěn)定在500～600 μmol/g FW(圖6)。但干旱處理和SA處理小冠花葉片GSH含量均持續(xù)下降，在干旱脅迫第2天和第6天，1和2 mmol/L SA處理顯著低于干旱處理(P<0.05)。脅迫處理第16天，SA處理下的小冠花葉片GSH含量顯著低于對(duì)照91.51%(DS+SA0.25)、88.13%(DS+SA0.5)、84.54%(DS+SA1)和90.11%(DS+SA2)(P<0.05)；SA處理與干旱處理無差異(P>0.05)。復(fù)水12 h后，各處理GSH含量有所回升，但均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。

圖5 干旱脅迫下外源水楊酸處理小冠花葉片抗壞血酸含量Fig.5 Effects of exogenous salicylic acid on ASA content in the seedling leaves of C. varia under drought stress

圖6 干旱脅迫下外源水楊酸處理小冠花葉片谷胱甘肽含量Fig.6 Effects of exogenous salicylic acid on GSH content in the seedling leaves of C. varia under drought stress

3 討論

3.1SA對(duì)小冠花活性氧水平的影響

植物在正常的生長條件下，體內(nèi)活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，一般不會(huì)導(dǎo)致植物受到傷害[32]。但當(dāng)植物受外界環(huán)境脅迫傷害后，細(xì)胞膜受到破壞，膜透性增大，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(·OH、O2-·、H2O2等)[33]。劉艷等[8,34]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫增強(qiáng)，幼苗O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量上升。在本研究中，在干旱脅迫的第11天(土壤相對(duì)含水量為45.38%)，小冠花葉片O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著高于對(duì)照，表明小冠花葉片細(xì)胞內(nèi)積累了過量活性氧，導(dǎo)致活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡被打破，受到了干旱脅迫的傷害。在玉米(Zeamays)[35]、黃瓜(Cucumissativus)[36]的研究中均發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫初期施加SA可以有效提高H2O2含量，但在脅迫末期經(jīng)SA處理的H2O2含量顯著低于干旱處理。在本研究中，經(jīng)SA處理的小冠花葉片，在干旱脅迫的第2天顯著高于對(duì)照和干旱處理，在脅迫第11天時(shí)，經(jīng)1和2 mmol/L SA處理的小冠花葉片，H2O2含量相比干旱處理低了21.19%和47.76%。

3.2SA對(duì)小冠花葉片膜脂過氧化傷害的影響

當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基迅速積累，引起細(xì)胞膜過氧化，MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，它的增加表明膜脂過氧化的程度加重，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂破壞，電解質(zhì)外滲，使外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率增加[37]，表明細(xì)胞受到了損傷。在本研究中，隨著活性氧的迅速積累，小冠花MDA含量和細(xì)胞膜透性開始增加，在脅迫第16天(土壤相對(duì)含水量為32.44%)時(shí)達(dá)到37.40 μmol/g FW和55.96%，均顯著高于對(duì)照，這與井大煒等[38]對(duì)楊樹(Populus)幼苗的研究結(jié)果一致。經(jīng)1 mmol/L SA處理的小冠花葉片MDA含量和細(xì)胞膜透性均顯著低于干旱處理，這與陸曉民等[39]用0.5 mmol/L SA顯著降低了毛豆(Glycinemax)葉片MDA含量和細(xì)胞膜透性的結(jié)果相一致。表明干旱脅迫顯著增加了葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的含量，而 SA 處理能降低干旱脅迫下小冠花葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，緩解膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，對(duì)葉片膜結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用?？寡趸笖?shù)表示植物抗氧化能力的大小，根據(jù)郭鸰等[40]和田迪英等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化指數(shù)越高，植物的抗氧化能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)中，SA處理的小冠花葉片抗氧化指數(shù)在脅迫第16天(土壤相對(duì)含水量為32.44%)時(shí)均顯著高于干旱處理，其中1 mmol/L SA處理的小冠花葉片抗氧化指數(shù)比干旱處理增加了2.85倍。表明適宜濃度的SA處理，可以提高干旱脅迫下小冠花葉片抗氧化指數(shù)，從而降低干旱脅迫對(duì)小冠花幼苗造成的傷害。

3.3SA對(duì)小冠花葉片抗氧化酶活性的影響

植物為保護(hù)自身免受活性氧的傷害，在長期的進(jìn)化過程中演化出了一套適應(yīng)機(jī)制和策略，主要包括CAT、POD、SOD等抗氧化酶類和ASA-GSH循環(huán)系統(tǒng)，抗氧化酶類可以通過清除自由基，保護(hù)膜系統(tǒng)，避免植物受到脅迫傷害[42]。SOD，POD和CAT組成抗氧化防御系統(tǒng)，SOD催化O2-·和H2O2發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2-·和H2O，再由POD和CAT分解去除，降低體內(nèi)自由基含量，從而減輕對(duì)膜脂的過氧化[43]。在以鳳仙花(Impatiensbalsamina)[44]、苜蓿(Medicagosativa)[26]、玉米[35]等為試材的研究中發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫初期葉片噴施SA后降低了CAT活性，使細(xì)胞內(nèi)活性氧含量適度增加，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性的相關(guān)基因表達(dá)，之后 POD、CAT和 SOD 活性顯著升高，它們共同作用降低細(xì)胞內(nèi)過氧化物含量，減輕脅迫傷害。在本試驗(yàn)中，小冠花葉片CAT活性在脅迫第2天顯著低于對(duì)照和干旱脅迫，之后隨持續(xù)干旱CAT、POD、SOD活性上升至重度脅迫后下降，其中以0.5和1 mmol/L SA的效果最佳，這與孔德政等[45]對(duì)不同品種菊花(Chrysanthemummorifolium)的研究結(jié)果一致。說明適宜濃度SA可以提高酶活性，崔秀妹等[46]在對(duì)扁蓿豆(Melilotoidesruthenica)的研究中也得到了相同的結(jié)果。

3.4SA對(duì)小冠花葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響

SA 作為信號(hào)分子，可以激活多種與脅迫反應(yīng)有關(guān)的基因啟動(dòng)子，并且通過調(diào)節(jié)活性氧、抗氧化酶及非酶促抗氧化體系而提高植物的抗逆性[47]。抗壞血酸和谷胱甘肽是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，可直接清除植物體內(nèi)過量的自由基，從而增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗能力[48]。在本研究中，SA處理對(duì)小冠花葉片抗壞血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影響不顯著，這與周萬海等[26]對(duì)苜蓿的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究表明，在干旱脅迫下對(duì)小冠花進(jìn)行一定濃度的水楊酸處理，可以提高小冠花葉片抗氧化能力，降低小冠花葉片活性氧積累，抑制膜脂過氧化，減輕干旱脅迫對(duì)小冠花生長的危害。綜合不同濃度SA在干旱脅迫下對(duì)小冠花各指標(biāo)影響的分析，本試驗(yàn)認(rèn)為，在小冠花生產(chǎn)中，如遇干旱脅迫，可考慮噴施1 mmol/L SA以起到減輕傷害、降低生產(chǎn)損失的作用。但是，SA 緩解干旱脅迫是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步研究探討。

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ProtectiveeffectofsalicylicacidonreactiveoxygenlevelsandantioxidantsystemofCoronillavariaseedlingsunderdroughtstress

MA Le-Yuan, CHEN Nian-Lai*, HAN Guo-Jun, LI Liang, SUN Xiao-Mei

CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

The aim of these experiments was to determine whether exogenous salicylic acid (SA) could protectCoronillavariaseedlings against drought stress. Leaves ofC.variaseedlings grown in pots were sprayed with salicylic acid at four concentrations (0.25, 0.5, 1 and 2 mmol/L) and then the membrane lipid peroxide index, antioxidant enzyme activity, and the contents of non-enzymatic antioxidants in seedling leaves were determined during a drought stress treatment. At concentrations of 0.5-2.0 mmol/L, SA decreased the superoxide anion (O2-·) production rate, hydrogen peroxide (H2O2) content, malondialdehyde (MDA) content, and cell membrane permeability, and increased the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD), which increased the antioxidant index capacity. However, at concentrations of 0.5-2.0 mmol/L, SA did not affect the ascorbate acid (ASA) and glutathione (GSH) contents in seedling leaves. At 11 days of drought stress, the O2-·production rate, MDA content, and cell membrane permeability were 79.78%, 34.42%, and 36.96% lower, respectively, and CAT activity was 2.45-fold higher in seedlings treated with 0.5 mmol/L SA than in untreated seedlings (P<0.05). At 16 days of drought stress, the SOD and POD activities were 3.85-fold and 3.63-fold higher, respectively, in seedlings treated with 0.5 mmol/L SA than in untreated seedlings. These results demonstrated that exogenous SA could improve the drought resistance ofC.variaby reducing reactive oxygen levels under drought stress, increasing the activity of the antioxidant system, and alleviating oxidation damage to cell membranes resulting from drought-induced membrane lipid peroxidation. The most effective concentration of SA was 1 mmol/L.

salicylic acid;Coronillavaria; drought stress; reactive oxygen species (ROS) level

10.11686/cyxb2017134http//cyxb.lzu.edu.cn

馬樂元, 陳年來, 韓國君, 李良, 孫小妹. 外源水楊酸對(duì)干旱脅迫下小冠花葉片活性氧水平及抗氧化系統(tǒng)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(10): 129-139.

MA Le-Yuan, CHEN Nian-Lai, HAN Guo-Jun, LI Liang, SUN Xiao-Mei. Protective effect of salicylic acid on reactive oxygen levels and antioxidant system ofCoronillavariaseedlings under drought stress. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(10): 129-139.

2017-03-21；改回日期：2017-05-05

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金“鹽，旱脅迫及其交叉脅迫下牧草小冠花生長及滲透調(diào)節(jié)的研究”(GSAU-STS-1332)和甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目“根系分區(qū)交替灌溉作物的光合生理特性及節(jié)水效應(yīng)研究”(2015A-076)資助。

馬樂元(1984-)，男，甘肅武威人，在讀博士。E-mail：119256800@gsau.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail: chennl@gsau.edu.cn