發(fā)酵法生產(chǎn)十二碳二元酸的高效菌株復(fù)合篩選的研究

姚嘉旻 盧利玲

【摘要】選取現(xiàn)有保藏菌株作為實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株，利用兩步濃縮法篩選α，ω?氧化性強(qiáng)、β?氧化性弱的酵母菌優(yōu)勢(shì)菌株。經(jīng)發(fā)酵罐驗(yàn)證，發(fā)酵155h產(chǎn)酸約180克/升，達(dá)到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)菌株的目的，增加二元酸項(xiàng)目的競(jìng)爭(zhēng)力及應(yīng)變能力。

【關(guān)鍵詞】十二碳二元酸；復(fù)合誘變；顯色篩選

本課題針對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸工藝的研究進(jìn)展及其現(xiàn)狀，通過系列誘變篩選來(lái)挑選出烷烴轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸性能更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株，為發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸高效菌株的篩選提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

1.出發(fā)菌種：經(jīng)初步產(chǎn)酸評(píng)價(jià)后，初步確定6株保藏菌株作為誘變育種出發(fā)菌株。

2.試劑

糖蜜，尿素，酵母膏，均為工業(yè)級(jí)。

3.培養(yǎng)基

（1）篩選培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基成分。（2）基礎(chǔ)上有所改變，如下：蔗糖碳源培養(yǎng)基、烷烴碳源培養(yǎng)基；顯色培養(yǎng)基。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：成分與種子培養(yǎng)基一致，烷烴量根據(jù)實(shí)際要求足量添加。

（二）方法

1.分析方法

（1）產(chǎn)酸量。搖瓶發(fā)酵、破乳抽提，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液標(biāo)定二元酸產(chǎn)酸含量。（2）二元酸成分同。（3）提純長(zhǎng)鏈二元酸產(chǎn)品，干燥后經(jīng)氣相色譜分析測(cè)定二元酸成分。

2.初篩程序

出發(fā)菌株→篩選培養(yǎng)基（初篩A）→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基（初篩B）→初篩菌株→初篩產(chǎn)酸驗(yàn)證。

3.復(fù)篩程序

初篩菌株→物理化學(xué)誘變→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基（復(fù)篩A）→秋水仙堿產(chǎn)酸培養(yǎng)基→鉻酸鉀產(chǎn)酸培養(yǎng)基（復(fù)篩濃縮B）→復(fù)篩優(yōu)勢(shì)菌株。

二、結(jié)果與討論

（一）復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.紫外誘變

圖1分析，熱帶假絲酵母菌的紫外誘變致死率與照射時(shí)間呈正相關(guān)性；同時(shí)，紫外誘變的正突變率隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)而后降低的變化趨勢(shì)，選擇紫外誘變照射時(shí)間為150秒較適宜，其對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為88%、40%.

2.超聲波誘變

誘變時(shí)長(zhǎng)為12min時(shí)，對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為94%、45%，而誘變時(shí)長(zhǎng)為15min時(shí)，對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為99%、48%，選擇誘變時(shí)間為12min更為適宜。再經(jīng)兩步濃縮法獲得誘變正突變菌株56株。

（三）產(chǎn)酸驗(yàn)證

1.搖瓶產(chǎn)酸驗(yàn)證

出發(fā)菌株QJ-EY09初始產(chǎn)酸水平僅為75g/L，經(jīng)復(fù)合誘變篩選流程，突變菌株最高產(chǎn)酸水平約185g/L，產(chǎn)酸水平是出發(fā)菌株的2.4倍。

2.發(fā)酵罐產(chǎn)酸驗(yàn)證

選擇搖瓶產(chǎn)酸對(duì)應(yīng)烷烴轉(zhuǎn)化率較高的誘變菌株，經(jīng)發(fā)酵罐放大驗(yàn)證：發(fā)酵周期為140h時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸水平為185g/L，達(dá)到既定篩選優(yōu)勢(shì)菌株效果。

三、討論

選取生產(chǎn)保藏菌株QJ-EY09作為誘變育種出發(fā)菌株，合理制定紫外-超聲波誘變方法，復(fù)篩出正突變菌株；利用兩步濃縮法及顯色平板篩分，獲得α，ω-氧化增強(qiáng)、β-氧化減弱的誘變突變株56株；經(jīng)發(fā)酵罐驗(yàn)證，發(fā)酵140h產(chǎn)酸185克/升，達(dá)到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)菌株的目的。

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作者簡(jiǎn)介：姚嘉旻（1981—），男，江蘇淮安人，研究方向：石油產(chǎn)品相關(guān)的發(fā)酵工程及分離工程。