基于Meta分析的國內(nèi)魚、鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因研究

牛志偉，呂小麗，黃 鈞*，韓書煜，黎姍梅，梁靜真，韋慕蘭，鄧小紅

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧 530005；2. 陸川縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 陸川 537700；3. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530021；4. 都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 都安 530700；5. 全州縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 全州 541500)

基于Meta分析的國內(nèi)魚、鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因研究

牛志偉1，呂小麗2，黃 鈞1*，韓書煜3，黎姍梅3，梁靜真1，韋慕蘭4，鄧小紅5

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧 530005；2. 陸川縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 陸川 537700；3. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530021；4. 都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 都安 530700；5. 全州縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 全州 541500)

通過借鑒Meta分析法分析中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(CNKI)中有關(guān)魚源、鱉源嗜水氣單胞菌的7種毒力基因的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，探討魚源、鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因的分布特點及為研制嗜水氣單胞菌多價DNA疫苗提供候選基因。分析結(jié)果表明：嗜水氣單胞菌毒力基因的分布受養(yǎng)殖對象的種類和生長環(huán)境影響；南方和北方地區(qū)魚源嗜水氣單胞菌以毒力基因astA、altA、aerA和hlyA分布較為廣泛，南方地區(qū)鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因hlyA、actA和aerA分布均較為廣泛，可分別作為制備魚源和鱉源嗜水氣單胞菌多價DNA疫苗候選基因。

嗜水氣單胞菌；魚源；鱉源； 毒力基因；Meta分析；DNA疫苗；

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于氣單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，是革蘭氏陰性短桿菌，廣泛分布在各種水體中，容易導(dǎo)致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖對象患病，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的致病性和攜帶的毒力基因密切相關(guān)：朱大玲等[1]通過比較基因檢測的結(jié)果與嗜水氣單胞菌對鯽魚的致病性，發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶(ahpA)陽性的嗜水氣單胞菌皆為毒力菌株；付巧芳[2]通過比較嗜水氣單胞菌毒力基因的分布情況及其對異育銀鯽的致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣溶素(aerA)、絲氨酸蛋白酶(ahpA)基因為嗜水氣單胞菌致病的主要毒力因子。國內(nèi)研究與致病性相關(guān)的毒力基因主要有氣溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、細(xì)胞性腸毒素(actA)、粘附素(ahaI)、熱敏感腸毒素(altA)、絲氨酸蛋白酶(ahpA)、金屬蛋白酶(astA)7種，有關(guān)嗜水氣單胞菌攜帶不同毒力基因?qū)λa(chǎn)動物致病力的影響且將上述基因全部同時檢測的研究目前尚未見報道[3]。

DNA疫苗是將編碼特異性抗原多肽或蛋白的基因構(gòu)建在含有調(diào)控元件的表達(dá)性DNA質(zhì)粒中,可直接導(dǎo)入機(jī)體并在機(jī)體內(nèi)表達(dá)目的抗原多肽或蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對目的蛋白的免疫應(yīng)答以達(dá)到預(yù)防和治療的目的[4]。其優(yōu)點是易于構(gòu)建、穩(wěn)定性好、便于儲存,且能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫[5]，目前，國內(nèi)對嗜水氣單胞菌DNA疫苗的研究比較少，朱大玲[6]構(gòu)建了氣溶素APT區(qū)域的DNA疫苗，但是免疫效果不明顯，其他研究集中在鑒定具有免疫原性的蛋白。目前鑒定出具有免疫原性的蛋白基因有氣溶素基因[7](aerA)、溶血素基因[7-8](hlyA) 熱敏感絲氨酸蛋白酶[8](ahpA)、細(xì)胞性毒腸毒素[9](actA)、金屬蛋白酶[9](astA)、熱敏感腸毒素[9](altA)、粘附素基因[10](ahaI)、胞外蛋白[11](OMP)、鞭毛蛋白FlaB基因[12]等。

通過借鑒Meta分析的方法，搜集前人研究嗜水氣單胞菌毒力基因的相關(guān)文獻(xiàn)，提取并分析數(shù)據(jù)，以期找到魚源、鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因在我國南北地區(qū)(以淮河劃分)以及不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之間的分布差異，為研制嗜水氣單胞菌DNA疫苗提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)的檢索

利用中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(CNKI)進(jìn)行水產(chǎn)和漁業(yè)科學(xué)領(lǐng)域相關(guān)文獻(xiàn)檢索，使用的3種檢索策略分別為：①嗜水氣單胞菌*(氣溶素+溶血素+細(xì)胞興奮性腸毒素+粘附素+細(xì)胞性腸毒素+胞外蛋白酶+抗金屬蛋白酶)；②嗜水氣單胞菌*(aerA+hlyA+actA+ahaI+altA+ahpA+astA)；③嗜水氣單胞菌*(毒力基因+毒力因子)。檢索文獻(xiàn)發(fā)表的時間范圍為建庫至2016年10月。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象為嗜水氣單胞菌的毒力基因；②菌株來源地區(qū)詳細(xì)(能區(qū)分來自南方或者北方)；③菌株源自養(yǎng)殖對象類別詳細(xì)(能區(qū)分來自魚、鱉、蛙等)；④研究菌株樣本量≥3株；⑤毒力基因檢測方法為PCR子檢測；⑥細(xì)菌鑒定方法為生化鑒定和分子鑒定結(jié)合。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表或者同一作者，同一研究課題組在相同年度發(fā)表的相似研究；②地區(qū)描述不能區(qū)分南北地區(qū)；③菌株來自多種養(yǎng)殖對象，但沒說明具體來自那種養(yǎng)殖對象；④毒力基因源于不同屬的菌株，沒有說明毒力基因具體來源菌株；⑤研究菌株樣本量<3株；⑥比較不同方法檢測毒力基因差異的研究；⑦數(shù)據(jù)不詳?shù)臅h文件。

1.3 文獻(xiàn)的篩選和提取資料

由2名科研人員根據(jù)上述的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，分別獨立進(jìn)行篩選和提取，在提取過程中遇到爭議，則用討論法決定是否提取數(shù)據(jù)。提取的主要數(shù)據(jù)包括：作者、題目、毒力基因名稱、地區(qū)和檢出數(shù)量等數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007和SPSS.18等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，通過卡方分析法分析不同來源(相同地區(qū)不同宿主或相同宿主不同地區(qū))菌株毒力基因攜帶率的差異。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果Fig.1 Screening process and result of literature

2 結(jié)果與分析

2.1 納入文獻(xiàn)結(jié)果

共檢索到454篇文獻(xiàn)，排除重復(fù)發(fā)表或重復(fù)下載的文獻(xiàn)148篇，閱讀題目摘要排除218篇，閱讀全文排除文獻(xiàn)57篇(圖1)，最終納入8個鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因研究(來源均為南方地區(qū))，25個魚源嗜水氣單胞菌毒力基因研究(南方17個，北方8個)共31篇文獻(xiàn)33個研究(表1)數(shù)據(jù)來源見表2。

表1 納入的毒力基因研究文獻(xiàn)

注：“—”表示該研究未檢測此毒力基因，若菌株來源為作者所在實驗室，則視實驗室所在地區(qū)為菌株來源地區(qū)。

Note: ‘—’,indicated that virulence genes was not detected, If the strain from the author's laboratory, depending on the area of author's laboratory as the strain source region.

表2 數(shù)據(jù)來源

表3 魚源毒力基因檢出情況及卡方分析

注：“*”代表差異顯著,”**”代表差異極其顯著，P<0.0001時記為0.000，下同。

Note: ‘*’Indicated significant difference, ‘**’ Indicated difference is extremely significant,P<0.0001 denoted asP=0.000, The same as below.

表4 淮河南魚源和鱉源毒力基因分布情況及卡方分析

2.2 魚源嗜水氣單胞菌毒力基因分布情況

計算納入研究數(shù)據(jù)的毒力基因檢出率結(jié)果(表3)顯示，南方地區(qū)嗜水氣單胞菌7種毒力基因分布以astA為主，檢出率為88.24 %；altA次之(81.05 %)；ahaI最少(36.05 %)；aerA、actA、hlyA和ahpA檢出率分別為77.11 %、71.01 %、55.49 %和38.50 %。北方地區(qū)也以astA為主，檢出率為100 %；altA次之(93.55 %)；actA最少(36.84 %)；hlyA、ahpA、aerA和ahaI檢出率分別為：73.65 %，72.48 %，68.56 %和50.53 %?？ǚ椒治霰砻?，在南方和北方地區(qū)之間，毒力基因aerA檢出結(jié)果差異達(dá)顯著水平；hlyA、actA和ahpA達(dá)極顯著水平，ahaI、altA和astA差異不顯著。

2.3 鱉源毒力基因分布情況及與魚源毒力基因檢出情況比較分析

從鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因分布情況可以看出(表4)，鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因以hlyA為主，檢出率為96.05 %；actA次之(91.80 %)；ahaI最低(76.39 %)；aerA、altA和aphA檢出率分別為89.47 %，81.25 %和76.92 %。南方鱉源和魚源之間，嗜水氣單胞菌毒力基因aerA檢出結(jié)果差異達(dá)顯著水平、hlyA、actA、ahaI和ahpA檢出結(jié)果差異均達(dá)極顯著水平，altA檢出結(jié)果差異不顯著。

3 討 論

不同的毒力基因具有不同的主要功能，動物被大量致病性嗜水氣單胞菌感染時，腸內(nèi)腸毒素含量急速上升，且與細(xì)胞發(fā)生不可逆的結(jié)合，使體液嚴(yán)重?fù)p失，最終導(dǎo)致宿主死亡[13]?？菇饘俚鞍酌缚芍苯悠茐乃拗鹘M織獲取營養(yǎng)導(dǎo)致致宿主死亡[14]。細(xì)菌病原的感染是一個復(fù)雜的、動態(tài)的多因子作用過程,它要求病原菌眾多毒力基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)一致,并能與宿主的免疫系統(tǒng)一同進(jìn)化，在大多數(shù)情況下,病原菌會根據(jù)感染部位所遇到的環(huán)境隨時調(diào)整各毒力基因的表達(dá)[15]。

疫情發(fā)生與宿主動物帶菌率高且菌株毒力基因陽性率高有密切關(guān)系[16]。本研究對在前人的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)致病魚源嗜水氣單胞菌毒力基因檢出率較高的毒力基因是altA和astA，并且差異不顯著，說明altA和astA可能是魚源嗜水氣單胞菌最基本的毒力基因或者大多嗜水氣單胞菌在致病過程中依靠astA獲取營養(yǎng)，且侵害部位主要是腸道。其余4種毒力基因aerA、actA、hlyA、ahpA的檢出率在不同地區(qū)分布差異顯著，說明這4種毒力基因分布或在不同菌體之間傳播受環(huán)境影響較大。通過比較分析相同地區(qū)魚源和鱉源嗜水氣單胞菌毒力基因分布情況，發(fā)現(xiàn)相同地區(qū)不同來源嗜水氣單胞菌毒力基因分布大多不同，且差異顯著，說明嗜水氣單胞菌針對不同養(yǎng)殖對象選擇的入侵對策不同，龜源嗜水氣單胞菌毒力基因以hlyA和actA為主和魚源的不同，可能針對宿主本身所含的營養(yǎng)物質(zhì)或防御措施不同，細(xì)菌選擇的分解方式和入侵策略不同所致。側(cè)面反映出嗜水氣單胞菌侵襲鱉的癥狀以溶血和腸炎為主[17]，剩余五種毒力基因aerA、hlyA、actA、ahaI、ahpA檢出率鱉源均高于魚源且差異顯著，說明嗜水氣單胞菌入侵鱉需要更多的毒力基因協(xié)作或者鱉的防御能力高于魚。

目前正在研究的疫苗包括：全菌滅活苗、減毒活疫苗。因為嗜水氣單胞菌血清型眾多,不同地區(qū)、不同魚種之間流行的菌株差異明顯等原因，致使嗜水氣單胞菌疫苗不能商品化而不能普及[18]，傳統(tǒng)的亞單位疫苗的最大局限性是所用的抗原不能在宿主細(xì)胞中表達(dá),因而不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，DNA疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗的全面免疫應(yīng)答的高效力[19]，如果可以將分布廣泛的幾種毒力基因的功能區(qū)域，并利用基因工程技術(shù)將幾種毒力基因的功能區(qū)域合在一起制備DNA疫苗，對于解決嗜水氣單胞菌血清型眾多,疫苗難以商品化的難題,是最理想的方法[20]。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，致病性魚源嗜水氣單胞菌分布比較廣泛的毒力基因是altA、astA、aerA、hlyA，鱉源嗜水氣單胞菌分布比較廣泛的毒力基因是hlyA、actA、aerA，若能找到這5種毒力基因的功能區(qū)域，并分別制備成多價DNA疫苗，對攻克魚源、鱉源嗜水氣單胞菌及普及疫苗具有一定意義。

由于本研究是在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)行的二次研究，對于前人研究的毒力基因是隨機(jī)檢測還是存在人為選擇難以把握，計算出的檢出率可能偏高，所以只做定型分析，通過整合前人的研究數(shù)據(jù)也增大了菌株樣本含量，具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié) 論

嗜水氣單胞菌對養(yǎng)殖對象的致病機(jī)理隨環(huán)境和養(yǎng)殖對象種類的影響而不同，魚源致病性嗜水氣單胞菌毒力基因altA、astA、aerA、hlyA分布廣泛，鱉源致病性嗜水氣單胞菌毒力基因hlyA、actA、aerA分布比較廣泛，可分別作為制備魚源和鱉源嗜水氣單胞菌多價DNA疫苗候選基因。

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

StudyonVirulenceGenesofAeromonashydrophilafromFishandTurtleinChinaBasedonMetaAnalysis

NIU Zhi-wei1，LV Xiao-li2，HUANG Jun1*，HAN Shu-yu3，LI Shan-mei3，LIANG Jing-zhen1，WEI Mu-lan4，DENG Xiao-hong1

(1.Institute of Animal Science and Technology of Guangxi University/ Guangxi Aquatic Animal Disease Diagnostic Laboratory, Guangxi Nanning 530005, China; 2.Guangxi Luchuan Aquaculture Technology Extension Station, Guangxi Luchuan 537700, China; 3.Guangxi Zhuang Autonomous Region, Aquaculture Technology Extension Station, Guangxi Nanning 530005, China; 4.Guangxi Duan Yao Autonomous County Aquaculture Technology Extension Station, Guangxi Du’an 530700, China; 5.Guangxi Quanzhou Aquaculture Technology Extension Station, Guangxi Quanzhou 541500, China)

The data of 7 kinds of virulence genes ofAeromonashydrophilafrom fish and turtle in CNKI database were analyzed based on Meta-analysis, and the distribution characteristics of virulence genes ofAeromonashydrophilafrom fish and turtle were discussed to provide candidate gene for generate multivalent DNA vaccine ofAeromonashydrophila. The results showed that the distribution of virulence genes fromAeromonashydrophilawas affected by the types of cultured species and growth environment. The virulence genes ofastA,altA,aerAandhlyAfromAeromonashydrophilaof fish were widely distributed in the north and south of China. The virulence genes ofhlyA,actA, andaerAfrom turtle sourceAeromonashydrophilawere widely distributed in the south of China, which could be used as candidate genes for generating multivalent DNA vaccine ofAeromonashydrophilain fish and turtle respectively.

Aeromonashydrophila; Fish derived; Turtle derived; Virulence genes; Meta analysis; DNA vaccine

1001-4829(2017)3-0711-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.041

S941.42+9

A

2016-11-08

廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局專項項目(桂漁牧財[2014]52號，桂漁牧財[2015]97號)

牛志偉(1990-)，男，河北邢臺人，碩士研究生，研究方向水生動物病害防控及健康養(yǎng)殖，E-mail：905478661@qq.com，*為通訊作者，E-mail：hj1351@163.com