中國廣西人群中RTN4基因遺傳多態(tài)性的研究*

覃海媚， 王 榮， 楊鳳蓮， 韋貴將， 王俊利△

(1右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖遺傳室， 2右江民族醫(yī)學附屬醫(yī)學院檢驗科， 3右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000)

中國廣西人群中RTN4基因遺傳多態(tài)性的研究*

覃海媚1, 3， 王 榮2, 3， 楊鳳蓮3， 韋貴將1， 王俊利1△

(1右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖遺傳室，2右江民族醫(yī)學附屬醫(yī)學院檢驗科，3右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000)

目的研究RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點多態(tài)性在廣西人群中的分布特征，比較不同人群的分布差異。方法本實驗采用多重單堿基延伸PCR (SNaPshot)和DNA測序方法，對323例廣西健康體檢者RTN4基因的rs2920891A/C和rs17046647A/G位點基因型進行檢測，并與國際人類基因組單體型圖計劃(HapMap)公布的不同人群(北京、日本、歐洲及非洲人群)RTN4基因多態(tài)性數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果在廣西人群中，RTN4基因rs2920891A/C位點存在AA、AC、CC基因型及A、C等位基因，其等位基因頻率在男女間的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，基因型及等位基因頻率與日本、歐洲及非洲人群比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；rs17046647A/G位點存在AA、AG、GG基因型和A、G等位基因，基因型及等位基因頻率在男女間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而與日本、歐洲及非洲人群比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論中國廣西人群中RTN4基因的rs2920891A/C和rs17046647A/G位點多態(tài)性與其他種族間存在差異性。

RTN4基因； 基因多態(tài)性； 中國廣西人群

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是基因組水平上單個堿基的改變所引起的 DNA 序列多態(tài)性，是個體或群體間遺傳差異的最主要表現(xiàn)形式，成為第3代多態(tài)性標記及識別、定位疾病相關(guān)基因的新型手段。近年來，SNPs與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究被廣泛青睞[1-3]，這對疾病預防、治療和藥物的開發(fā)等具有重要的意義。RTN4(reticulon 4)是新近發(fā)現(xiàn)的軸索生長抑制因子(又名Nogo)，屬于網(wǎng)狀蛋白家族成員之一，具有抑制中樞軸突再生、介導腫瘤細胞凋亡等作用[4-5]。目前RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點多態(tài)性在不同種族間差異尚未見報道。因此，我們采用多重單堿基延伸PCR (SNaPshot)和DNA測序方法檢測中國廣西人群RTN4基因這2個位點多態(tài)性的分布情況，并對比HapMap公布的其他種族及地區(qū)分型數(shù)據(jù)，了解RTN4基因多態(tài)性在不同種族和地域的差異情況，為今后研究RTN4基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1對象

研究對象共323例，均選自廣西百色右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，其中181例男性，142例女性，年齡為17～76歲。所有研究對象均世居于廣西地區(qū)，無親緣關(guān)系，各項臨床體格檢查及實驗室指標正常，排除任何遺傳病及其他病史。實驗前經(jīng)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批，受試者簽署知情同意書。

2方法

2.1DNA提取 采集研究對象靜脈血3 mL，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝，根據(jù)北京天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒說明書進行樣本DNA提取，基因組DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2引物制備 根據(jù)Primer 3.0軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計PCR引物，交由上海生工公司合成。rs2920891A/C位點的上游引物為5’-TGCATATCACAGAGCAAATTCATACCA-3’，下游引物為5’-AGTGAATACAGTGTACCTTTTGAGAGC-3’，延伸引物為5’-AGTGAATACAGTGTACCTTTTGAGAGC-3’； rs17046647A/G位點的上游引物為5’-TAAGGGAAGGCCTCTGCCTCCT-3’，下游引物為 5’-TCTCCAGCCAGCATTTGGCTTA-3’，延伸引物為5’-TCTCCAGCCAGCATTTGGCTTA-3’。

2.3基因測序 20 μL PCR反應體系包括：1.0 μL基因組DNA，2.0 μL×GC緩沖液I，PCR引物及dNTP(0.2 μmol/L)各1.0 μL，1.0 U熱啟動Taq聚合酶，Mg2+(2.5 mmol/L)4.0 μL，用滅菌雙蒸水補充余下的體積。PCR反應條件為：95 ℃ 2 min； 94 ℃ 20 min， 65 ℃ 10 min， 72 ℃ 1 min， 11個循環(huán)； 94 ℃ 20 s， 59 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 24個循環(huán)；最后4 ℃保存?zhèn)溆?。用熱啟動Taq聚合酶進行多重單堿基延伸PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.5 U蝦堿酶(SAP)及4 U的外切酶Ⅰ(EXOI)純化，反應條件為75 ℃中孵育15 min后37 ℃溫浴60 min，最后75 ℃滅活15 min。經(jīng)ABI 3730XL測序儀進行測序，PolyPhred軟件分析測序結(jié)果。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。直接計數(shù)法計算廣西人群RTN4基因2個位點的基因型和等位基因，再經(jīng)Hardy-Weinberg定律檢驗研究對象是否有代表性。用2檢驗對比不同組間的分布差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

結(jié) 果

1基因分型結(jié)果

在廣西人群中，RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點的擴增產(chǎn)物長度分別為567 bp和278 bp，基因分型結(jié)果為：rs2920891A/C位點基因型有AA、AC和CC基因型；rs17046647A/G有AA、AG和GG基因型，見圖1、2。

Figure 1. Sequencing map of genotype forRTN4 gene rs2920891A/C polymorphism. The arrows of panels ①, ② and ③ show AA, AC and CC genotypes, respectively.

圖1RTN4基因rs2920891A/C測序圖

Figure 2. Sequencing map of genotype forRTN4 gene rs17046647A/G polymorphism. The arrows of panels ①, ② and ③ show AA, GG and AG genotypes, respectively.

圖2RTN4基因rs17046647A/G測序圖

2RTN4基因多態(tài)性分布特征

在廣西人群中，RTN4基因rs2920891A/C位點存在AA、AC和CC基因型，分布頻率分別為48.6%、39.9%和11.5%，其等位基因為A和C，分布頻率為68.6%和31.4%； rs17046647A/G位點存在AA、AG和GG基因型，分布頻率分別為4.3%、32.5%和63.2%，其等位基因為A和G，分布頻率為20.6%和79.4%。根據(jù)Hardy-Weinberg定律檢驗分析，P值分別為0.188和0.916，提示本實驗的研究對象具有群體代表性。其中rs2920891A/C位點僅等位基因頻率在男女間的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rs17046647A/G基因型及其等位基因在男女間的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 廣西健康人群RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點多態(tài)性的分布

3不同種族或地區(qū)人群中基因型及等位基因的比較

如表2所示，在廣西人群中，RTN4基因rs2920891A/C位點的基因型和等位基因頻率與日本、歐洲和非洲人群比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。如表3所示，rs17046647A/G位點的基因型及等位基因頻率與日本、歐洲和非洲人群比較，分布差異亦均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 不同種族或地區(qū)的人群中RTN4基因rs2920891A/C位點多態(tài)性比較

表3 不同種族或地區(qū)的人群中RTN4基因rs17046647A/G位點多態(tài)性比較

討 論

人類RTN4基因在2號染色體的短臂，長度約75 kb，由8個內(nèi)含子(199 bp～37 kb)及14個外顯子(47 bp～2 400 bp )組成[6]，其編碼蛋白在哺乳動物中主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的形成[7-8]，包括Nogo-A、Nogo-B 和Nogo-C 這3種蛋白，每種蛋白分布及功能不盡相同。目前，很多研究報道了RTN4基因多態(tài)性及其編碼蛋白表達在疾病相關(guān)性的研究。2014年，Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)RTN4基因rs34917480位點CAA插入/缺失與非小細胞肺癌具有相關(guān)性，即可增加非小細胞肺癌的發(fā)病風險。Shi等[10]的研究表明RTN4基因rs71682890 位點TATC插入/缺失多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌具有相關(guān)性，該位點TATC缺失型的純合子可顯著降低宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險。同時，在蛋白水平Xiao等[11]體外培養(yǎng)HeLa宮頸癌細胞發(fā)現(xiàn)Nogo-B蛋白可結(jié)合fibulin-5從而促進宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移，表明了RTN4基因某些多態(tài)性與疾病易感性存在關(guān)聯(lián)性，是探索疾病病因的新方向。Hao 等[12]實驗發(fā)現(xiàn)Nogo-A在人肝癌細胞系SMMC-7721中高表達，在慢病毒載體干擾后其表達顯著減少，可增加G2/M期阻滯和凋亡從而抑制SMMC-7721細胞生長，表明Nogo-A可參與肝癌細胞生長調(diào)控，有望成為治療肝癌的新靶標。

經(jīng)統(tǒng)計分析，我們發(fā)現(xiàn)，廣西人群中RTN4基因rs2920891A/C位點以AA基因型較為常見(48.6%)，等位基因以A較為常見(68.6%)；rs17046647A/G位點則以GG基因型為主(63.2%)，等位基因以G為主(79.4%)。其中rs2920891A/C位點等位基因頻率在男女中的分布差異有統(tǒng)計學意義，提示廣西人群中rs2920891A/C位點多態(tài)性分布頻率可能與性別有一定的關(guān)聯(lián)，男女之間存在分布的差異。另外，RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點多態(tài)性(基因型及等位基因)與日本、歐洲和與非洲人群比較，分布差異均有統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果表明，廣西人群中存在RTN4基因rs2920891A/C和rs17046647A/G位點的多態(tài)性，這些多態(tài)性與其他種族之間存在差異性。

基因多態(tài)性可因自然選擇、生活環(huán)境影響及種族不同等因素作用而存在很大差異，我們研究結(jié)果同樣體現(xiàn)這個特性?；蚨鄳B(tài)性可影響蛋白的表達和功能的差異，使得不同種群或個體之間對某些疾病的發(fā)生發(fā)展存在不同的易感性[13-16]，這也是疾病藥物治療存在個體間差異和耐藥性的重要因素之一。因此，本研究不僅有助于我們了解廣西人群中RTN4基因多態(tài)性的遺傳背景，而且為今后研究疾病發(fā)病機制、診斷及個體化治療提供寶貴的資料。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

GeneticpolymorphismsofRTN4geneinChineseGuangxipopulation

QIN Hai-mei1, 3, WANG Rong2, 3, YANG Feng-lian3, WEI Gui-jiang1, WANG Jun-li1

(1LaboratoryofReproductiveGenetics，AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities，2DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities，3YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China.E-mail: 13907768146@163.com)

AIM: To investigate the distribution characteristics of rs2920891A/C and rs17046647A/G polymorphisms ofRTN4 gene in Guangxi population, and to compare the differences among different populations.METHODSThe genotypes ofRTN4 gene at rs2920891A/C and rs17046647A/G in 323 healthy persons of Guangxi were performed by the technique of SNaPshot and DNA sequencing. The results were compared with the alleles and genotypes of other populations (HapMap-CEU, HapMap-HCB, HapMap-JPT and HapMap-YRI in HapMap).RESULTSIn Guangxi population, 3 genotypes， AA, AC and CC， and 2 alleles， A and C， were found in rs2920891A/C. The allele frequencies between male and female showed significant differences (P<0.05). The genotype and allele frequencies compared with HapMap-JPT, HapMap-CEU and HapMap-YRI had differences with statistical significance (P<0.05). Three genotypes， AA, AG and GG， and 2 alleles， A and G， were found in rs17046647A/G. The genotype and allele frequencies between male and female showed no significant differences (P>0.05), but there were significant differences of the genotype and allele frequencies as compared with HapMap-JPT, HapMap-CEU and HapMap-YRI (P<0.01).CONCLUSIONThe rs2920891A/C and rs17046647A/G polymorphisms ofRTN4 gene in Chinese Guangxi population are different from those in other races.

RTN4 gene; Genetic polymorphisms; Chinese Guangxi population

R394.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.024

1000- 4718(2017)10- 1882- 04

2017- 03- 30

2017- 05- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 81560461)

△通訊作者 Tel: 0776-2824233； E-mail: 13907768146@163.com

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