GDC-0032抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力并誘導(dǎo)DNA損傷*

崔海娟， 張亞云， 焦 鵬， 孫 錚

(1泰山醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院， 山東 泰安 271016； 2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450052；泰山醫(yī)學(xué)院 3生命科學(xué)研究中心， 4第二臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000)

GDC-0032抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力并誘導(dǎo)DNA損傷*

崔海娟1， 張亞云2， 焦 鵬3， 孫 錚4△

(1泰山醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院， 山東 泰安 271016；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450052；泰山醫(yī)學(xué)院3生命科學(xué)研究中心，4第二臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000)

目的探討磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑GDC-0032對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和DNA損傷的影響。方法GDC-0032處理U251細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)分析GDC-0032對(duì)細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化；免疫熒光檢測組蛋白γ-H2AX在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與分布。結(jié)果GDC-0032 劑量依賴性地抑制U251細(xì)胞活力；U251細(xì)胞經(jīng)GDC-0032作用后，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)p27的表達(dá)水平增加，而細(xì)胞分裂周期蛋白2(Cdc2)的表達(dá)則受到抑制；在GDC-0032作用的細(xì)胞中，γ-H2AX焦點(diǎn)的生成和表達(dá)水平明顯升高；另外，GDC-0032上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶家族成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平，而survivin的表達(dá)則受到抑制。結(jié)論GDC-0032能夠通過抑制細(xì)胞活力和阻滯細(xì)胞于G1期而抑制U251細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷；GDC-0032的抑癌活性與其調(diào)控ERK和JNK的活性及下調(diào)survivin的表達(dá)相關(guān)。

GDC-0032； 膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞活力； DNA損傷； 絲裂原活化蛋白激酶

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性[1]。PI3K位于眾多重要信號(hào)通路的關(guān)鍵性信號(hào)位置，是PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的上游分子，由一個(gè)催化亞基(p110)結(jié)合一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(p85、p55或p50)組成異源二聚體[2]。通常情況下，活化的PI3K能夠激活下游因子AKT從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)，通過磷酸化作用進(jìn)一步激活或抑制其下游分子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、代謝和分化等生理和病理過程[3]。由于PI3K的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，使得開發(fā)新型小分子PI3K抑制劑已成為當(dāng)前抗癌新藥研究的熱點(diǎn)[4]。

GDC-0032是一種新型的PI3K抑制劑，對(duì)PIK3CA突變和HER2/neu基因擴(kuò)增的子宮漿液性癌呈現(xiàn)良好的抑制活性，同時(shí)增加頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的放療敏感性[5-6]。本研究以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251為實(shí)驗(yàn)材料，檢測GDC-0032對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和DNA損傷的影響，并初步探討其內(nèi)在的分子機(jī)制，以期為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)材料

GDC-0032購自Selleck Chemicals；MTT、碘化丙啶(propidium iodide，PI)和抗β-actin抗體購自Sigma；抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38、p-p38、細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2，Cdc2)、p21和p53抗體購自Santa Cruz；抗p-JNK和p27抗體購自BD Biosciences；抗γ-H2AX抗體購自Abcam；HRP標(biāo)記的 II 抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37 ℃、5% C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 胰酶消化U251細(xì)胞并接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)。次日加入不同劑量的GDC-0032 處理24 h，對(duì)照組加入DMSO。終止培養(yǎng)前4 h加20 μL MTT (5 g/L)于各個(gè)孔中。吸去培養(yǎng)基，接著每孔加入150 μL DMSO，置室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm波長下測定各孔吸光度(A)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 不同濃度的GDC-0032作用細(xì)胞24 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，然后加入預(yù)冷的75%無水乙醇于-20 ℃固定過夜。接著用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入終濃度為50 mg/L RNase A于37 ℃ 孵育30 min；然后加入終濃度為50 mg/L的PI閉光染色20 min，然后上機(jī)分析各組細(xì)胞的周期分布。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)不同劑量GDC-0032處理24 h后，進(jìn)行免疫印跡分析。各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后，用預(yù)冷的的RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，收集上清并用BCA法定量。 經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉，加入 I 抗，4 ℃ 孵育過夜。第2 d用PBS洗膜3次，每次5 min，加入 II 抗；最后使用ECL顯影成像。

2.5免疫熒光檢測γ-H2AX焦點(diǎn) 接種細(xì)胞于蓋玻片上，然后用不同濃度的GDC-0032 處理細(xì)胞24 h。PBS洗滌玻片2 次，4% 多聚甲醛固定20 min，Triton X-100室溫打孔5 min。山羊血清室溫封閉1 h，接著用γ-H2AX抗體孵育2 h，加入熒光II 抗(Thermo Fisher)37 ℃孵育1 h；然后用DAPI染細(xì)胞核10 min，50%甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1GDC-0032對(duì)U251細(xì)胞活力的抑制作用

U251細(xì)胞經(jīng)不同劑量的GDC-0032處理24 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果所示，GDC-0032能夠顯著抑制U251細(xì)胞的活力，且抑制作用呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. The effects of GDC-0032 treatment at different concentrations for 24 h on the viability of the U251 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1GDC-0032抑制U251細(xì)胞活力

2GDC-0032阻滯U251細(xì)胞于G1期

接著，采用流式細(xì)胞術(shù)分析了GDC-0032對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)GDC-0032作用U251細(xì)胞24h后，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而處于S期的細(xì)胞數(shù)量則相應(yīng)減少，表明GDC-0032能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，見圖2、表1。

Figure 2. Upon exposure to GDC-0032 for 24 h, U251 cells exhibited G1phase arrest.

圖2GDC-0032誘導(dǎo)U251細(xì)胞阻滯于G1期

表1GDC-0032誘導(dǎo)U251細(xì)胞阻滯于G1期

Table 1. Upon exposure to GDC-0032 for 24h, U251 cells exhibited G1phase arrest (%. Mean±SD.n=3)

GDC?0032(μmol/L)G0/G1SG2/M069．75±2．6312．87±1．6316．56±1．620．574．23±2．82?8．24±1．17?18．15±1．84176．53±3．51?6．38±2．03?18．55±3．14579．86±1．38?4．76±1．54?15．21±3．76

*P<0.05vs0 μmol/L group.

Western blot結(jié)果表明，在GDC-0032處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Cdc2的表達(dá)水平受到抑制，而p27的蛋白水平則上調(diào)，p53和 p21的蛋白表達(dá)未見明顯變化，見圖3。

3GDC-0032誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生DNA損傷

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷也是化療藥物的重要抑癌分子機(jī)制之一。本研究采用免疫熒光檢測了GDC-0032對(duì)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量的影響。與對(duì)照組相比，U251細(xì)胞經(jīng)GDC-0032 作用后，γ-H2AX的焦點(diǎn)數(shù)目明顯增多(圖4)；同時(shí)γ-H2AX的表達(dá)水平也顯著升高(圖5)，表明GDC-0032可誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。

4GDC-0032對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號(hào)通路和survivin表達(dá)的影響

Western blot檢測了細(xì)胞內(nèi)MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GDC-0032處理U251細(xì)胞后，ERK和JNK的磷酸化水平明顯升高，p38的磷酸化水平未見明顯變化，見圖6。

用Western blot檢測了GDC-0032對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)GDC-0032能夠顯著抑制survivin的蛋白表達(dá)，見圖7。

討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人中最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)和預(yù)后差[7]。目前臨床治療以手術(shù)、放療和化療相結(jié)合為主，但由于膠質(zhì)瘤增殖速度較快和浸潤性極強(qiáng)，治療效果尚不理想。因此，在探討膠質(zhì)瘤發(fā)病分子機(jī)制的同時(shí)，尋求有效的治療藥物已成為膠質(zhì)瘤臨床治療的重要研究領(lǐng)域。本研究發(fā)現(xiàn)PI3K新型小分子抑制劑GDC-0032對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251表現(xiàn)出良好的抑制活性。GDC-0032能夠通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而抑制U251細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。促進(jìn)MAPK家族成員ERK和JNK的激活及其抑制survivin的表達(dá)可能與GDC-0032的抗腫瘤活性相關(guān)。

細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失調(diào)的根本原因。在真核生物中，細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)和負(fù)向調(diào)控的CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI)構(gòu)成復(fù)雜而精確的細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)[8-9]。p27和p21蛋白是CKI 家族中的重要成員，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，能夠通過抑制CDK或cyclin/CDK復(fù)合物的活性而調(diào)控細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GDC-0032能夠顯著誘導(dǎo)U251細(xì)胞G1期阻滯，這可能與上調(diào)p27的表達(dá)并抑制Cdc2的蛋白水平相關(guān)。

Figure 3. The effects of GDC-0032 treatment at different concentrations for 24 h on the expression of cell cycle-associated proteins in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3GDC-0032對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 4. The formation of γ-H2AX foci in the U251 cells treated with different concentrations of GDC-0032 (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4GDC-0032對(duì)U251細(xì)胞中γ-H2AX焦點(diǎn)生成的影響

Figure 5. GDC-0032 increased the expression of γ-H2AX. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5Westernblot檢測GDC-0032對(duì)U251細(xì)胞DNA損傷的影響

Figure 6. The effect of GDC-0032 on the expression of MAPK signaling transduction pathway-related proteins in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6GDC-0032對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 7. The protein levels of survivin in the U251 cells treated with GDC-0032 for 24 h determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7GDC-0032抑制U251細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂也是抗腫瘤化合物的作用機(jī)制之一[11]。DNA 修復(fù)能力的增強(qiáng)是引起腫瘤對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)，抑制DNA損傷修復(fù)促進(jìn)腫瘤的放化療敏感性。DNA 損傷可以誘導(dǎo)H2AX的磷酸化(γ-H2AX)，因而γ-H2AX 的表達(dá)與核內(nèi)焦點(diǎn)數(shù)目已成為檢測DNA雙鏈斷裂的生物標(biāo)志物[12]。本研究的免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U251細(xì)胞經(jīng)GDC-0032作用后，γ-H2AX 表達(dá)量和細(xì)胞核內(nèi)的焦點(diǎn)數(shù)目明顯增加，證實(shí)GDC-0032能夠誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂，并且隨著GDC-0032濃度的增加損傷程度逐漸加強(qiáng)。

為了進(jìn)一步探討GDC-0032抑癌活性的分子機(jī)制，本研究檢測了GDC-0032對(duì)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵成員ERK和JNK活性的影響。MAPK信號(hào)途徑在細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的過程中扮演著重要的角色，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育、分化及凋亡等多種生理病理過程[13-14]。目前研究認(rèn)為MAPK 主要由ERK1/2、JNK和p38 三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDC-0032能夠促進(jìn)U251細(xì)胞中ERK和JNK的磷酸化激活，表明 GDC-0032的抗腫瘤活性可能與其調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，PI3K新型抑制劑GDC-0032能夠通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出較好的抑制活性。調(diào)控MAPK家族成員ERK和JNK激酶活性可能是GDC-0032的抗腫瘤活性機(jī)制之一。本研究為GDC-0032的臨床應(yīng)用及膠質(zhì)瘤的治療提供了新思路。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

GDC-0032inhibitscellviabilityandinducesDNAdamageinU251humangliomacells

CUI Hai-juan1, ZHANG Ya-yun2, JIAO Peng3, SUN Zheng4

(1SchoolofNursing,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China;2TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;3LifeSciencesResearchCentre,4TheSecondSchoolofClinicalMedicine,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China.E-mail: 13405489981@163.com)

AIM: To investigate the effect of phosphatidylinostiol 3-kinase (PI3K) inhibitor GDC-0032 on cell viability, cell cycle and DNA damage in human glioma U251 cells.METHODSThe cell viability was analyzed by MTT assay. The cell cycle distribution of U251 cells was examined by flow cytometry. The protein expression was examined by Western blot. The expression and localization of γ-H2AX were determined by laser-scanning confocal microscopy.RESULTSGDC-0032 inhibited the cell viability in a dose-dependent manner. U251 cells showed G1phase arrest accompanied with upregulation of p27 protein after exposure to GDC-0032, while the expression of cell division cycle protein 2 (Cdc2) was inhibited. GDC-0032 treatment increased the formation of γ-H2AX foci and histone H2AX phosphorylation in the U251 cells. In addition, GDC-0032 upregulated the phosphorylation levels of mitogen-activated protein kinases， including extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK)， in the glioma cells, while the expression of survivin was inhibited.CONCLUSIONGDC-0032 inhibits U251 cell growth by inhibition of cell viability and cell cycle progression. GDC-0032 also induces DNA damage of U251 cells. The anticancer activity of GDC-0032 is associated with increasing the activity of ERK and JNK and downregulating the expression of survivin.

GDC-0032; Glioma; Cell viability; DNA damage; Mitogen-activated protein kinases

R739.4； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.020

1000- 4718(2017)10- 1858- 06

2017- 03- 27

2017- 05- 17

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2014HL107)

△通訊作者 Tel： 0538-6238072； E-mail： 13405489981@163.com

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