益氣溫陽(yáng)活血化痰方通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HHPH大鼠腦的保護(hù)作用*

項(xiàng)冰倩， 高 慧， 金曉潔， 戴雍月， 錢(qián)小英， 陳錫文， 王萬(wàn)鐵△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1缺血/再灌注損傷研究所， 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 溫州325035； 3溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州325000)

益氣溫陽(yáng)活血化痰方通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HHPH大鼠腦的保護(hù)作用*

項(xiàng)冰倩1， 高 慧1， 金曉潔1， 戴雍月1， 錢(qián)小英3， 陳錫文2△， 王萬(wàn)鐵1△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1缺血/再灌注損傷研究所，2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 溫州325035；3溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州325000)

目的評(píng)價(jià)益氣溫陽(yáng)活血化痰方通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓(HHPH)所致腦損傷的作用。方法雄性SD大鼠50只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對(duì)照組，低氧高CO2組，益氣溫陽(yáng)活血化痰方低、中、高劑量給藥組。對(duì)照組置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng), 其余4組置于低氧高CO2氧倉(cāng)中飼養(yǎng)，共飼養(yǎng)4周。益氣溫陽(yáng)活血化痰方低、中、高劑量組大鼠每天分別按0.15 g/kg、0.3 g/kg和0.6 g/kg灌服益氣溫陽(yáng)活血化痰方浸膏，低氧高CO2組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥4周后對(duì)大鼠進(jìn)行手術(shù)，記錄肺動(dòng)脈平均壓后進(jìn)行心臟灌流，結(jié)束后開(kāi)顱快速取腦組織檢測(cè)腦組織含水量并開(kāi)胸取肺組織。光鏡下觀察腦組織及肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡指數(shù)，分光光度計(jì)法檢測(cè)腦組織caspase-3酶活性，Western blot和RT-PCR法檢測(cè)c-Jun氨基末端激酶(JNK)、caspase-12、C/EBP同源蛋白(CHOP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的蛋白及mRNA水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，其余組肺動(dòng)脈平均壓、腦含水量、細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3酶活性以及JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA均有升高，組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)亦有損傷性變化；與低氧高CO2組比較，益氣溫陽(yáng)活血化痰方低、中、高劑量組的肺動(dòng)脈平均壓、腦含水量、細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3酶活性以及JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白及mRNA均有降低，腦組織及肺組織結(jié)構(gòu)損傷性的變化亦有明顯減輕，并以中劑量組最為顯著。結(jié)論益氣溫陽(yáng)活血化痰方可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)減輕HHPH所致的腦損傷。

益氣溫陽(yáng)活血化痰方； 低氧血癥； 高二氧化碳血癥； 肺動(dòng)脈高壓； 腦； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)通常是指以肺動(dòng)脈壓力升高為主，伴或不伴有小肺動(dòng)脈病變?yōu)樘卣鞯膼盒苑窝芗膊?，長(zhǎng)期發(fā)展可引起右心衰，甚至導(dǎo)致死亡，是一類嚴(yán)重威脅人類身心健康的常見(jiàn)疾病[1-2]。近年來(lái)，PH與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)關(guān)系的研究備受關(guān)注。缺血、缺氧可誘發(fā)ERS，適度的ERS可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持細(xì)胞存活，但過(guò)度的ERS則會(huì)加重組織損傷，誘導(dǎo)ERS相關(guān)性細(xì)胞凋亡。有研究表明ERS參與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)生發(fā)展[3]。但其是否也參與了肺動(dòng)脈高壓引起的腦損傷，目前尚未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。

益氣溫陽(yáng)活血化痰方(Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula，YWHHF)[4]由人參、黃芪、川芎、丹參、附片、法夏、薤白、白芥子等組成。大量研究表明組方中的黃芪、川穹、附片和丹參等對(duì)左心相關(guān)性PH有顯著的治療效果，能夠顯著改善患者咳、喘、痰以及心悸等癥狀，有效提高了患者的生活質(zhì)量[5]。但是否對(duì)PH引起的腦損傷也有治療效果目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用吸入低氧伴高CO2混合氣體制備肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，研究益氣溫陽(yáng)活血化痰方是否通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)所致的腦損傷，同時(shí)為傳統(tǒng)中藥在臨床上的更好應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

雄性健康SPF級(jí)SD大鼠50只，體重(200±20) g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK (浙)2015-0009。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為5組：對(duì)照組(control group,C組，n=10)，低氧高CO2組(模型組，model group，MO組，n=10)，益氣溫陽(yáng)活血化痰方低劑量給藥組(L組，n=10)、中劑量給藥組(M組，n=10)和高劑量給藥組(H組，n=10)。

2主要試劑

YWHHF[4]為北京中醫(yī)藥大學(xué)組方，藥材購(gòu)于老百姓大藥房；水合氯醛購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司；caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和 I 抗稀釋液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo；兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK和caspase-12抗體購(gòu)自Abcam；小鼠抗大鼠C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 II 抗購(gòu)自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche。所用引物由浩豐生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR的引物序列

3主要方法

3.1藥物制備 YWHHF全方組成為黃芪 30 g、人參20 g、附片9 g、川芎10 g、丹參10 g、法夏9 g、薤白12 g和白芥子 15 g，混勻浸泡1 h，多功能提取罐煎煮2次(加水量分別為藥材量的8倍和5倍，煎煮1.5 h、1 h)，合并2次濾液，真空冷凍干燥機(jī)干燥處理后得到干燥粉末，分裝，于陰涼處密封保存。按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量。用生理鹽水分別配制高劑量組(200 g/L)、中劑量組(100 g/L)和低劑量組(50 g/L)，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，灌胃前用恒溫水浴鍋37 ℃水浴10 min。

3.2大鼠HHPH模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 依照文獻(xiàn)制備大鼠HHPH模型[6]。對(duì)照組置于常規(guī)環(huán)境，自由呼吸空氣，飼養(yǎng)4周；其余4組大鼠置于低氧高CO2(8.5%～11% O2、5%～6% CO2)氧倉(cāng)中飼養(yǎng)，艙內(nèi)水蒸汽用無(wú)水CaCl2吸收，每天8 h，每周6 d，其余時(shí)間常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)，共飼養(yǎng)4周；其中低、中、高劑量組大鼠根據(jù)體表面積折算率，每天進(jìn)倉(cāng)前半小時(shí)分別按0.15 g/kg、 0.3 g/kg和0.6 g/kg灌服YWHHF浸膏；低氧高CO2組大鼠進(jìn)倉(cāng)前0.5 h用等體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥4周后處死大鼠，用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉。用生理鹽水對(duì)心臟進(jìn)行充分灌洗，灌洗結(jié)束后剪下大鼠頭顱并快速消毒，迅速開(kāi)顱小心取出腦組織，漂洗干凈后保存做后續(xù)檢測(cè)。

3.3在體檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP) 75%乙醇行頸部皮毛消毒，剪開(kāi)頸右半部皮膚2 cm至鎖骨上部，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露頸外靜脈游離約1 cm。在頸外靜脈中心處剪一個(gè)2～3 mm的“V”形切口，將連接PowerLab信號(hào)采集系統(tǒng)的PE導(dǎo)管沿著切口向里朝右心室方向推送，到達(dá)右心房后將導(dǎo)管朝外旋轉(zhuǎn)90度左右，邊旋轉(zhuǎn)邊前進(jìn)，直至前進(jìn)無(wú)阻力并出現(xiàn)波幅很大的心室波時(shí)，可判斷導(dǎo)管已進(jìn)入右心室，將導(dǎo)管旋轉(zhuǎn)再往里推送，直至出現(xiàn)波幅較心室波小、波形較規(guī)則的肺動(dòng)脈壓力波形，記錄肺動(dòng)脈壓并保存。

3.4光鏡下腦和肺組織形態(tài)學(xué)觀察 開(kāi)顱取出腦組織和開(kāi)胸取出肺組織，取體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的腦和肺組織，經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察各組標(biāo)本組織學(xué)改變。

3.5腦含水量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開(kāi)顱取腦組織稱其濕重，再放入烤箱內(nèi)48 h后稱其干重。計(jì)算公式：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.6TUNEL法檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡指數(shù) 石蠟包埋腦組織并切片，依次經(jīng)染色、二甲苯、無(wú)水乙醇、95%和75%乙醇、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除組織蛋白，蒸餾水漂洗后按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，光學(xué)顯微鏡下觀察腦細(xì)胞凋亡程度。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野(×400)記錄總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

3.7Caspase-3酶活性的檢測(cè) 按每3～10 mg腦組織加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，冰上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中冰中裂解5 min。4 ℃、20 000 r/min離心15 min后轉(zhuǎn)移上清液，按照caspase-3活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用分光光度計(jì)法檢測(cè)腦組織中caspase-3的酶活性。

3.8Western blot法檢測(cè)腦組織p-JNK、GRP78、caspase-12和CHOP的蛋白水平 低溫下充分研磨腦組織，以400 μL RIPA(含4 μL PMSF) 裂解組織，混勻后吸取勻漿液4 ℃離心取上清，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度并繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白定量成2 g/L, 變性煮沸10 min。配膠進(jìn)行電泳，上樣量20 μL，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗，加 I 抗(JNK、p-JNK、GRP78、caspase-12和CHOP均以1∶1 000稀釋；GAPDH以1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次7 min， II 抗室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，加ECL工作液反應(yīng)2 min，暗室曝光，顯影、定影后，凝膠分析軟件分析蛋白吸光度(A)。取目的蛋白條帶吸光度和內(nèi)參照條帶吸光度的比值。計(jì)算p-JNK與JNK的比值，以反映p-JNK蛋白水平。

3.9RT-PCR檢測(cè)腦組織JNK、 GRP78、caspase-12和CHOP的mRNA表達(dá)水平 取大鼠腦組織加液氮研磨，以TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成及擴(kuò)增。PCR參數(shù)為：預(yù)變性 94 ℃ 3 min；變性 94 ℃ 30 s， 退火 (JNK 57.1 ℃， caspase-12 53 ℃， CHOP 59.3 ℃， GRP78 53.9 ℃， β-actin 51.3 ℃) 30 s， 延伸 72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；終止延伸 72 ℃ 5 min。以β-actin為內(nèi)參照，以目的基因條帶和內(nèi)參照條帶灰度的比值反映其表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果用Quantity One分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性者，兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者行Dunnett’st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠肺動(dòng)脈平均壓變化

肺動(dòng)脈平均壓結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其余4組肺動(dòng)脈平均壓均有明顯升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組的肺動(dòng)脈平均壓均有不同程度下降，并以中劑量組下降最為明顯(P<0.05)；3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組肺動(dòng)脈平均壓下降最顯著(P<0.05)，低、高劑量組無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The changes of mean pulmonary arterial pressure (mPAP) in each group. C： control； MO: model; L: low-dose YWHHF; M: middle-dose YWHHF; H: high-dose YWHHF. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖1各組大鼠肺動(dòng)脈平均壓的變化

2各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化

光學(xué)顯微鏡下觀察肺中小動(dòng)脈發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分布均勻，厚薄一致；低氧高CO2組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生明顯，中膜增厚,管腔有效面積減小，肺組織細(xì)胞排列紊亂不一；YWHHF低、中、高劑量組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生均有減輕，管壁厚度均有不同程度減小，管腔面積有不同程度增大，3組比較中，以中劑量組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生程度最輕，管壁厚度最小，管腔面積最大，見(jiàn)圖2。

3各組大鼠光鏡下腦組織形態(tài)學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常；低氧高CO2組大鼠腦細(xì)胞間隙增大，水腫明顯，胞質(zhì)疏松、淡染，并伴有部分細(xì)胞壞死；低、高劑量組大鼠腦細(xì)胞排列尚規(guī)則，體積稍大，水腫程度減輕，中劑量組大鼠腦細(xì)胞輕微腫脹，胞核變淺，細(xì)胞有輕度水腫現(xiàn)象，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The morphological changes of pulmonary middle and small arteries in each group (HE staining，×40). A: control group; B: model group; C: low-dose YWHHF group; D: middle-dose YWHHF group; E: high-dose YWHHF group.

圖2各組大鼠肺中、小型動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化

4各組大鼠腦含水量的變化

與對(duì)照組相比，其余4組大鼠腦含水量均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個(gè)用藥組大鼠腦含水量均有不同程度下降，并以中劑量組下降最為明顯(P<0.05)；3個(gè)用藥組兩兩相互比較，中劑量組腦含水量下降最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4。

5各組大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

與對(duì)照組相比，其余4組大鼠的腦細(xì)胞凋亡指數(shù)均有較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組大鼠的腦細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯降低(P<0.05)，3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組降低最為明顯(P<0.05)，低、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5。

Figure 3. The morphological changes of brain tissue in each group (HE staining). A: control group; B: model group; C: low-dose YWHHF group; D: middle-dose YWHHF group; E: high-dose YWHHF group.

圖3各組大鼠光鏡下腦組織形態(tài)學(xué)變化

Figure 4. The changes of brain water content in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖4各組大鼠腦含水量的變化

6各組大鼠caspase-3酶活性的變化

與對(duì)照組相比，其余4組大鼠caspase-3酶活性均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個(gè)用藥組caspase-3酶活性均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3個(gè)用藥組兩兩相互比較，中劑量組caspase-3酶活性降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

7各組大鼠腦組織p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白水平的變化

與對(duì)照組相比，其余4組大鼠p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白表達(dá)水平均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3個(gè)用藥組均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3個(gè)用藥組兩兩相互比較，中劑量組p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78蛋白表達(dá)量降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖7～10。

8各組大鼠腦組織JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)水平變化

與對(duì)照組相比，其余4組大鼠JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)水平均有升高(P<0.05)；與低氧高CO2組相比，3組用藥組均有不同程度下降，并以中劑量組最為明顯(P<0.05)；3組用藥組兩兩相互比較，中劑量組JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA表達(dá)量降低最顯著(P<0.05)，低、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖11～14。

討 論

COPD是我國(guó)慢性肺心病的主要發(fā)病原因，HHPH是COPD發(fā)展到肺心病的中心環(huán)節(jié)，是肺心病特征性改變，HHPH的產(chǎn)生及嚴(yán)重程度明顯影響著COPD和肺心病的病程和預(yù)后[7-8]。肺動(dòng)脈高壓的主要病理生理過(guò)程是肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)，肺血管阻力增加，最終引起右心衰竭等一系列病變[9-11]。肺動(dòng)脈高壓的誘因如缺氧、病毒感染、炎癥等都與某種程度的ERS相關(guān)。最新研究表明ERS及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、內(nèi)皮素1等均有密切關(guān)系，在慢性低氧性PH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[6]。而減輕ERS對(duì)左心肥厚和衰竭有保護(hù)作用。在PH動(dòng)物模型中，減輕ERS可以降低肺血管阻力、肺血管重構(gòu)和右心肥大，從而防治PH[12-15]，但ERS是否參與肺動(dòng)脈高壓引發(fā)的腦損傷目前尚不明確。

從中醫(yī)角度講，腦缺血的主要病因是氣虛血瘀，治療應(yīng)當(dāng)益氣活血[16]。益氣溫陽(yáng)活血化痰方由人參、黃芪、川芎、丹參、附片、法夏、薤白、白芥子等組成。方中人參取其“培土生金”之意，其重用人參，大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，生津安神，亦歸脾、肺二經(jīng)，可通補(bǔ)胸中宗氣，即心肺之陽(yáng)，為君藥，黃芪補(bǔ)肺益氣扶正以固其本，有補(bǔ)氣以助血行之意；川芎和丹參為“血中氣藥”，具有行氣活血之效為臣藥，祛瘀導(dǎo)滯，使百脈暢通，痹阻消散，去除胸中煩滿郁結(jié)；法夏和白芥子降氣化痰，行水消腫；附片和薤白等壯元陽(yáng)，補(bǔ)氣血，有理氣寬胸之功，使痰得溫則化，瘀得陽(yáng)則活。諸藥配合共奏益氣溫陽(yáng)、活血化痰、開(kāi)胸除痹之功。

Figure 5. The images of TUNEL staining (×200) and the changes of apoptotic index in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖5TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

Figure 6. The changes of caspase-3 activity in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖6各組大鼠caspase-3酶活性的變化

Figure 7. The protein level of p-JNK in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖7Westernblot法檢測(cè)p-JNK蛋白水平的變化

Figure 8. The protein level of caspase-12 in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖8Westernblot法檢測(cè)caspase-12蛋白水平的變化

Figure 9. The protein expression of CHOP in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖9Westernblot法檢測(cè)CHOP蛋白水平的變化

Figure 10. The protein expression of GRP78 in each group determined by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖10Westernblot法檢測(cè)GRP78蛋白水平的變化

Figure 11. The mRNA expression of JNK in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖11RT-PCR法檢測(cè)JNK的mRNA表達(dá)

Figure 12. The mRNA expression of caspase-12 in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖12RT-PCR法檢測(cè)caspase-12的mRNA表達(dá)

Figure 13. The mRNA expression of CHOP in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖13RT-PCR法檢測(cè)CHOP的mRNA表達(dá)

Figure 14. The mRNA expression of GRP78 in each group detected by RT-PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsMO group;▲P<0.05vsM group.

圖14RT-PCR法檢測(cè)GRP78的mRNA表達(dá)

中醫(yī)學(xué)通過(guò)其特有的整體觀念及辨證論治，對(duì)腦損傷的治療具有一定優(yōu)勢(shì)，療效明顯[5]。大量研究表明[17]，組方中的丹參素能夠增加微循環(huán)血流，清除氧自由基，保護(hù)線粒體，改善能量代謝；川芎能降低血液黏度，擴(kuò)張小動(dòng)脈，對(duì)腦缺血的修復(fù)有重要作用。丹參、川芎嗪配合使用能明顯提高腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的存活率，且對(duì)正常腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞沒(méi)有影響。人參的活性成分人參皂甙對(duì)心肌及腦缺血再灌注損傷有很好的保護(hù)作用，也可明顯延長(zhǎng)低壓和常壓缺氧條件下小白鼠的存活時(shí)間[18]；黃芪能增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，改善腦缺血后腦組織能量代謝，對(duì)抗腦缺血再灌注損傷，并且對(duì)缺氧腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷亦有保護(hù)作用[16]。諸藥合用，不僅可以顯著提高臨床療效，同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)耐量和減輕神經(jīng)功能損傷、抗氧化有顯著作用，還可以有效地緩解中醫(yī)臨床癥狀。但益氣溫陽(yáng)活血化痰方對(duì)肺動(dòng)脈高壓引發(fā)的損傷腦組織是否具有保護(hù)作用及具體可能作用機(jī)制目前尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)的4種檢測(cè)蛋白為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，其中GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子結(jié)合分子伴侶，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，GRP78會(huì)大量表達(dá)從而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對(duì)組織起到保護(hù)性作用。因此，GRP78表達(dá)的急速上調(diào)被認(rèn)為是ERS 最敏感的標(biāo)志物[19-20]。 JNK信號(hào)通路是ERS的凋亡途徑之一。有研究表明， 在低氧高CO2性肺動(dòng)脈高壓損傷過(guò)程中JNK發(fā)生過(guò)度激活，而抑制JNK激活可明顯減少細(xì)胞凋亡，減輕肺動(dòng)脈高壓損傷[21-23]。Caspase-12廣泛存在于大鼠的各組織中，是ERS的主要凋亡信號(hào)分子之一。過(guò)度的ERS可引起其它c(diǎn)aspase家族如caspase-9和caspase-3的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[24]。CHOP是促凋亡的重要信號(hào)分子，是ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物[25]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，除對(duì)照組外，其余4組大鼠肺動(dòng)脈平均壓均有不同程度的升高，并且肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞亦有不同程度的增生，中膜增厚，表示肺動(dòng)脈高壓模型已成功復(fù)制。腦組織光鏡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其余4組腦組織均有損傷性的結(jié)構(gòu)改變，其中以低氧高CO2組損傷最明顯，3組用藥組組織學(xué)損傷明顯減輕，并以中劑量組減輕最明顯。在腦含水量、TUNEL染色、caspase-3酶活性檢測(cè)、Western blot及RT-PCR檢測(cè)中，與對(duì)照組比較，其余4組的腦含水量，細(xì)胞凋亡指數(shù)，caspase-3酶活性，JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA表達(dá)量均有升高，并以低氧高CO2組升高最明顯，3組用藥組與低氧高CO2組相比以上指標(biāo)均有明顯降低，并以中劑量最顯著，以上結(jié)果說(shuō)明低氧高CO2性肺動(dòng)脈高壓的確引發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并造成腦組織的損傷，而益氣溫陽(yáng)活血化痰方能明顯降低腦組織損傷性因子的表達(dá)，減輕腦組織學(xué)損傷性結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)腦組織起到了有效的保護(hù)作用，并以中劑量組最適宜。

綜上所述，益氣溫陽(yáng)活血化痰方可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)而減輕低氧高CO2性肺動(dòng)脈高壓引起的腦組織損傷。

[1] 荊志成. 2010年中國(guó)肺高血壓診治指南[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志, 2011, 3(2):62-81.

[2] Hogg K, Swedberg K, McMurray J. Heart failure with preserved left ventricular systolic function: epidemiology, clinical characteristics, and prognosis[J]. J Am Coll Cardiol, 2004, 43(3):317-327.

[3] Greene CM, McElvaney NG. Protein misfolding and obstructive lung disease[J]. Proc Am Thorac Soc, 2010, 7(6):346-355.

[4] 鐘廣偉, 王東生, 陳 瓊, 等. 益氣溫陽(yáng)活血化痰方藥治療慢性阻塞性肺疾病合并肺動(dòng)脈高壓的臨床療效研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015， 30(10):3771-3774.

[5] 陳 韋， 侯 平. 益氣活血祛痰法治療左心相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓的臨床觀察[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 10(12):1706-1709.

[6] 范小芳， 李文娟， 陳兆琴， 等. 慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡的變化[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(3):270-274， 385.

[7] 張曉慧. 阿托伐他汀聯(lián)合黃芪治療慢性阻塞性肺疾病并肺動(dòng)脈高壓的效果[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(12):1459-1461.

[8] 朱阿楠，王園園，王淑君，等. ERK通路和三七總皂苷干預(yù)在低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(9):1796-1801.

[9] Dromparis P, Paulin R, Stenson TH, et a1. Attenuating endoplasmic reticulum stress as a novel therapeutic strategy in pulmonary hypertension[J]. Circulation, 2013, 127(1):115-125.

[10] 林 碧， 張 瓊， 戴一洳， 等. 人參皂甙 Rb1 通過(guò) Rho/Rho 激酶通路影響低氧誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及 SERT 和 5-HT1BR 表達(dá)[J].中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(10):1848-1853.

[11] 魏 璨， 彭 雪， 李光偉， 等. 鈣敏感受體和多胺代謝紊亂在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用及其相關(guān)機(jī)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(8):1524.

[12] Ayala P, Montenegro J, Vivar R, et al. Attenuation of endoplasmic reticulum stress using the chemical chaperone 4-phenylbutyric acid prevents cardiac fibrosis induced by isoproterenol[J]. Exp Mol Pathol, 2012, 92(1):97-104.

[13] Park CS, Cha H, Kwon EJ, et al. The chemical chape-rone 4-phenylbutyric acid attenuates pressure-overload cardiac hypertrophy by alleviating endoplasmie reticulum stress[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421(3):578-584．

[14] Takada A, Miki T, Kuno A, et al. Role of ER stress in ventricular contractile dysfunction in type 2 diabetes[J]. PLoS One, 2012, 7(6):e39893．

[15] Koyama M, Furuhashi M, Ishimura S, et al. Reduction of endoplasmic reticulum stress by 4-phenylbutyric acid prevents the development of hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014, 306(9):1314-1323.

[16] 黃小平， 王 蓓， 邱詠園， 等. 黃芪甲苷和三七的主要有效成分配伍對(duì)小鼠腦缺血再灌注后腦組織能量代謝的影響[J]. 中草藥, 2014, 45(2):220-226.

[17] 裴建梅， 賀 瑜， 朱邦豪. 丹參川芎嗪注射液對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷腦基底平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2016, 32(7):618-621.

[18] 朱 俐， 石仲瑗， 吳小梅， 等. 人參銀杏合劑對(duì)抗大鼠腦急性低氧損傷的作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2004, 9(9):1041-1044.

[19] Yousefi H, Ahmadiasl N, Alihemmati A, et al. Effect of renal ischemia-reperfusion on lung injury and inflammatory responses in male rat[J]. Iran J Basic Med Sci, 2014, 17(10):802-807.

[20] Wu H, Tang Q, Yang J, et al. Atorvastain ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury through attenuation of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(12):4915-4923.

[21] Ye Z, Wang N, Xia P, et al. Parecoxib suppresses CHOP and Foxo1 nuclear translocation, but increases GRP78 le-vels in a rat model of focal ischemia[J]. Neurochem Res, 2013, 38(4):686-693.

[22] Bogoyevitch MA, Ngoei KR, Zhao TT, et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling: recent advances and challenges[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(3):463-475.

[23] Ishii M, Suzuki Y, Takeshita K, et al . Inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs[J]. J Immunol, 2004, 172(4):2569-2577.

[24] 邱曉曉， 戴雍月， 宋張娟， 等. SP600125對(duì)大鼠肺缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J] . 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2012, 28(3):255-258, 292.

[25] Poone GK, Hasseldam H, Munkholm N, et al. The hypothermic influence on CHOP and Ero1-α in an endoplasmic reticulum stress model of cerebral ischemia[J]. Brain Sci, 2015, 5(2):178-187.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

ProtectiveeffectofYiqi-Wenyang-Huoxue-HuatanformulaonHHPHratbrainbysuppressingexcessiveendoplasmicreticulumstress

XIANG Bing-qian1, GAO Hui1, JIN Xiao-jie1, DAI Yong-yue1, QIAN Xiao-ying3, CHEN Xi-wen2, WANG Wan-tie1

(1InstituteofIschemia/ReperfusionInjuryResearch,2AnimalExperimentCenter,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;3DepartmentofRespiratoryMedicine,WenzhouPeople’sHospital,Wenzhou325000,China.E-mail:wwt@wmu.edu.cn)

AIM: To investigate whether Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula (YWHHF) attenuats brain injury induced by hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension (HHPH) in the rats by inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress response.METHODSHealthy SPF male SD rats (n=50) were randomly divided into 5 groups: control group, hypoxia-hypercapnia group, low-dose YWHHF group, middle-dose YWHHF group and high-dose YWHHF group. The rats in control group lived in normal environment, while the rats in other 4 groups were raised for 4 weeks in oxygen tank with low oxygen concentration and high CO2concentration. YWHHF was perfused in the rats of low-, middle- and high-dose groups at 0.15, 0.3 and 0.6 g/kg daily, respectively. The rats in hypoxia-hypercapnia group were given isometric distilled water. The surgery was performed on the rats after 4 weeks, and the brain and lung tissues were quickly collected to detect brain water content and observe the morphological changes after mean pulmonary artery pressure recording and heart perfusion. The caspase-3 activity and the apoptotic index of the brain cells were determined. The expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK), caspase-12, C/EBP homologous protein (CHOP) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at protein and mRNA levels in brain tissues was detected by Western blot and RT-PCR.RESULTSCompared with control group, mean pulmonary artery pressure, brain water content, brain apoptotic index, caspase-3 activity, and the protein and mRNA levels of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in the rest 4 groups were increased, and the brain and lung tissues had obvious damage under light microscope. Compared with hypoxia-hypercapnia group, mean pulmonary artery pressure, brain water content, brain apoptotic index， caspase-3 activity, and the protein and mRNA expression of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in low-, middle- and high-dose YWHHF groups were decreased, and the pathological damage of the brain and lung tissues was obviously reduced under light microscope. These changes in middle-dose YWHHF group were the most significant.CONCLUSIONYWHHF effectively relieves the brain injury induced by HHPH in rats, which may be associated with inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress response.

Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula; Hypoxia； Hypercapnia; Pulmonary hypertension; Brain; Endoplasmic reticulum stress

R285.5； R544.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.005

1000- 4718(2017)10- 1759- 09

2017- 03- 30

2017- 06- 05

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No. 2018ZZ018); 溫州市高層次人才創(chuàng)新技術(shù)重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No. 2016-07)

△通訊作者 陳錫文 Tel: 0577-86689827; E-mail: wzqxy31et@126.com; 王萬(wàn)鐵 Tel: 0577-86689817； E-mail： wwt@wmu.edu.cn

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net